Name: טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: למד שיטות להשריה וכימות סלולר הזדקנות בדגמים וסוגי תאים שונים. הפרוטוקולים מאפשרים ניטור מדויק של סמני סנסציה ומספקים כלים חיוניים לחקר הביולוגיה של הזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי התכנית העירונית המחקר של המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי להזדקנות. המחברים מבקשים להודות מרים Gorospe ו קוטב Abdelmohsen לדיונים רבים מועילים על הזדקנות ובין הקוטב Abdelmohsen עבור אנוש גם לקרוא את כתב היד. אנו מודים גם אנשי המעבדה שלנו, במיוחד דאגלס Dluzen עבור האנושות לקרוא את כתב היד.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
<li>Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+cellular+senescence%3A+implications+for+immortalization+of+normal+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).</li>
<li>Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase--an+indicator+of+the+maturational+stage+of+mouse+and+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes.</a> J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

הנה, יש לנו תיאר שיטות להזדקנות המושרה-נזק לדנ&quot;א בשכפול הדנ&quot;א ושימוש פיברובלסטים דיפלואידי האנושי. בנוסף, טכניקות לכימות חלבון רמות ה- mRNA של חלבונים שונים הקשורים להזדקנות כלולים, כמו גם מכתים עבור SA-β-gal ועבור סמן DNA נזק γ-H2AX. ניתן פרוטוקולים אלה בשימוש נרחב כדי להעריך פנוטיפים senescent היא במבחנת in vivo, למרות אזהרות רבות קיימות לאפיון הזדקנות in vivo 20. תאים אחרים עשויים לבטא סמני הזדקנות, גם אם הם לא שתאים ...

לפני יותר מחצי מאה, Hayflick ועמיתיו תארו כיצד untransformed תאים להתרבות בתרבות, אבל רק עבור תקופה מוגבלת של זמן 1. תרביות של פיברובלסטים אדם לטווח ארוכים גורמות לתאים להפסיק מתרבים; עם זאת, הם היו מבחינה מטבולית פעילה, וזה נקרא הזדקנות תאית. הזדקנות יכולה להיות מועילה עבור עיכוב היווצרות גידול, אבל זה גם יכול להזיק, כפי שהוא חשב לתרום אובדן יכולת התחדשות המתרחשת עם 2 הזדקנות, 3. שתאים מזדקנים הוכחו להצטבר ברקמות כבני אדם בגיל 4 ו היו מעורבים מספר תהליכים ביולוגיים, כולל ההתפתחות העוברית, לריפוי פצעים, תיקון רקמות, ודלקות הקשורות לגיל 2. passaging המתמשכת של תאים בתרבית המשרה הזדקנות בשכפול הדנ&quot;א, אשר נקשרהטלומרים התשה וחוסר יציבות גנומית. מדגיש תא שונים, לרבות נזק לדנ&quot;א אונקוגנים, יכול גם לגרום להזדקנות 3. הזדקנות נגרמת על ידי גורמים אחרים מלבד תשה הטלומרים נקראת לעתים מתח מושרה או הזדקנות מוקדמת וכן תלויה בדרך כלל על p16 INK4A / Rb המסלול 5. למרות מתרבה, תאי untransformed מופיעים בדרך כלל ציר בכושר, ניתן לזהות תאים מזדקנים כבעל מאפיינים מסוימים, כולל מורפולוגיה שטוחה, גדולה הקשורים להזדקנות מוגברת פעילות β-galactosidase (SA-β-gal) (איורי 1 &amp; 2). שתאים מזדקנים גם לצבור סמנים לנזק לדנ&quot;א, כולל γ-H2AX (איור 3) 6, ו, באופן פוטנציאלי, מוקדים heterochromatin הקשורים להזדקנות (SAHF) (איור 4) 7. יש שתאים מזדקנים רמות גבוהות יותר של רגולטורי מחזור התא, כולל p<html> 16 (P16 INK4A) ו / או p21 ו- p53 (איור 5) 8, 9. יתר על כן, הנתונים האחרונים הראו כי שתאים מזדקנים יכולות להיות השפעות בלתי אוטונומית על ידי הפרשת מספר פרו-דלקתיות ציטוקינים chemokines נקרא פנוטיפ הפרשה קשורה-הזדקנות (SASP) 10. למרות תופעת SASP עשויה להשתנות מן סוג תא לסוג תא, באופן כללי, זה בא לידי ביטוי בגידול Interleukin-6 (IL-6), IL-8, גורם מגרת מושבת מקרופאג-גרנולוציט (GM-CSF), צמיחה, α אונקוגן מוסדר (GRO-α), ו Gro-β, בין היתר (איור 6). לחץ מסוים או ניזק המשרה הזדקנות עשוי גם להשפיע על הפנוטיפ פרשת 11, 12, 13. SASP ניתן לאתר על ידי מדידת רמות של חלבונים המופרשים באמצעות ELISAs או ציטוקינים / מערכים חלבוןs = &quot;Xref&quot;&gt; 10, 14. למרות מנגנונים שלאחר תעתיק יכולים לווסת את רמות חלבון SASP 11, 15, 16, 17, שינויים ברמות mRNA יכול גם להתגלות במקרים רבים. שינויים אלה הם בדרך כלל יותר רגישים יותר קלים לכמת מ מדידות רמת חלבון. סמני ההזדקנות אחרים ניתן להעריך גם, כולל מוקדי הגרעין עיקש נזק לדנ&quot;א, קטעי DNA הנקרא עם שינויים הכרומטין חיזוק הזדקנות (DNA-צלקות) 18, וסמנים אחרים שונים 3, 19, 20. כאן, אנו מתארים שיטות נפוצות גרימת הזדקנות בתאים בתרבית וגם למדידת מספר סמנים של הזדקנות, כולל SA-β-גל, γ-H2AX, SAHF, ואת חלבון ה- mRNA של להזדקןNCE הקשורים מולקולות.

