לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הקשר לניתוח ביטוי גנים באופן ספציפי למחזור התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן הקשורות לאירועי שעתוק תלויי מחזור התא העומדים בבסיס טרנספורמציה ממאירה כמו גם טיפול אנטי סרטני. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא קובע בדיוק דפוסי ביטוי גנים ספציפיים לשלב מחזור התא הן במצבים מספר שתיים והן לאחר חשיפה לכימותרפיה.

תאי U2OS משמשים לניסוי זה, ויש לזרוע אותם בכלים של 100 מילימטר בערב בסביבות השעה 19:00 כדי שניתן יהיה לבצע את הצעדים הבאים במהלך שעות העבודה. תן לתאים להיצמד על ידי דגירה של הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO2 למשך 24 שעות.

למחרת בדוק את התאים כדי לוודא שהם נמצאים במפגש של 50%. עבור גוש התימידין, הוסיפו 100 מיקרוליטר של ציר תימידין טרי של 200 מילי-מולרי לכל צלחת תרבית של 100 מילימטר. דגרו על התאים עם תימידין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO2 למשך 20 שעות.

למחרת, בסביבות השעה 15:00 שחררו תאים מגוש התימידין על ידי הסרת תווך גידול המכיל תימידין. שטפו תאים פעמיים עם PBS 1X מחומם מראש.

ואז להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לכל מנה של 100 מילימטר. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. עבור מעצר תאים מיטוטיים הוסף נוקודאזול לריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר.

דגרו על תאים עם נוקודאזול לא יותר מ-10 עד 11 שעות. למחרת בבוקר, בין שש לשבע בבוקר, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם אכן חסומים ב-G2-M, מה שמעיד על המראה המעוגל שלהם.

נתק תאים מיטוטיים על ידי ניעור כל צלחת, ופיפטינג עדין של נוקודאזול המכיל מצע גידול עם תאים מנותקים מכל צלחת של 100 מילימטר. שלב תאים מיטוטיים מכל הכלים לצינור סטרילי של 50 מילילטר. צנטריפוגה 300 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו תאים פעמיים על ידי הוספת PBS 1X קר, ואחריו צנטריפוגה. לאחר הוצאת ה- PBS מהכביסה השנייה, יש להשעות מחדש תאים מיטוטיים במדיום תרבית שלם. חסוך שני מיליליטר למיצוי RNA, ושני מיליליטר לניתוח FACS לנקודת הזמן של שעת האפס.

צלחת מחדש את התאים המיטוטיים הנותרים לנקודות זמן עוקבות בשש לוחות באר. כדי להתחיל בהליך זה, זרע 0.25 פעמים 10 לתאי U2OS השישיים לבאר בשש צלחות באר. על הכריכה של כל לוח שש בארות כתוב את תנאי הניסוי עבור כל באר.

לדוגמה, לא מטופל או מטופל בריכוז שונה של תרופות ונקודות זמן. תן לתאים להתחבר על ידי דגירה של שש צלחות הבאר למשך הלילה. למחרת בבוקר יש לבדוק את התאים כדי לוודא שהם נמצאים במפגש של 50%.

מוציאים את המדיום השלם מהבארות, ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום DMEM-Glutamine מחומם מראש, ללא FBS לכל באר. דגרו על התאים למשך 24 שעות נוספות. כדי לעצור תאים עם הידרוקסיאוריאה, הסר את המדיום מהבארות, והחלף בארבעה הידרוקסיאוריאה מיקרומולרית שהוכנה טרי המכילה מדיום שלם.

דגירה של תאים במדיום המכיל הידרוקסיאוריאה למשך 24 שעות. לפני שחרור תאים ממעצר בתיווך הידרוקסיאוריאה, בדוק את התאים כדי לוודא שהם נעצרים. יש להסיר את ההידרוקסיאוריאה המכילה מדיום מבארות, ולשטוף בארות פעמיים עם PBS 1X שחומם מראש.

לאחר הוצאת ה- PBS מהכביסה השנייה, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום שלם לבאר. שמור את הצלחות בחממה עד לאיסוף הדגימות. דגימות משני פרוטוקולי הסנכרון נאספות באותו אופן לניתוח FACS ולמיצוי RNA.

לניתוח FACS, יש לשטוף כל באר בשני מיליליטר PBS 1X מחומם מראש, ולאחר מכן להוסיף 0.3 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA מחוממת מראש כדי לנתק את התאים. לאחר חמש דקות, השבת את Trypsin-EDTA על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום שלם. אסוף כל דגימה בצינור נפרד של 15 מיליליטר.

