שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לגדל תאי Caco-2 במעי בתלת מימד ולהדגים את השימוש בתא Ussing במחקרים על ויסות טרנספורטר סרוטונין. השיטות המוצגות כאן יכולות לענות על שאלות מפתח בתחום הובלת האפיתל, כגון כיצד מווסת טרנספורטר סרוטונין במעי, SERT. היתרון העיקרי של ה-Caco-2 התלת-ממדי הוא שהם משקפים אינטראקציות מטריצה בין תא לתא ותא לחוץ-תא בצורה מדויקת יותר מאשר חד-שכבות.

וטכניקת תא Ussing מאפשרת מדידות מדויקות של תפקוד ההובלה באפיתל המעי. ההשלכה של תלת מימד, תרבויות הקאקו משתרעת לקראת גילוי טיפולים מכיוון שמודלים אלה מאפשרים סינון של חומרים כנגד מחלות הקשורות לתפקוד תחבורה משתנה. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי ויסות טרנספורטר סרוטונין, ניתן ליישם אותה גם במחקרים של מובילי אלקטרוליטים אחרים כגון נתרן וכלוריד.

הדגמה חזותית של טכניקות אלה היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד הפשטת השכבה הסרו-שרירית והרכבה של רירית המעי בתאי אוסינג. ידגימו את נהלי תאי Caco-2 התלת-ממדיים אישיטה צ'טרג'י, מדריכה, ואנופ קומאר, פוסט-דוקטורנט מהקבוצה שלנו. מי שתדגים את הפשטת השכבה הסרו-שרירית מאילאום העכבר תהיה סנג'יטה טיאגי, מומחית מחקר בכירה מהמעבדה שלי.

כמו כן, ידגימו את ההרכבה של רירית מופשטת והכנסתם לתאי אוסינג יהיו שובהה פריאמוואדה ואריברסו נטראג'אן, מדריכים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש להפשיר את תמיסת החלבון הג'לטיני המופחתת של גורם הגדילה למשך הלילה על קרח במקרר של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, הכינו מיליליטר אחד, או 500 מיקרוליטר אליקוטים.

ביום התרבות, קררו מראש את המגלשות על הקרח. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר מתמיסת החלבון הג'לטיני לכל באר של שקופית הזכוכית בעלת שמונה הבארות ופזר אותה באופן שווה. בזמן ציפוי התערובת הג'לטינית בשקופית החדר או בצלחות, יש להקפיד על מניעת היווצרות בועות מכיוון שהתאים עלולים להתנתק.

מניחים את המנה המתורבתת בתוך חממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות כדי לאפשר לתמיסה להתמצק. לאחר מכן, באמצעות טריפסין, נתק תאי Caco-2 מתכנסים מבקבוק תרבית. לאחר מכן, ספרו את התאים בהמוציטומטר וצנטריפוגו אותם ב-500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

השעו מחדש את גלולת התא המתקבלת במדיום Caco-2 תלת מימדי כדי להשיג את ההשעיה של הצפיפות הרצויה. בעזרת תרחיף התאים המוכן, זרע 4,000 תאים לבאר על תא הזכוכית מחליק ואפשר להם לגדול במשך 12 עד 14 יום בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס. כדי להכתים את התאים, יש לשאוף תחילה את המדיום ולתקן את התאים ב -400 מיקרוליטר של 2% PFA.

המשך לתקן את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים פעמיים ב- PBS, יש לחדור אותם בתמיסת טריטון של 0.5% ב- PBS למשך לא יותר מ -15 דקות. שטפו את התאים פעמיים במאגר גליצין PBS ולאחר מכן שטפו את התאים החדירים במאגר IF למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

חסום את התאים באמצעות סרום עזים רגיל של 5% במאגר IF. לאחר מכן, דגרו על התאים עם 200 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים במאגר IF בתוספת סרום עזים של 1% למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף תאים שלוש פעמים עם מאגר IF.

דגירה של תאים שטופים עם 200 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל במאגר IF בתוספת סרום עיזים 1% למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו תאים עם מאגר IF שלוש פעמים למשך עשר דקות. כדי לנתק את התא עבור מגלשת הזכוכית, הנח תחילה את המגלשה במחזיק בסיס המגלשה, ולאחר מכן החלק את המרים הלבן דרך המחזיק עד שהוא נוגע בקצה הבארות.

משוך בעדינות את החדר כדי להסיר אותו מהמגלשה. השתמש בקופסה שחורה מכוסה כדי להגן על המגלשות מפני אור. הרכיבו את המגלשות במדיום איטי נגד דהייה וכסו אותן בהחלקות כיסוי.

לאחר שאפשרתם לשקופיות להתייבש במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, אטמו אותן עם לק לפני ההדמיה. בודד את אילאום העכבר לפי ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בעזרת מספריים, פתח את המעי לאורך.

דגרו את קטע הרקמה שנוצר במאגר KBR המכיל אינדומתצין מיקרו-מולרי אחד למשך עשר דקות. הצמד קטע מעי באורך של כסנטימטר אחד, הצד הרירי כלפי מטה, לצלחת המכילה 7% אגרוז בעובי 0.5 ס"מ או אלסטומר סיליקון מרפא. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו דיסקציה עם תאורה תחתונה, הפשיטו את השכבות הסרו-שריריות.

