שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לגדל תאי מעי Caco-2 בתלת-ממד ולהדגים את השימוש בתא Ussing במחקרים על ויסות של נשא סרוטונין. השיטות המוצגות כאן יכולות להשיב על שאלות מפתח בתחום ההסעה האפיתליאלית, כגון האופן שבו נשא הסרוטונין במעי, SERT, מוסדר. היתרון העיקרי של תאי Caco-2 בתלת-ממד הוא שהם משקפים אינטראקציות בין תאים ובין תאים למטריקס extracelluar באופן מדויק יותר מאשר שכבות Ein-layer (מונולייר).

טכניקת תא Ussing מאפשרת מדידות מדויקות של תפקוד התובלה באפיתל המעי. המשמעות של תרביות Caco בתלת-ממד משתרעת עד לגילוי תרופות, מכיוון שדגמים אלו מאפשרים סריקה של חומרים נגד מחלות הקשורות לתפקוד תובלה משובש. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי ויסות נשאי סרוטונין, ניתן ליישמה גם במחקרים של נשאי אלקטרוליטים אחרים, כגון נתרן וכלור.

הדגמה חזותית של טכניקות אלו היא קריטית, שכן הסרת השכבה הסרו-מוסקולרית והרכבת הרירית של המעי בתאי Ussing הן פעולות הקשות ללמידה. את נהלי תאי Caco-2 בתלת-ממד ידגימו Ishita Chatterjee, מרצה, ו-Anoop Kumar, עמית פוסט-דוקטורט מהקבוצה שלנו. את הסרת השכבה הסרו-מוסקולרית מהמעי הדק (ileum) של עכבר תדגים Sangeeta Tyagi, מומחית מחקר בכירה מהמעבדה שלי.

שובא פריאםוואדה ואריוואראסו נאטאראג'אן, מדריכים מהמעבדה שלי, ידגימו בנוסף את קיבוע הרירית שהוסרה והחדרתה לתאי Ussing. לתחילת הפעולה, הפשיר את התמיסה של חלבון ג'לטיני עם רמות מופחתות של גורמי גדילה במהלך הלילה על קרח במקרר בטמפרטורה של 4°C. לאחר ההפשרה, הכן מנות של 1 mL או 500 µL.

ביום התרבית, קהלו את השקופיות עם התאים (chambered slides) על קרח. לאחר מכן, הוסיפו 30 µL של תמיסת החלבון הג'לטיני לכל באער של השקופית עם שמונה התאים ופזרו אותה באופן שווה. בעת דגימת תערובת הג'לטין לשקופית או לצלחות, יש להיזהר ממניעת היווצרות בועות, שכן התאים עלולים להינתק.

הניחו את הצלחת בתרבית בתוך אינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 עד 30 דקות כדי לאפשר לתמיסה להתמצק. לאחר מכן, השתמשו ב-trypsin כדי להפריד תאי Caco-2 שהגיעו למצב confluent מבקבוק תרבית. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות hemocytometer וסובבו אותם בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.

שHש את משקע התאים שהתקבל בתוך מצע 3D Caco-2 כדי להגיע לצפיפות התליה הרצויה. באמצעות תחילת התליה של התאים שהוכנה, זרע 4,000 תאים לבאר על גבי שקופיות תאי התא (chamber slides) מזכוכית, ואפשר להם לגדול במשך 12 עד 14 ימים באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כדי לצבוע את התאים, שאב תחילה את המצע וקבע את התאים באמצעות 400 microliters של 2%PFA.

המשיכו בקיבוע התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים פעמיים ב-PBS, בצעו פרמיאביליזציה באמצעות תמיסת 0.5% Triton ב-PBS למשך לא יותר מ-15 דקות. שטפו את התאים פעמיים בבאפר PBS glycine ולאחר מכן שטפו את התאים לאחר הפרמיאביליזציה בבאפר IF למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

חסמו את התאים באמצעות 5% normal goat serum בתוך IF buffer. לאחר מכן, דגרו את התאים עם 200 microliters של נוגדן ראשוני המדולל ב-IF buffer בתוספת 1% goat serum למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-IF buffer.

דגרו תאים שטופים עם 200 µL של נוגדן שני המדולל בבופר IF בתוספת 1% goat serum למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים עם בופר IF שלוש פעמים, בכל פעם למשך עשר דקות. כדי להסיר את התא מהשקף, הניחו תחילה את השקף במחזיק השקפים, ולאחר מכן החליקו את המרימה הלבנה דרך המחזיק עד שתבוא במגע עם קצוות הבארים.

משוך בעדינות את התא כדי להסירה מהשקף. השתמש בקופסה שחורה סגורה כדי להגן על השקפים מאור. הרכב את השקפים עם מדיום איטי למניעת דהייה (slow anti-fade medium) וכסה אותם בכיסויי זכוכית.

לאחר ייבוש השקופיות למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, אטמו אותן בעזרת לק לפני הדמיה. בודדו את ה-ileum של העכבר בהתאם לנוהל המתואר בטקסט. לאחר מכן, פתחו את המעי לאורכו באמצעות מספריים.

דגרו את נתח הרקמה שהתקבל בבופר gassing KBR קר בקרח המכיל 1 µM indomethacin למשך עשר דקות. הצמידו בעזרת סיכות נתח מעי באורך של כסנטימטר אחד, כאשר הצד הרירי פונה כלפי מטה, ללוח המכיל 7% agarose או אלסטומר סיליקון מתושב בעובי של 0.5 סנטימטר. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לדיסקציה עם תאורה תחתונה, הסִירו את השכבות הסרו-מוסקולריות.

