לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הקשר לניתוח ביטוי גנים באופן ספציפי למחזור התא. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הסרטן הקשורות לאירועים שעתוקיים תלויים-מחזור תא, העומדים בבסיס התמרה ממאירה וכן טיפול אנטי-סרטני. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא קובע בדייקנות דפוסי ביטוי גנים ספציפיים לשלב מחזור התא, הן בשני תנאים והן לאחר חשיפה לכימותרפיה.

לתאים מסוג U2OS נעשה שימוש בניסוי זה; יש לזרוע אותם בצלחות של 100 מילימטר בשעות הערב, בסביבות השעה שבע, כדי שניתן יהיה לבצע את השלבים הבאים במהלך שעות העבודה. יש לאפשר לתאים להיצמד על ידי דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה עם 5% CO2 למשך 24 שעות.

ביום למחרת, בחן את התאים כדי לוודא שהם הגיעו ל-50% confluency. עבור חסימת ה-Thymidine, הוסף 100 µL של תמיסת stock של thymidine בריכוז 200 mM שהוכנה טרי לכל צלחת תרבית של 100 mm. דגרי את התאים עם Thymidine בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה עם 5% CO2 למשך 20 שעות.

ביום למחרת, בסביבות השעה 15:00, שחררו את התאים מחסם ה-Thymidine על ידי הסרת מצע הגידול המכיל Thymidine. שטפו את התאים פעמיים ב-1X PBS שחומם מראש.

לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של מצע מלא לכל צלחת של 100 millimeter. דגרו את התאים ב-37 degrees celsius למשך חמש שעות. לצורך עצירת התאים בשלב המיטוזה, הוסיפו nocodazole לריכוז סופי של 50 nanograms per milliliter.

דגרו את התאים עם nocodazole למשך לא יותר מ-10 עד 11 שעות. למחרת בבוקר, בין השעות שש לשבע, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם אכן נעצרו בשלב G2-M, כפי שמעיד מראה מעוגל של התאים.

נתקו את התאים במצב מיטוזה על ידי ניעור של כל צלחת, ושאיבה עדינה באמצעות פיפט של מצע גידול המכיל nocodazole יחד עם התאים שנותקו מכל צלחת בקוטר 100 מילימטר. רכזו את התאים במצב מיטוזה מכל הצלחות לתוך מבחנה סטרילית של 50 מיליליטר. סובבו בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת 1X PBS קר, ולאחר מכן ביצעו סנטריפוגציה. לאחר הסרת ה-PBS מהשטיפה השנייה, השהו שוב את התאים המיטוטיים בתווך תרבית מלא. שמרו שני מיליליטרים להפקת RNA, ושני מיליליטרים לאנליזת FACS עבור נקודת הזמן של שעת האפס.

בצע זריעה מחדש של תאי המיטוזה שנותרו עבור נקודות זמן עוקבות בפלטות של 6 בארות. כדי להתחיל בהליך זה, זרע 0.25 × 10⁶ תאי U2OS לכל בארה בפלטות של 6 בארות. רשום על מכסה כל פלטה של 6 בארות את התנאי הניסויי עבור כל בארה.

לדוגמה, תאים ללא טיפול או תאים שטופלו בריכוזים שונים של התרופה ובנקודות זמן שונות. אפשרו לתאים להיצמד על ידי דגירה של פלטות שיש בהן שישה בארות למשך לילה. בבוקר למחרת, בחנו את התאים כדי לוודא שהם הגיעו ל-50% confluency.

הסיר את המצע המלא מהבארות, והוסף שתי מיליליטר של מצע DMEM-Glutamine חמים מראש, ללא FBS, לכל בארה. הדגר את התאים למשך 24 שעות נוספות. כדי לעצור את התאים באמצעות hydroxyurea, הסר את המצע מהבארות והחלף אותו במצע מלא המכיל hydroxyurea בריכוז ארבע מיקרומולר שהוכן טרי.

דגרו את התאים במצע המכיל hydroxyurea למשך 24 שעות. לפני שחרור התאים מהמעצר המושרה על ידי hydroxyurea, בדקו את התאים כדי לוודא שהם במצב מעצר. הסירו את המצע המכיל hydroxyurea מהבארות, ושטפו את הבארות פעמיים ב-1X PBS שחומם מראש.

לאחר הסרת ה-PBS מהשטיפה השנייה, הוסף שני מיליליטר של מצע גידול מלא לכל באר. שמור את הפלטות באינקובטור עד לאיסוף הדגימות. דגימות משני פרוטוקולי הסנכרון נאספות באופן זהה לצורך ניתוח FACS ולצורך הפקת RNA.

לצורך אנליזת FACS, שטפו כל באער בשני מיליליטר של 1X PBS מחומם מראש, ולאחר מכן הוסיפו 0.3 מיליליטר של תמיסת Trypsin-EDTA מחוממת מראש כדי לנתק את התאים. לאחר חמש דקות, בטלו את פעילות ה-Trypsin-EDTA על ידי הוספת מיליליטר אחד של מצע גידול מלא. אספו כל דגימה לשפופרת נפרדת של 15 מיליליטר.

סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant), שטפו עם 1X PBS וסבבו שוב. הסירו את ה-PBS ושמרו את משקע התאים.

על מנת לקבע את התאים, יש להחזיר כל משקע תאי לתליה במיליליטר אחד של 70% ethanol מקורר באמצעות ערבול עדין בוורטקס. יש להניח את התאים על קרח למשך כ-15 דקות לפני צביעה ב-propidium iodide וניתוח FACS. לצורך מיצוי RNA, יש להסיר את המצע ולשטוף כל באר בשני מיליליטרים של 1X PBS שחומם מראש.

העבירו את הפלטה למטריסת בטיחות (safety cabinet), והוסיפו מיליליטר אחד של ריאגנט מתאים לבידוד RNA לכל באר. בצעו שאיבה ושחרור (pipetting) כדי לשאוב וללוות את התאים, ולאחר מכן העבירו כל תמצית תאים למבחנת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

התחילו את הליך מיצוי ה-RNA על ידי הוצאת מבחנות המיקרוצנטריפוגה עם הדגימות בריאגנט לבידוד RNA מהמקפיא, והפשירתן בטמפרטורת החדר בתוך מfaulseAns בטיחות לכימיקלים. הוסיפו 400 מיקרוליטר של כלורופורם לכל דגימה ונערו בעוצמה ללא שימוש בוורטקס עד לערבוב מלא. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

סובב את המבחנות בצנטריפוגה שולחנית למיקרו-צנטריפוגה למשך 15 דקות. העבר את הפאזה המימית של כל דגימה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 milliter. הוסף לאט, טיפה אחר טיפה, נפח אחד של 100%ethanol לפאזה המימית תוך כדי ערבוב.

אין לצנטריפוג. העבר עד 700 µL מכל דגימה, כולל כל משקב שייתכן שנוצר, לעמודת ספין (spin column) בתוך מבחנת איסוף בנפח 2 mL המסופקת בערכה מסחרית ל-RNA mini-prep, וסגור את המכסה. צנטריפוג למשך 15 שניות.

שפכו את הנוזל שעבר דרך העמודה. אם התחלתם עם יותר מ-700 µL לדגימה, העבירו את שארית הדגימה לעמודת הספין (spin column), וסובבו שוב בצנטריפוגה. לאחר שטיפת ה-RNA בהתאם להוראות היצרן, בצעו אלוציה (elution) לכל דגימה על ידי הוספת 30 עד 40 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לעמודת הספין, וסבב בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

קבע את ריכוז ה-RNA ואת טוהרה של הדגימות באמצעות מדידות בליעה. אחסן את דגימות ה-RNA בטמפרטורה של 80- degrees celsius עד לשימוש לצורך ניתוח ביטוי גנים. טיפול לפי פרוטוקול Thymidine-Nocodazole עוצר את תאי U2OS בכניסה לשלב m, ומספק אוכלוסיית תאים המתקדמת בצורה סינכרונית דרך G1 ואל שלב S, כפי שמוצג בניתוח ציטומטריה של זרימה.

טיפול באמצעות פרוטוקול ה-Hydroxyurea עוצר את התאים בגבול שבין שלבי G1 ל-S. לאחר השחרור, התאים עוברים באופן סינכרוני דרך שלבי S ו-G2. פרוטוקול ה-Thymidine-Nocodazole הוא המתאים ביותר לניתוח פרופילי mRNA של גנים עם ביטוי שיא במהלך שלב G1.

כפי שמוצג עבור ביטוי של E2F1. לעומת זאת, פרוטוקול ה-Hydroxyurea יעיל יותר לניתוח של גנים בעלי ביטוי מועדף בשלבים S או G2, כפי שמוצג עבור ביטוי של E2F7. מחזור התא מופר בדרך כלל על ידי תרופות אנטי-גידוליות; המוצג הוא מעצור קבוע בשלב G2 שנגרם על ידי mitomycin C בתאים שסונכרנו באמצעות hydroxyurea.

סנכרון תאים מסייע להבחין בין גנים המגיבים לסוכן האנטי-גידולי לבין גנים המושפעים אך ורק מהפרעות במחזור התא הנגרמות על ידי הסוכן; לדוגמה, ירידה ברמות mRNA של E2F1 לאחר טיפול ב-mitomycin C היא ככל הנראה השפעה עקיפה של התרופה על דינמיקת מחזור התא. לעומת זאת, שיאו של ביטוי mRNA של p21-Cip1 לאחר טיפול ב-mitomycin C הוא תוצאה ישירה של תוכנית שעתוק שהופעלה על ידי תרופה זו. בעקבות הליך זה ניתן לבצע ניתוחים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים ברחב הגנום, במטרה לחשוף שינויים גלובליים בביטוי גנים המשפיעים על שלבים ספציפיים של מחזור התא.

בין אם בתנאי מספר שתיים או בעקבות טיפולים אנטי-גידוליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של הפרוצדורות הנדרשות לביצוע ניתוח ביטוי גנים בתרביות תאים מסונכרנות. זכרו כי עבודה עם propidium iodide או עם ריאגנטים לבידוד RNA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות ובמ पॉपुलर (מנדף) כימיים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.