<table><tbody><tr><td>16% ג'ל טריס-גליצין</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>חומצה-פנול ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 נוגדן נגד עכברים עיזים</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>מרימי תאים</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>מגרד תאים</td></tr><tr><td>ECL נגד עכבר נוגדן מקושר HRP אמרשם</td><td></td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL פלוס מצע ספיגה מערבית</td><td>פירס</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>MP01306</td><td>מלאי 5 מ"ג/מ"ל ב-dH2O</td></tr><tr><td>נוגדן GAPDH</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 דילול</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>אמביון</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>היסטון H3 דימתיל K9 נוגדן חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>אנושי IL-6 Quantikine ELISA מבחן</td><td>R& D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 Quantikine ELISA מבחן</td><td>R& D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA מבחן</td><td>R& מערכות D</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimethylformamide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 נוגדן חד שבטי</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>p21 נוגדן חד שבטי</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 דילול</td></tr><tr><td>p53 נוגדן חד שבטי</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-126</td><td>1:500 שיבוט דילול DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC נוגדן מצומד</td><td>איתות תאים</td><td>9719</td><td>1:2,000 דילול</td></tr><tr><td>POWER מיקס מאסטר PCR ירוק SYBR&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>סמני משקל מולקולרי מוכתמים מראש</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת PVDF&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Senescence &beta;-Galactosidase ערכת צביעה איתות</td><td>תאים</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

בתגובה ללחץ או נזק לתאים, תאי מתרבים יכול לגרום תוכנית ספציפית יוזם במצב של מעצר מחזור התא לטווח ארוך, כינה הזדקנות תאית. הצטברות של תאים מזדקנים מתרחשת עם והזדקנות האורגניזם ובאמצעות culturing המתמשך במבחנה. שתאים מזדקנים להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל התפתחות עוברית, תיקון רקמות התחדשות, דיכוי גידולים, והזדקנות. סימני היכר של תאים מזדקנים כוללים, אך אינם מוגבלים, פעילות β-galactosidase הזדקנות הקשורה מוגברת (SA-β-gal); רמות p16 INK4A, p53, ו p21; רמות גבוהות יותר של נזק לדנ&quot;א, כולל H2AX γ; היווצרות מוקדי heterochromatin הקשורים הזדקנות (SAHF); ורכישת פנוטיפ הפרשה הקשורים הזדקנות (SASP), תופעה המאופיינת על ידי הפרשת מספר ציטוקינים פרו-דלקתיים מולקולות איתות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים הוא בשכפול הדנ&quot;א ואתDNA נזק הנגרם הזדקנות תאים בתרבית. בנוסף, אנו מדגישים טכניקות כדי לפקח על הפנוטיפ senescent באמצעות מספר סמנים הקשורים להזדקנות, כולל SA-β-gal, γ-H2AX והכתים SAHF, ו לכמת רמות חלבון ה- mRNA של הרגולטורים מחזור התא וגורמים SASP. שיטות אלה ניתן להחיל את הערכה של הזדקנות במודלים ורקמות שונים.

