פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

המטרה הכוללת של פלטפורמת המערך המיקרוסקופי של תאים (cell microarray) זו היא לבצע קורלציה בין מדידות של התמיינות תאים לבין כוחות מתיחה (traction forces) כפונקציה של ההקשר המיקרו-סביבתי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, ובכך לאפשר הן מחקרים בסיסיים בביולוגיה של תאי גזע והן אופטימיזציה של פרוטוקולי התמיינות. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו כוללים את התפוקה הגבוהה שלה, היכולת לשנות רמזים ביוכימיים וביופיזיקליים, וקבלת תוצאות סופיות באמצעות אימונופלואורסנציה ומיקרוסקופיית כוחות מתיחה, או TFM.

למרות שהשתמשנו בשיטה זו כדי להבין את הדיפרנציאציה של תאי אב של הכבד, ניתן ליישמה בקלות גם על סוגים אחרים של תאי עורקים ובהקשרי רקמה שונים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן ההצלחה הניסויית תלויה בשילוב של פרוטוקול סידור המערך הן עם תשתיות הידרוג'ל באיכות גבוהה והן עם מיקרוסקופיית כוח מתיחה (TFM). כדי לייצר הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד המכילים חרוזי פלואורסצנציה על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית של 35 mm שעברה סילניזציה, לצורך הערכה חיה של אינטראקציות בין תאים לתשתית באמצעות TFM, הכינו תחילה את תשתיות הזכוכית בתמיסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

הניחו צלחות פטרי עם תחתית זכוכית בקוטר 35 mm שעברו סילניזציה בתבנית ייבוש מזכוכית, וטפטפו באמצעות פיפטה 20 µL של תמיסת חרוזי פרה-פולימר ופוטו-איניציאטור ביחס של 9:1 למרכז כל צלחת. כסו בעדינות כל צלחת באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip) עגול בקוטר 12 mm, תוך הימנעות מיצירת בועות. כדי לפזר את החרוזים הפלורסצנטיים על פני השטח של ההידרוג'ל, הפכו את הצלחות והשאירו אותן בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

בעוד הצלחת נותרת הפוכה, חשף אותה ל-UVA באורך גל של 365 nanometer למשך 10 דקות. בצע אופטימיזציה לזמן הפולימריזציה במידת הצורך. לאחר מכן, טבול את ההידרוג'לים בבופר HEPES בריכוז 1 molar והשאר אותם בטמפרטורת החדר בחשיכה למשך הלילה.

הסר את לוחות הכיסוי בזהירות באמצעות תער, תוך הקפדה לא לפגוע בהידרוגלים הפולימריים. ייבש את ההידרוגלים בטמפרטורה של 50 °C על פלטה מחממת עד לייבוש מלא. ניתן לאחסן את ההידרוגלים בטמפרטורת החדר בחושך למשך שלושה חודשים.

הכינו באפרים להדפסת הביומולקולות ועבור פלטת המקור כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר טעינת הפינים הנקיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הכינו את מכשיר המיקרו-מערך (microarrayer) ותכנתו באמצעות תוכנת היצרן. לאחר מכן, הפעילו את יחידת הלחות.

כווננו את נקודת העיגון ל-65% relative humidity והמתינו עד שהריאומטר יגיע לערך זה. הניחו את לוח המקור במתאם המתאים. לאחר מכן, הניחו את תשתיות ההידרוג'ל המיובשות במתאם המתאים.

כווננו את פרמטרי התוכנה כדי לשקף במדויק את פריסת לוח המקור, את תכנון המערך ואת הפורמט הרצוי. התחילו את ייצור המערך. בדקו בתדירות של לפחות פעם בשעה שהלחות לא ירדה מתחת ל-65% relative humidity ושהפינים אינם סתומים.

אם הלחות ירדה באופן בלתי צפוי, הפסיקו את תהליך סידור המערכים (arraying) כדי למלא את המלחח ולנקות את הצינורות הקשורים מעיבוי. אם הפינים סתומים, הפסיקו את סידור המערכים כדי לנקות את הפינים או להחליפם בפינים שננקו מראש. עם השלמת התוכנית, הניחו את המערכים המיוצרים בקופסת סליידים או במיקרו-פלטה מכוסה בנייר אלומיניום.

השאירו את המערכים בטמפרטורת החדר בלחות יחסית של 65% למשך הלילה. מניסיוננו, הקשיים הנפוצים ביותר קשורים לייצור המערכים. אנו ממליצים לאשר את האיכות הטכנית ואת העמידות של המערכים המיוצרים באמצעות מולקולות מסומנות פלואורסצנטית, צביעות חלבון כלליות וצביעות אימונופלואורסצנטיות.

ביום שלאחר הייצור, טבול את צלחות הפטרי של המערך בגודל 35 mm ב-3 mL של 1%v/v penicillin-streptomycin ב-PVS. חשף את המצעים המסודרים במערך ל-UVC למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את תמיסת ה-penicillin-streptomycin במצע לתרבית תאים.

לאחר איסוף וספירה של התאים, זרע את התאים על המערכים בריכוז של 3 mL לכל צלחת פטרי של 35 mm. דגור את תרביות המערך בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך שעתיים עד 24 שעות, או עד להיווצרות של איים תאיים מאוכלסים היטב. ניתן להתאים את צפיפות הזריעה ואת משך הזמן בהתאם לסוג התאים וליישום הספציפי.

