בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

המטרה הכוללת של הליך ביוכימי זה היא לבודד שברים מועשרים בחוטי ביניים מרקמות עכבר מרובות על מנת לחקור שינויים לאחר תרגום של חלבוני נימה ביניים ספציפיים לרקמות השונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חוטי הביניים כגון כיצד התפקוד והוויסות של חלבוני השלד הציטו-שלד החשובים הללו מושפעים במהלך הזדקנות היונקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששילוב שלב אוטומטי של ליזיס רקמות מאפשר למשתמשים לעבד מספר דגימות רקמה בצורה מהירה ויעילה.

כדי להתחיל, הוסף מיליליטר אחד של מאגר טריטון X-100 קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז להומוגניזטור צינור זכוכית והנח אותו על קרח. הסר פיסת רקמה קטנה מאחסון החנקן הנוזלי והנח אותה ישירות לתוך הומוגנייזר הזכוכית. לאחר מכן, תוך שמירה על ההומוגנייזר והדגימה על הקרח בכל עת, השתמש בכ-50 משיכות של פסטיל פוליטטרפלואורואתילן כדי להומוגניזציה של הדגימה תוך מזעור היווצרות בועות.

העבירו את הליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח, וצנטריפוגה את הדגימה ב-20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, אספו את שבר הסופרנטנט המסיס Triton X לתוך צינור נפרד. חלק זה יכול לשמש למשקעים חיסוניים ולניתוח של המאגר המסיס בחומר הניקוי של חלבוני IF.

לאחר מכן, לכדור הרקמה הוסיפו מיליליטר אחד של חוצץ מלח גבוה בתוספת מעכבי פרוטאז. מעבירים אותו להומוגנייזר נקי, ומטפטפים 100 פעימות. העבירו את ההומוגנאט בחזרה לצינור המיקרו-צנטריפוגה והניחו את הצינור על שייקר מסתובב בחדר הקירור למשך שעה.

צנטריפוגה את ההומוגנטים ב-20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות והשליכו את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר PBS EDTA קר כקרח לגלולה והעביר אותו להומוגנייזר נקי כשלב ניקוי אחרון. לאחר הומוגניזציה, העבירו את הדגימה לצינור חדש וצנטריפוגה אותה ב-20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לקבל את תמצית המלח העשירה בחלבון IF, או HSC.

השליכו את הסופרנטנט והמיסו את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS שאינו מפחית שחומם מראש. לפרק את הגלולה בתחילה על ידי פיפטינג ומערבולת. ואז מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

מערבולת ופיפטה לפי הצורך, כדי להבטיח שהכדור מומס במלואו, מה שעשוי לקחת מספר דקות. אחסן את כל הדגימות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. כדי לבצע מיצוי RNA, הוסף מאגר ליזה בצינור המכיל מטריצת ליזין D, ולאחר מכן הוסף את רקמת הדגימה ללייזר הרקמות ודופק פעמיים למשך 25 שניות כל אחת.

הפרד את הליזט מהמטריצה על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G.למיצוי חלבון, הוסף מאגר דגימה Triton X-100 או SDS אם מכינים ליזאט כולל. לתוך צינור ליזין עם מטריצת ליזין SS. לאחר מכן, הוסף את רקמת הדגימה. דופק את הדגימה לזמן קצר כדי לערבב.

להכנת HSC, השתמש במגנט כדי להסיר את חרוז הנירוסטה מהצינור, וצנטריפוגה את הצינורות ב-20,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפרד את שברי הסופרנטנט והכדור והמשך כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. הכן מאגר PBST על ידי הוספת 10 מיקרוליטר T20 ל-50 מיליליטר PBS pH 7.4.

לאחר מכן הכינו תמיסת נוגדנים PTM על ידי הוספת 1 עד 10 מיקרוגרם של נוגדן ל-200 מיקרוליטר PBST. Aliquot 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה. הנח אותו על המגנט ושאף את תמיסת אחסון החרוזים.