<html> איורים 2 - 6 להראות תוצאות נציג מכתים SA-β-gal; מכתים עבור γ-H2AX ו SAHF; הערכת רמות החלבון p16 של INK4A, p21, ו- p53; ו mRNA ורמות חלבון של מולקולות senescent קשור. SA-β-gal מכתים מוגברת מתרחשת עם הזדקנות בשכפול הדנ&quot;א ואת DNA-induced נזק. כמו כן, לבחון את השינויים המורפולוגיים המתרחשות עם הזדקנות. התאים הופכים מוגדלים שטוח לעומת מראה הציר של פיברובלסטים מתרבים. עבור פרדיגמה ניסויית זו, תאים היו מוכתמים RNA / ...

הזדקנות תאית, המדינה ההפיכה של מעצר מחזור התא, יכולה להיגרם על ידי מדגיש הסלולר שונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגרום הזדקנות תאית שיטות להערכת סמנים של הזדקנות.

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

המטרה הכוללת של טכניקות אלה היא לספק ארגז כלים המאפשר אינדוקציה, ניטור וכימות של הזדקנות תאית. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי זיהוי וכימות של הזדקנות תאית והגורמים הביולוגיים המווסתים את הזדקנות התאים והאורגניזמים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מקיפות מגוון שיטות לניטור הזדקנות תאית במודלים, רקמות וסוגי תאים שונים.התחל בציפוי תאי ההתפשטות המוקדמים של המעבר המוקדם בצפיפות דלילה בצלחת המתאימה לניתוח. ולתרבית את התאים למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמות. כאשר התאים הם 50-60% מתלכדים, שאפו את מצע הגידול ושטפו את התאים עם PBS פעמיים.לאחר הכביסה השנייה, מכסים את התאים בשכבה דקה של PBS. ולחשוף את התאים למנה אחת של 10 דרגות של קרינת גמא. החלף את ה- PBS במצע גידול.ולהחזיר את התאים לחממה. החלפת המדיום כל 48 עד 72 שעות עם ניטור יומי לשינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ אור. שבעה עד 10 ימים לאחר ההקרנה, יש להפשיר את כל הריאגנטים מערכת בדיקת בטא-גלקטוזידאז מסחרית הקשורה להזדקנות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.כאשר כל הריאגנטים מגיעים לטמפרטורת החדר, הכינו את תמיסות הקיבוע והצביעה לפי הוראות היצרן. ושטפו בעדינות כל באר עם PBS בטמפרטורת החדר. הקפידו לשטוף את התאים בזהירות מכיוון שתאי הזדקנות אינם נדבקים היטב וניתן להסיר אותם בקלות במהלך השטיפות.תקן את התאים בכל באר עם מיליליטר אחד של תמיסה מקבעת לבאר למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שתי שטיפות של שני מיליליטר עם PBS לבאר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת צביעה בטא-גלקטוזידאז לכל באר וכסו את הצלחת בנייר אלומיניום לתרבית של 24 עד 48 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני.בדוק את התאים לאחר 24 שעות. כאשר התאים מוכתמים מספיק, החליפו את תמיסת הבטא-גל ב-PBS טרי ובחנו את התרביות במיקרוסקופ אור עם מצלמה מחוברת במטרה של פי 10 ומעלה. תאי הבטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות ייראו כחולים.לאחר מכן, השג לפחות חמש תמונות לא חופפות לכל באר. ולספור ידנית את המספר הכולל של תאים חיוביים בטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות ואת המספר הכולל של תאים לתמונה כדי לחשב את אחוז תאי הבטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות לבאר. 10 ימים לאחר הקרנת גמא יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBS ב -2.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום, בתוספת אנטיביוטיקה לכל צלחת שישה סנטימטר והחזיר את התאים לחממת תרבית הרקמה למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו את המדיום לצינור חרוטי על קרח. ושטפו את התאים פעמיים עם PBS טרי.לאחר מכן, נסה וספור את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הסופרנטנט שנקצר מצלחת תרבית התאים. ואז לסנן אותו דרך מסננת מזרק של 0.45 מיקרומטר ולהקפיא את המדיום ב-500 מיקרוליטר ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוחם על ידי ELISA.הזדקנות מוגברת הקשורה לצביעת בטא-גל מתרחשת עם הזדקנות הנגרמת על ידי שכפול ונזק ל-DNA. שימו לב לצורה השטוחה המוגדלת של התאים המזדקנים בהשוואה למראה דמוי הציר של הפיברובלסטים המתרבים. בניסוי זה, תאים מזדקנים צעירים או משתכפלים תוקנו כמתואר בפרוטוקול הכתוב.ומוכתם באנטי-גוף כנגד סמן ביולוגי לשבירת גדיל כפול של DNA ו-DAPI. עם עלייה ניכרת במספר ה-DNA של שבירת גדיל כפול שנצפתה בתאים המזדקנים. ניתוח RT-qPCR של גורמי פנוטיפ הפרשה הקשורים להזדקנות מגלה שלפחות חלק מהגורמים מווסתים לאחר הקרנת גמא הנגרמת הזדקנות בפיברובלסטים דיפלואידים אנושיים במעבר נמוך ברמת MRNA.מה שאושר עוד יותר על ידי ELISA של תרבית תאים מוקרנת גמא. לאחר השליטה, ניתן להשלים את השראת נזק ה-DNA וצביעה בטא-גל SA תוך כ-30 דקות של זמן מעשי. ניתן להכין את אמצעי המצב לכימות רמות חלבון SASP תוך כ-30 דקות.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר השינויים המורפולוגיים בתרביות התאים לפני שתמשיך לכימות סמן הזדקנות. לאחר פיתוחו, טכניקות אלו סללו את הדרך לחוקרים בתחומי ההזדקנות והסרטן לחקור הזדקנות במגוון רקמות, תרביות תאים ואורגניזמים מודלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגרום, לנטר ולכמת הזדקנות תאית.

