איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR
27 ביוני 2017
כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר ולזהות בהצלחה miRNAs בקרום הצפק של החולדה. כדי להתחיל בהליך זה, לאחר הרדמה באינהלציה עם 4% איזופלורן. רססו את עור הבטן של החולדה באתנול 70% והרכיבו אותו על יריעת השעם, על גבה.
לאחר מכן בצע חתך אורכי בעור הבטן, השריר וקרום הצפק של החיה באמצעות מספריים ומלקחיים. הרם את קרום הצפק באמצעות המלקחיים ובצע חתכים אופקיים בחלקו העליון לאורך עצם הצלע התחתונה מתחת לסרעפת. ועל הצד התחתון שלו באזור הצדדי באמצעות המספריים הכירורגיים.
לאחר מכן, בצע חתכים אורכיים לרוחב כדי להסיר את קרום הצפק מהגוף, בעזרת המספריים הכירורגיים. ואז שוטפים אותו עם PPS בצלחת פטרי. גזרו וחתכו 20 מיליגרם של דגימת קרום הצפק.
בהליך זה, הנח דגימת ממברנה צפקית של 20 מיליגרם לתוך הומוגנייזר זכוכית. ולהוסיף 700 מיקרוליטר מגיב ליזה מבוסס פנול גואנידין. לאחר מכן, הומוגניזציה של דגימת הממברנה הצפקית על קרח, על ידי האטת לחיצת עלי על הדגימה עם פיתול.
חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים, עד שדגימת הממברנה הצפק התמוססה לחלוטין לתוך מגיב הליזיס המבוסס על פנול גואנידין. להומוגניזציה נוספת, העבירו את הליזט ההומוגני למערכת גריסה ביו-פולימרית בעמודת הספין של המיקרו צנטריפוגה בצינור איסוף של שני מיליליטר. ואז צנטריפוגה אותו ב -14, 000 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, העבירו את הליזאט ההומוגני לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. הוסף 140 מיקרוליטר כלורופורם לליזט ההומוגני וכסה את הצינור היטב. לאחר מכן, מערבבים את הצינור בהיפוך למשך 15 שניות.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותו ב-12,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 300 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש, מבלי להפריע למשקעים.
ולהוסיף 450 מיקרו ליטר של 100% אתנול. לאחר מכן מערבבים את הדגימה על ידי מערבולת למשך חמש שניות. לאחר מכן פיפטה עד 700 מיקרו ליטר מהדגימה לתוך עמוד ספין מבוסס קרום סיליקון, מונח בצינור איסוף של שני מיליליטר, וסגור את המכסה.
ואז צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף. לאחר מכן הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1, לעמוד הסיבוב המבוסס על קרום הסיליקון כדי לשטוף בקפדנות את הדגימה ולסגור את המכסה.
צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה 2, לעמוד הסיבוב המבוסס על קרום הסיליקה, כדי להסיר כל זכר למלח, וסגור את המכסה.
ואז צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה ואת צינור האיסוף וחזרו על הליך זה שוב. לאחר מכן, צנטריפוגה את עמודת הספין המבוססת על קרום הסיליקה שוב ב -15, 000 פעמים G למשך דקה אחת.
לאחר הצנטריפוגה, השליכו את צינור האיסוף וכל זרימה דרכו. הנח את עמוד הספין המבוסס על קרום הסיליקה בצינור איסוף חדש של נקודה וחמישה מיליליטר. לאחר מכן העבירו 25 מיקרוליטר מים ללא RNase על העמוד וסגרו את המכסה.
השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו את האלואט בנפח 25 מיקרוליטר המכיל את ה-RNA הכולל לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
בהליך זה, הכינו תמיסת תערובת מאסטר המכילה שני מיקרוליטרים של תערובת חומצות גרעין פי 10, שני מיקרוליטרים של תערובת טרנסקריפטאז הפוכה וארבעה מיקרוליטרים של מאגר Hispec פי 5, בסך הכל 8 מיקרוליטר לצינור. לאחר מכן הוציאו 8 מיקרוליטר מתמיסת תערובת המאסטר לכל צינור. מדוד את כמות ה-RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר.