להצמיד את החרוזים לנוגדנים החיסוניים על ידי השעיית החרוזים בתמיסת הנוגדנים ודגירת הדגימה על מסובב בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הנח את הצינורות על המגנט, ושאף את תמיסת הנוגדנים. לאחר מכן השתמש ב-200 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף את החרוזים המצומדים של הנוגדנים פעם אחת, ולהסיר את התמיסה.

הוסף 0.6 למיליליטר אחד של ליזט הרקמה לחרוזים. מערבבים על ידי פיפטינג בעדינות, ודוגרים את התמיסה על מסובב בחדר קר למשך שלוש שעות. הנח את הצינורות על המגנט והסר את הליזאט, ולאחר מכן השתמש ב-200 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף את החרוזים חמש פעמים.

לאחר שלב הכביסה האחרון, אספו את החרוזים ו -100 מיקרוליטר PBS והעבירו את החרוזים לצינור חדש ונקי. הנח את הצינור על המגנט ולאחר מכן שאב את ה-PBS. הסר את הצינור מהמגנט והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה שאינו מפחית.

יש להוציא 50 מיקרוליטר מהצינור, ולשלב אותו עם 5%2ME כדי ליצור דגימות מפחיתות. מחממים את הדגימות ל 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. עם הצינור על המגנט, אספו את שבר ה-IP מהחרוזים והעבירו אותו לצינור טרי.

אחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח. כדי למנוע זיהום של דגימות חלבון לניתוח ספקטרומטריית מסה, השתמש בכפפות נקיות כדי לטפל בכל הג'לים ולדגור אותם במיכלים נקיים שנשטפו רק עם DD H2O. הפעל 20 עד 50 מיקרוליטר של דגימת HSE על ג'ל דף SDS בהתאם לתנאים הסטנדרטיים.

לאחר צביעת הג'ל לפי פרוטוקול הטקסט, הניחו את הג'ל בין מגיני יריעות הפלסטיק. לאחר מכן סרוק וסמן את הרצועות שייכרתו. השתמש בסכין גילוח חדש ונקי כדי לכרות את רצועות חלבון ה-IF ולהניח את הרצועות בצינורות מיקרו-צנטריפוגות נקיים על קרח לפני שליחתן לניתוח ספקטרומטריית מסה.

איור זה מציג תוצאה אופיינית של HSEs מתשע רקמות עכבר שבודדו בשיטה המהירה. שימו לב ששיטה זו אינה עובדת היטב על הלבלב והטחול, ומניבה רצועות נוספות בדגימת המעי הגס. ניתוח ביטוי גנים זה מראה שהקרטין 8 מווסת במהלך ההזדקנות.

בנוסף, כתמים מערביים מראים כי קרטין 8 מווסת חזק בכבד של עכברים זקנים. כאן, HSE בכבד המתקבל באמצעות הפרוטוקול האוטומטי מדגים את ההעשרה החזקה של קרטין 8 ו-18 על הג'ל. ניתוח ספקטרומטריית מסה מראה כי ל-K8 ו-K18 בכבד מעכבר זקן יש אתרי זרחון ואצטילציה מרובים שאינם קיימים בכבד מהעכבר הצעיר.

בדומה לשינויים בקרטין בכבד, ניתוח רקמת המוח על ידי QPCR מגלה אינדוקציה של פי חמישה של GFAP mRNA במוחם של עכברים בני 24 חודשים בהשוואה לעכברים בני שלושה חודשים. לבסוף, ניתוח חלבונים של תמציות המלח הגבוהות על ידי צביעת Coomassie, וכתמים חיסוניים של שברים מועשרים באצטיל ליזין מגלים כי חלבון GFAP מווסת ואצטיל במוח העכבר המזדקן. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון תערובת פרוטאאו מבוססת ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כגון מהם השינויים החשובים לאחר התרגום ושותפי הקישור של חלבוני נימה ביניים במהלך תנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד חלבוני נימה ביניים מרקמות יונקים שונות.