techniques-to-induce-and-quantify-cellular-senescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

ROS תאיים הוכח לשחק תפקיד חשוב אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית הסלולר. כאן, אנו מתארים וזמינותו רגיש לכימות תנועת ROS רמות במהלך הזדקנות ביולוגית הסלולר. אנו מספקים גם פרוטוקולים להערכת את הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ, אשר תורמת הדיווחים תפקוד שונות הקשורות לגיל.

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

פרוטוקול לכימות ציטומטרי פלואורסצנטי, זרימה של תאים סרטניים סנסנטיים המושרים על ידי תרופות כימותרפיות בתרבית תאים או במודלים של גידולי מורין. הליכים אופציונליים כוללים co-immunostaining, קיבוע דגימה כדי להקל על אצווה גדולה או ניתוח נקודת זמן, והעשרה של תאים senescent קיימא על ידי מיון ציטומטרי זרימה.

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

אימונופלואורסצנציה מרובה מאפשרת תיוג רציף של מספר סמני נוגדנים בתוך חתך רקמה אחד כדי לתמוך בניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה ואוכלוסיות התאים. כאן מוצגת זרימת עבודה לזיהוי מולטיפלקס של סמנים מבניים וחיסוניים הקשורים להזדקנות, הכוללת הכנת שקופיות ידנית ואוטומטית, הדמיה איטרטיבית וניתוח תאים בודדים באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית.

מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

מאמר זה מציג פרוטוקול LysoTracker של תאים חיים למדידת שיקום ליזוזומי במהלך הזדקנות בפיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90.

פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

שיטה זו חוקרת כיצד פיברובלסטים של עור מזדקנים משפיעים על הבריאים. הזדקנות מושרה מחשיפה ל-UVB, והמדיום המותאם מיושם על פיברובלסטים רגילים. היא מסייעת להעריך תרכובות ביואקטיביות המיועדות לשינוי בתקשורת תא לתא בהזדקנות העור.

שילוב חדש של נוגדי חמצון לשיקום תקשורת בין-תאית בריאה במודל חוץ גופי באמצעות מדיום מותנה מתאים זקנים

למד שיטות להשריה וכימות סלולר הזדקנות בדגמים וסוגי תאים שונים. הפרוטוקולים מאפשרים ניטור מדויק של סמני סנסציה ומספקים כלים חיוניים לחקר הביולוגיה של הזדקנות.

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

גלה סרטונים נוספים