תאי צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט, שטפו עם 1X PBS וסובבו שוב. הסר את ה-PBS ושמור את הגלולה הסלולרית.

על מנת לתקן תאים, השעו מחדש כל כדור סלולרי במיליליטר אחד של אתנול 70% צונן על ידי מערבולת עדינה. הנח את התאים על קרח למשך כ-15 דקות לפני צביעת פרופידיום יודיד וניתוח FACS. למיצוי RNA הסר את המדיום ושטוף כל באר עם שני מיליליטר PBS 1X מחומם מראש.

קח את הצלחת לארון בטיחות, והוסף מיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA מתאים לכל באר. פיפט למעלה ולמטה כדי לפיפט וליזה של התאים ואז להעביר כל ליזאט תא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

התחל את הליך מיצוי ה-RNA על ידי שליפת צינורות המיקרו-צנטריפוגה מהמקפיא עם דגימות במגיב בידוד RNA, והפשרתם בטמפרטורת החדר בתוך ארון בטיחות לכימיקלים. מוסיפים 400 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה ומנערים במרץ ללא מערבולת עד לערבוב מלא. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

צנטריפוגה את הצינורות למשך 15 דקות במיקרוצנטריפוגה עליונה. העבירו את השלב המימי של כל דגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליטר. הוסף נפח אחד של 100% אתנול לאט, טיפה אחר טיפה, לשלב המימי בזמן הערבוב.

אין צנטריפוגה. העבירו עד 700 מיקרוליטר מכל דגימה כולל כל משקעים שאולי נוצרו לעמודת ספין בצינור איסוף של שני מיליליטר המסופק על ידי ערכת מיני הכנת RNA מסחרית, וסגרו את המכסה. צנטריפוגה למשך 15 שניות.

השליכו את הזרימה. אם מתחילים מיותר מ-700 מיקרוליטר לדגימה, העבירו את הדגימה הנותרת לעמודת הספין, וצנטריפוגה שוב. לאחר שטיפת ה-RNA לפי הוראות היצרן, יש להוציא כל דגימה על ידי פיפטינג של 30 עד 40 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לתוך עמוד הספין, וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

קבע את ריכוז ה-RNA וטוהר הדגימות על ידי מדידות ספיגה. אחסן את דגימות ה-RNA במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש לניתוח ביטוי גנים. טיפול בפרוטוקול תימידין-נוקודאזול עוצר תאי U2OS בכניסה לשלב m, ומספק אוכלוסיית תאים המתקדמת באופן סינכרוני דרך G1 ולשלב S כפי שמוצג על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה.

טיפול על ידי פרוטוקול הידרוקסיאוריאה עוצר תאים בגבול G1/S. עם השחרור, התאים עוברים באופן סינכרוני דרך שלבי S ו-G2. פרוטוקול תימידין-נוקודאזול מתאים ביותר לניתוח פרופילי mRNA של גנים עם ביטוי שיא בשלב G1.

כפי שמוצג עבור ביטוי E2F1. לעומת זאת, פרוטוקול Hydroxyurea עובד טוב יותר לניתוח גנים עם ביטוי מועדף ב-S או G2, כפי שמודגם עבור ביטוי E2F7. מחזור התא מופרע בדרך כלל על ידי תרופות אנטי-גידוליות, המוצג הוא מעצר שלב G2 קבוע של מיטומיצין C בתאים מסונכרנים הידרוקסיאוריאה.

סיכרוניזציה של תאים עוזרת להבחין בין גנים המגיבים לחומר האנטי-גידולי לבין אלה המושפעים אך ורק מהפרעות במחזור התא המוטלות על ידי הסוכן, למשל, ירידה ברמות ה-mRNA של E2F1 לאחר טיפול במיטומיצין C היא ככל הנראה השפעה עקיפה של התרופה על הדינמיקה של מחזור התא. לעומת זאת, שיא ביטוי ה-mRNA p21-Cip1 לאחר טיפול במיטומיצין C הוא תוצאה ישירה של תוכנית שעתוק המופעלת על ידי תרופה זו. בעקבות הליך זה ניתן לבצע ניתוח טרנסקריפטומי רחב גנום כמו גם ניתוח פרוטאומי, על מנת לחשוף שינויים גלובליים בביטוי גנים המשפיעים על שלבים ספציפיים במחזור התא.

או במצבים מספר שתיים או בטיפולים אנטי-גידוליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את ההליכים הנדרשים לביצוע ניתוח ביטוי גנים בתרביות תאים מסונכרנות. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים לבידוד פרופידיום יודיד או RNA עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון כפפות וארון בטיחות לכימיקלים בעת ביצוע הליך זה.