לאחר מכן, חותכים את השכבה הסרו-שרירית בעזרת להב אזמל נוצות. השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים את קצה השכבה לאורך ציר האורך של המעי. לבסוף, הרכיב את הרירית בזהירות על סיכות המחוון.

החזק את רקמת הרירית המופשטת בקצוות כדי למנוע קריעה. בעת הרכבת הרירית האיליאלית המופשטת על סיכות המחוון, יש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע קריעת הרקמה בראשי הסיכות וכדי למזער את הנזק לקצוות הרקמה. לפני הטיפול ברקמות, הכינו תמיסת קרבס בגז עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, שפכו את התמיסה לתא אוסינג. הוסף 10 מיקרו-טוחנות גלוקוז כמצע האנרגיה לאמבט הסרוזל ו-10 מניטול מיקרו-מולרי לשמירה על איזון אוסמוטי לאמבטיה הרירית. לאחר מכן, הכנס את המחוון עם הרירית המותקנת לתוך החדר כדי לחשוף הן את הצד האפיקלי והן את הצד הבסיסי של הרקמה לתמיסת קרבס.

מאזנים את הרקמה האילאלית באמבטיה למשך עשר דקות. לאחר מכן, טפל מראש בצד האפיקלי עם 10 פלואוקסטין מיקרו-מולרי למשך 30 דקות למדידת השטף הרירי לסרוזלי. בסופו של דבר, טפלו בצד הבסיסי של הרקמה עם 10 ננוגרם למיליליטר TGF beta 1 למשך שעה, ולאחר מכן דגרו על הצד האפיקלי עם 20 ננו-מולרי 5-HT למשך 30 דקות.

כדי לחשב את שיעורי השטף הרירי לסרוזלי, אסוף 0.75 מיליליטר aliquots ממאגר הסרוזל, והחלף אותם בנפחים זהים של מדיום האמבטיה כדי למנוע הפרשי לחץ הידרוסטטיים על פני הרירית. כדי לכמת את ה-5-HT הטריטי שהצטבר ברקמה, הסר את הרירית מהמחוון. שטפו אותו פעם אחת עם מאגר KRB קר כקרח והניחו אותו בצינור תרבית זכוכית.

דגרו על הרירית ב-0.5 מיליליטר של 10% KOH למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כדי ליז את הרקמה. לאחר מכן, מדוד את הרדיואקטיביות ב-150 מיקרוליטר של הליזטים בשלוש עותקים באמצעות מונה נצנוץ נוזלי. בשיטת ברדפורד, מדוד את ריכוז החלבון בשלוש עד חמש אליקוטות מיקרוליטר של הליזטים.

מוצגים כאן ציסטות Caco-2 שגדלו בתרבית תלת מימדית מוכתמות לאקטין וציסטות תלת מימד Caco-2 צבועות בו זמנית עבור אקטין, גרעינים וחלבון SERT. SERT נראה בקרום הלומינלי ובתאים תת-אפיקליים. כדי לאשר עוד יותר את היתרון של כדורי Caco-2 תלת מימדיים על פני חד-שכבות Caco-2 דו-ממדיות, בוצע ניתוח כתמים מערביים של ביטוי חלבון SERT.

התוצאות הראו ביטוי משופר של חלבון SERT בכדורי Caco-2 3D בהשוואה לתאי Caco-2 דו-ממדיים. לבסוף, נעשה שימוש במערכת תא Ussing כדי להראות ש-TGF beta מגביר את השטף הרירי לסרוזלי, ומשקף ספיגה מוגברת של 5-HT מהממברנה הלומינלית והצטברות מוגברת של 5-HT שנצפתה ברירית האילאלית. ממצאים כאלה נתמכים על ידי הרגישות הנצפית של ספיגת 5-HT לטיפול בפלואוקסטין התואמת לביטוי SERT על הממברנה הלומינלית.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו של הפשטה והרכבה של רירית האיליאלית תוך 15 דקות. בעת אימוץ הליך זה, חשוב לזכור שעם הוצאתו מבעל החיים, לתכשיר המעיים החוץ-חיים יש כדאיות מוגבלת והוא עשוי להימשך עד שלוש שעות. ניתן להשתמש בציסטות Caco-2 תלת מימדיות למחקרים שונים כגון אירועי סחר בממברנה, ביטוי גנים או אינטראקציה בין חלבון לחלבון של מובילי אפיתל.

לאחר פיתוחה, טכניקת Caco-2 התלת-ממדית סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הובלת המעיים לחקור את תנועת הנוזלים ולחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות דריאליות. אל תשכח שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בציוד הגנה אישי ונהלי טיהור נאותים. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכל לגדל תאי Caco-2 בתרביות תלת מימד ולהשתמש בתרביות אלה כדי לחקור את ביטוי טרנספורטר האפיתל.

תוכל גם להשתמש בתא אוסינג כדי לחקור את תפקוד הובלת הסרוטונין במעי העכבר המקומי.