לאחר מכן, חתכו את השכבה הסרו-מוסקולרית (seromuscular layer) באמצעות להב סכין נוצה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים את קצה השכבה לאורך הציר האורכי של המעי. לבסוף, הצמידו בזהירות את הרירית לסיכות של המחושק.

אחז את רקמת הרירית שהוסרה בקצוות כדי למנוע קרע. בעת קיבוע הרירית האילאלית שהוסרה על סיכות השקף, יש לנקוט באמצעים למניעת קרע ברקמה בראשי הסיכות ולצמצום הנזק לקצוות הרקמה. לפני הטיפול ברקמה, הכן תמיסת Krebs המגובסת ב-95%oxygen ו-5%carbon dioxide.

לאחר מכן, שפכו את התמיסה אל תוך תא Ussing. הוסיפו 10 micromolars גלוקוז כסובסטרט אנרגיה לאמבט הסרוזלי, ו-10 micromolar מניטול לשמירה על איזון אוסמוטי לאמבט המוקוזלי. לאחר מכן, הכניסו את המחולק עם הרירית המורכבת אל התא כדי לחשוף הן את הצד האפיקלי והן את הצד הבסולטרלי של הרקמה לתמיסת Krebs.

השגה שיווי משקל של רקמת האילי באמבט למשך עשר דקות. לאחר מכן, בצע טיפול מקדימ בקו האפיקלי עם 10 micromolar fluoxetine למשך 30 דקות לצורך מדידת השבץ (flux) מהרירית לסרוזה. לבסוף, טפל בצד הבזולטרלי של הרקמה ב-10 nanograms per milliliter TGF beta 1 למשך שעה אחת, ולאחר מכן הדגר את הצד האפיקלי עם 20 nanomolar tritiated 5-HT למשך 30 דקות.

כדי לחשב את קצבי הזרם מהרירית לסרוזה, אספו מנות של 0.75 milliliter מהמאגר הסרוזלי, והחליפו אותן בנפחים זהים של תמיסת האמבט כדי למנוע הבדלי לחץ הידרוסטטי לאורך הרירית. כדי לכמת את ה-5-HT המסומן בטריטיום שהצטבר ברקמה, הוציאו את הרירית מהממסטר (slider). שטפו אותה פעם אחת עם בופר KRB קר מאוד והניחו אותה במבחנת תרבית מזכוכית.

דגרו את הרירית ב-0.5 milliliters של 10%KOH למשך לילה ב-37 degrees Celsius כדי לבלוע את הרקמה. לאחר מכן, מדדו את הרדיואקטיביות במנות של 150 microliter מהליזטים בשלוש חזרות באמצעות מונה סינרילציה נזיל. באמצעות שיטת Bradford, מדדו את ריכוז החלבון במנות של שלושה עד חמישה microliter מהליזטים.

מוצגים כאן ציסטות Caco-2 שגודלו בתרבית תלת-ממדית וצבעו לאקטין, וכן ציסטות Caco-2 תלת-ממדיות שצבעו בו-זמנית לאקטין, לגרעינים ולחלבון SERT. SERT נראה בממברנה הלומנלית ובמדורים סוב-אפיקליים. כדי לאשר עוד יותר את היתרון של כדורי Caco-2 תלת-ממדיים על פני שכבות מונו-שכבה דו-ממדיות של Caco-2, בוצע ניתוח western blot של ביטוי חלבון SERT.

התוצאות הראו ביטוי מוגבר של חלבון SERT בספירות תלת-ממדיות של תאי Caco-2 בהשוואה לתאי Caco-2 דו-ממדיים. לבסוף, נעשה שימוש במערכת תאי Ussing כדי להראות כי TGF beta מגביר את השטף מהצד הרירי לצד הסרוזלי, מה שמשקף עלייה בספיגת 5-HT מהממברנה הלומנלית והצטברות מוגברת של 5-HT שנצפתה ברירית האילאום. ממצאים אלו נתמכים על ידי הרגישות שנצפתה של ספיגת 5-HT לטיפול ב-fluoxetine, התואמת את ביטוי SERT על הממברנה הלומנלית.

ברגע ששולטים בטכניקה זו של קילוף והרכבה של רירית האילאום, ניתן להשלימה תוך 15 דקות. בעת אימוץ פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי לאחר ההוצאה מהבעל החיים, להכנה המעיית מחוץ לגוף יש חיוניות מוגבלת והיא עשויה להישמר למשך עד שלוש שעות. ניתן להשתמש בציסטות Caco-2 תלת-ממדיות למחקרים שונים, כגון אירועי תעתוע של ממברנות, ביטוי גנים או אינטראקציה בין חלבונים של נשאי אפיתל.

לאחר פיתוחה, טכניקת Caco-2 בתלת-ממד סוללה את הדרך לחוקרים בתחום התובלה המעיית לחקור תנועת נוזלים וללמוד את הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים. זכרו כי עבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש ב-PPE וביצוע נהלי דה-קונטמינציה מתאימים. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לגדל תאי Caco-2 בתרביות תלת-ממדיות ולהשתמש בתרביות אלו כדי לחקור ביטוי של נשאי אפיתליום.

תוכלו להשתמש בתא אוסינג (Ussing chamber) גם כדי לחקור את תפקוד הטרנספורט של סרוטונין במעי עכבר טבעי.