טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

המטרה הכוללת של טכניקות אלה היא לספק ארגז כלים המאפשר אינדוקציה, ניטור וכימות של הזדקנות תאית. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי זיהוי וכימות של הזדקנות תאית והגורמים הביולוגיים המווסתים את הזדקנות התאים והאורגניזמים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מקיפות מגוון שיטות לניטור הזדקנות תאית במודלים, רקמות וסוגי תאים שונים.

התחל בציפוי תאי ההתפשטות המוקדמים של המעבר המוקדם בצפיפות דלילה בצלחת המתאימה לניתוח. ולתרבית את התאים למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמות. כאשר התאים הם 50-60% מתלכדים, שאפו את מצע הגידול ושטפו את התאים עם PBS פעמיים.

לאחר הכביסה השנייה, מכסים את התאים בשכבה דקה של PBS. ולחשוף את התאים למנה אחת של 10 דרגות של קרינת גמא. החלף את ה- PBS במצע גידול.

ולהחזיר את התאים לחממה. החלפת המדיום כל 48 עד 72 שעות עם ניטור יומי לשינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ אור. שבעה עד 10 ימים לאחר ההקרנה, יש להפשיר את כל הריאגנטים מערכת בדיקת בטא-גלקטוזידאז מסחרית הקשורה להזדקנות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר כל הריאגנטים מגיעים לטמפרטורת החדר, הכינו את תמיסות הקיבוע והצביעה לפי הוראות היצרן. ושטפו בעדינות כל באר עם PBS בטמפרטורת החדר. הקפידו לשטוף את התאים בזהירות מכיוון שתאי הזדקנות אינם נדבקים היטב וניתן להסיר אותם בקלות במהלך השטיפות.

תקן את התאים בכל באר עם מיליליטר אחד של תמיסה מקבעת לבאר למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שתי שטיפות של שני מיליליטר עם PBS לבאר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת צביעה בטא-גלקטוזידאז לכל באר וכסו את הצלחת בנייר אלומיניום לתרבית של 24 עד 48 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני.

בדוק את התאים לאחר 24 שעות. כאשר התאים מוכתמים מספיק, החליפו את תמיסת הבטא-גל ב-PBS טרי ובחנו את התרביות במיקרוסקופ אור עם מצלמה מחוברת במטרה של פי 10 ומעלה. תאי הבטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות ייראו כחולים.

לאחר מכן, השג לפחות חמש תמונות לא חופפות לכל באר. ולספור ידנית את המספר הכולל של תאים חיוביים בטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות ואת המספר הכולל של תאים לתמונה כדי לחשב את אחוז תאי הבטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות לבאר. 10 ימים לאחר הקרנת גמא יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה- PBS ב -2.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום, בתוספת אנטיביוטיקה לכל צלחת שישה סנטימטר והחזיר את התאים לחממת תרבית הרקמה למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו את המדיום לצינור חרוטי על קרח. ושטפו את התאים פעמיים עם PBS טרי.

לאחר מכן, נסה וספור את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הסופרנטנט שנקצר מצלחת תרבית התאים. ואז לסנן אותו דרך מסננת מזרק של 0.45 מיקרומטר ולהקפיא את המדיום ב-500 מיקרוליטר ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוחם על ידי ELISA.

הזדקנות מוגברת הקשורה לצביעת בטא-גל מתרחשת עם הזדקנות הנגרמת על ידי שכפול ונזק ל-DNA. שימו לב לצורה השטוחה המוגדלת של התאים המזדקנים בהשוואה למראה דמוי הציר של הפיברובלסטים המתרבים. בניסוי זה, תאים מזדקנים צעירים או משתכפלים תוקנו כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

ומוכתם באנטי-גוף כנגד סמן ביולוגי לשבירת גדיל כפול של DNA ו-DAPI. עם עלייה ניכרת במספר ה-DNA של שבירת גדיל כפול שנצפתה בתאים המזדקנים. ניתוח RT-qPCR של גורמי פנוטיפ הפרשה הקשורים להזדקנות מגלה שלפחות חלק מהגורמים מווסתים לאחר הקרנת גמא הנגרמת הזדקנות בפיברובלסטים דיפלואידים אנושיים במעבר נמוך ברמת MRNA.

מה שאושר עוד יותר על ידי ELISA של תרבית תאים מוקרנת גמא. לאחר השליטה, ניתן להשלים את השראת נזק ה-DNA וצביעה בטא-גל SA תוך כ-30 דקות של זמן מעשי. ניתן להכין את אמצעי המצב לכימות רמות חלבון SASP תוך כ-30 דקות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר השינויים המורפולוגיים בתרביות התאים לפני שתמשיך לכימות סמן הזדקנות. לאחר פיתוחו, טכניקות אלו סללו את הדרך לחוקרים בתחומי ההזדקנות והסרטן לחקור הזדקנות במגוון רקמות, תרביות תאים ואורגניזמים מודלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגרום, לנטר ולכמת הזדקנות תאית.