לאחר מכן, הוסף מיקרוגרם אחד של סך ה-RNA המבודד, מטוהר מדגימת הממברנה הצפקית, לכל צינור. לאחר מכן, הוסף מים ללא RNase לכל צינור כדי להביא אותו לסך של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן מערבבים אותו היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה למשך 15 שניות.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דגרו אותו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. העבירו את ה-cDNA החדש שנוצר לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ודללו אותו 10 פעמים במים ללא RNase.
בהליך זה, הכינו תערובת מאסטר המכילה 12 נקודות חמישה מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x PCR, שני נקודה חמישה מיקרוליטרים של חמישה מיקרומולר של כל פריימר miRNA מומס במים נטולי נוקלאז, ונקודה אחת שניים חמישה מיקרוליטרים של פריימר אוניברסלי פי 10, לכל באר. מחלקים 22 נקודות חמישה מיקרוליטר מתערובת המאסטר הזו לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן הוסף שניים וחמישה מיקרוליטרים של תבנית cDNA לכל באר.
אטום את צלחת התגובה של 96 באר בעזרת פיסת סרט. ואז צנטריפוגה אותו ב -1, 000 פעמים G למשך 30 שניות. כדי להפעיל את תוכנית האופניים PCR, הגדר את הצלחת במכשיר ה-PCR בזמן אמת.
בתוכנת PCR בזמן אמת, הגדירו את מאפייני הניסוי. לאחר מכן, הקצו שמות לדגימות והתמקדו ב-miRNA בכל באר. לאחר מכן, בזמן אמת תוכנת PCR הזינה נפח תגובה של 20 מיקרו ליטר ואת תנאי הרכיבה הבאים של PCR בהתאם להוראות.
דגירה מוקדמת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ואז 40 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וכריעה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. בהתבסס על miRNA, סינון מיקרו מערך, נמצא כי הרמות של שישה miRNAs מוגברות באופן משמעותי בקרום הצפק של חולדות פיברוזיס צפק, בהשוואה לאלו בחולדות מדומות וחולדות ביקורת, באמצעות QRTCPR, בהתאם לפרוטוקול המוצג בכתב יד זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ביטוי microRNA בממברנת הצפק של חולדה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם תעתיק רוורס בזמן אמת כמותי. הוא מיועד לחקר פרופילי ביטוי microRNA בתנאים פתולוגיים שונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר microRNA
רקע
- ל-MicroRNAs יש תפקידים קריטיים בוויסות גנים.
- הבנת ביטוי שלהם במצבים פתולוגיים היא חיונית.
- ממברנת הצפק של חולדה משמשת כמודל לחקר ביטויים אלו.
- PCR כמותי בזמן אמת הוא שיטה אמינה לזיהוי.
מטרת המחקר
- לטהר ולזהות miRNAs בממברנת הצפק של חולדה.
- לנתח פרופילי ביטוי microRNA במצבים שונים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- הרדמה אינהילאציונית עם 4% איזופלורן.
- הכנת אזור הבטן עם 70% אתנול.
- חתך כירורגי לגישה לממברנת הצפק.
- שימוש במספריים ופורצפס לחילוץ הממברנה.
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של miRNAs מממברנת הצפק.
- זיהוי כמותי של ביטוי microRNA הושג.
- הפרוטוקול אומת לשימוש במחקרים פתולוגיים שונים.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת מנגנוני מחלות.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לחקר microRNA במודלים של חולדות.
- הוא מספק תובנות לגבי תפקיד ה-microRNAs בפתולוגיה.
- מחקר עתידי יכול לבנות על המתודולוגיה הזו ליישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Peritoneum Sample Collection
8:29
Conclusion
8:06
Results: Upregulated miRNAs in the Peritoneal Membrane of Peritoneal Fibrosis Rats
1:54
Purifying Total RNAs from Peritoneal Membrane Samples
5:36
Reverse Transcription of Total RNA
6:44
qRT-PCR of miRNA