לאחר מתן זמן להיווצרות איים של תאים, שטפו את תרביות המערך פעמיים עם 3 mL של מצע גידול תאים שחומם מראש. בשלב זה, ניתן להוסיף למערכת הביולוגית את הביקורות המתאימות ואת הטיפולים הרצויים. החליפו את המצע במערכים אחת עד פעמיים ביום כדי לשמור על ריכוז הטיפולים.

בתוך יום עד חמישה ימים מרגע תחילת תרביות המערך, בצע הערכה חיה של אינטראקציות בין התאים לתשתיות באמצעות TFM. העבר את צלחות הפטרי בנפח 35 mm המכילות את תרביות המערך למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בעל אינקובטור ובמה רובוטית לצורך מדידות TFM. בצלחת אחת, סמן את המיקומים ואת מישורי המיקוד של איים תאיים בודדים באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה.

עברו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתחום האדום הרחוק (far red) כדי להדמיות את החרו지를. לאחר מכן, חזרו לכל אחת מהמיקומים שנשמרו בשלב הקודם ותקנו את קואורדינטת ה-z של מישור המיקוד, כך שרק השכבה הראשונה של החרו지를 שמתחת לאי התאים תהיה במיקוד. שמרו את הקואורדינטות החדשות והמשיכו להדמיה אוטומטית של כל אי התאים כדי ללכוד את תמונות הניגודיות של הפאזה (phase contrast) והתמונות הפלואורסצנטיות באדום הרחוק משלב טרום-ההפרדה.

בשלב הבא, יש להוסיף בזהירות 150 µL של תמיסת BSA/SDS לצלוחית ולהמתין חמש דקות כדי לאפשר התנתקות מלאה של התאים מהמצע. יש לעקוב אחר התנתקות התאים באמצעות מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast). לאחר שהאיים התאיים התנתקו מהמצע, חזרו לעמדות המסומנות ובדקו כי השכבה הראשונה של החרוזיים עדיין נמצאת במיקוד.

אם חרוצים אלו נמצאים מחוץ למישור עקב דפורמציה הנגרמת על ידי כוחות מתיחה של התאים, תקנו את קואורדינטת ה-z של המישור הממוקד כך שהם יהיו שוב במיקוד. שמרו את קואורדינטות ה-z המתוקנות וחזרו על הדמיון האוטומטי של כל האיים כדי ללכוד את תמונות הפלואורסצנציה באורך גל אדום-רחוק לאחר הדיסוציאציה. חזרו על שלבים אלו עבור שאר הצלחות הפטרי.

ליגנדים של Notch, מסוג Jagged 1 ו-Delta-like 1, המצומדים ל-Protein A/G, הראו שימור משופר בתוך הידרוגלים. הצגת ליגנדים של Notch הובילה גם לדפרנציאציה של תאי אב של הכבד לעבר גורל תאי של צינורות מרה, כפי שהתבטא בנוכחות של סמן ירוק לתאי צינורות מרה. התגובה לליגנדים של Notch נמדדה עבור חמישה חלבונים של מטריקס חוץ-תאי (ECM), והראתה כי תגובת תאי האב של הכבד לליגנדים תלויה בהקשר של ה-ECM.

השתמשו בהשתקה באמצעות RNA בעלת מבנה סיכה קטנה (small hairpin RNA) כדי ליצור תאי אב ללא הליגנדים delta like one ו-jagged one. לאחר מכן, התאים נחשפו לליגנדים של notch: jagged one, delta like one ו-delta like four. התגובה למערך ליגנדים של notch השתנתה בהתאם לביטוי התאי-פנימי של כל אחד מהליגנדים.

תמונות אלו מראות כי הדיפרנציאציה של תאי אב של הכבד תלויה הן בקשיחות התשתית והן בהרכב ה-ECM. ניתוח כמותי גילה שקולגן ארבע תומך בדיפרנציאציה הן על תשתית רכה והן על תשתית קשיחה, בעוד שפיברונקטין תומך בדיפרנציאציה רק על תשתית קשיחה. מפות חום מייצגות מצביעות על כך שמאמץ משיכה מתמשך בקשיחות תשתית נמוכה על קולגן ארבע מקדם דיפרנציאציה לתאי צינורות מרה.

ממצא זה אושש באמצעות כימות של ערכי השורש הממוצע של הריבועים (root mean square) של מאמצי המשיכה. סרטון זה והפרוטוקול הנלווה סיפקו את השלבים העיקריים לייצור הידרוג'לים ומערכים לביצוע תרבית תאים על המצעים המסודרים, ולמדידת אינטראקציות בין תאים למצע באמצעות מיקרוסקופיית כוחות משיכה (traction force microscopy). לאחר הכרות עם הטכניקות, ניתן להשלים כל ניסוי תוך שבוע עד שבועיים בלבד, במידה והוא מבוצע כראוי.

בשלב הבא לשיטה זו, יש להשתמש בתרביות תאים כדי לתקף תנאי מערך שקיבלו ניקוד גבוה באמצעות qualitative PCR, אימונו-בלוטינג (immuno blotting), צירי מכנobiology בקנה מידה סטנדרטי או טכניקות ביולוגיה מולקולרית משלימות אחרות. פלטפורמה רב-גונית זו יכולה להיות מיושמת לחקירה בייצור המוני (high throughput) של תפקודי תאים במגוון רחב של הקשרי תאים ורקמות, כולל התמיינות תאי גזע וביולוגיה של תאי סרטן.