שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בסנכרון תימידין כפול ובמיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי לחקור את התפקידים המיטוטיים של חלבונים רב-תכליתיים שעשויים להיות בעלי פונקציות בין-פאזיות קריטיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כיצד לתאר את התפקודים הנורמליים של חלבונים המעורבים במחזור התא ובמיטוזה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהתאים יכולים לשמור על התנהגותם הפיזיולוגית הרגילה וכי שיטה זו גם קלה מאוד לביצוע.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר מוחמד אמין, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, שהוא מומחה בשימוש בשיטה זו. להדמיית תאים קבועים של התקדמות תאים מיטוטיים, התחל בזריעה של בערך פעמיים 10 עד תאי HeLa החמישיים לכל באר של צלחת בת שש בארות, המכילה 70% אתנול וכיסוי מעוקר UV ושני מיליליטר של מדיום DMEM. לאחר 24 שעות בחממת תרבית תאים, חסמו את התאים בשני מיליליטר תימידין מדולל טרי ומדיום טרי לכל באר, והחזירו את הצלחת לחממה למשך 18 שעות נוספות.

למחרת יש לשטוף את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS, ופעם אחת עם מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס. החזירו את התאים לחממה למשך תשע שעות כדי לשחרר את התאים מהבלוק, ואחריהם הוסיפו עוד שני מיליליטר של מדיום בתוספת תימידין לכל באר. לאחר הדגירה החוסמת השנייה, יש לשטוף את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS, ופעם אחת עם שני מיליליטר של מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 100 ננו-מולר של siRNA טרי שהוכן לבארות המתאימות.

לאחר תשע עד 10 שעות, שאפו את הסופרנטנט וקבעו את התאים על החלקות הכיסוי עם ארבעה אחוז פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם PBS, יש לחלחל את התאים הקבועים עם חומר ניקוי של 0.5% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות ב- PBS. חסום את התאים עם אחוז BSA אחד ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן תייגו את התאים ב-50 מיקרוליטר של הנוגדנים העיקריים המעניינים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS, ולסמן אותם ב-50 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים המעניינים. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות כל שטיפה, ותייגו את התאים ב-DAPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

עקוב אחר צביעת ה-DAPI עם שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS והשתמש באמצעי ההרכבה המתאים כדי להרכיב את החלקות הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ שקופות בודדות. לאחר מכן, באמצעות תוכנית צמצם מספרית של 60 או 100 X 1.4 מטרות טבילה אפוכרומטיות בשמן DIC המותקנות על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך ברזולוציה גבוהה המצויד במצלמה מתאימה, רוכשים תמונות של החלבונים המוכתמים בערימות Z בעובי של 0.2 מיקרומטר. להדמיית תאים חיים של התקדמות תאים מיטוטיים, זרע בערך 0.5 עד 1 פעמים 10 לתאי HeLa החמישיים המבטאים ביציבות mCherry H2B ו-GFP אלפא-טובולין לתוך צלחות תחתית זכוכית של 35 מיליליטר המכילות 1.5 מיליליטר של מדיום DMEM.

לגדל את התאים באינקובטור תרבית תאים למשך 24 שעות. לאחר מכן, תימידין חוסם את התאים פעמיים כפי שהודגם זה עתה, הפעם שוטף את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום DMEM מחומם מראש בסוף כל בלוק תימידין ומטפל בתאים עם siRNA לאחר החסימה הראשונה במהלך שטיפת התימידין הראשונה. גדל את התאים במדיום לייבוביץ טרי שחומם מראש, בתוספת 10% FBS ו-20 מילי-מולרי HEPES למשך שמונה שעות כדי לשחרר את התאים מהבלוק השני.

לאחר מכן הנח את הצלחת הראשונה בתא מבוקר הטמפרטורה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, והשתמש בהדמיית האובייקט והשדה הבהיר של 60 X כדי להביא את התאים למיקוד. כאשר התאים גלויים, התאם ידנית את מיקום הצלחת לאזור הנבחר והשתמש בתוכנת רכישת התמונה כדי להגדיר את עוצמת הלייזר והחשיפה, פרמטרי רכישת התמונה ותקופת משך הניסוי. בחר את מסנני ה-GFP וה-mCherry המתאימים ורכוש תמונות אור מועבר פועם ופלואורסצנטי כל 10 דקות למשך עד 16 שעות, כדי לקבל תמונות זמן-lapse של תהליך המיטוזה.

תשע שעות לאחר השחרור מגוש התימידין הכפול, השיגו את התמונות ב-12 מישורי z מופרדים של מיקרומטר אחד. לאחר מכן נתח את התמונות על ידי מעקב אחר תאים מיטוטיים בודדים והשתמש בתוכנת המקור המתאימה כדי להרכיב סרט מתאים. למרות שרוב תאי הבקרה ותאי ה-Cdt1 siRNA נמצאים בשלב המטאפאזה בתשע שעות לאחר השחרור מחסימת תימידין כפולה, קיבוע לאחר 10 שעות מגלה שרוב התאים שטופלו ב-Cdt1 siRNA עדיין נעצרים בפרומטפאזה מאוחרת, בעוד שתאי הבקרה נכנסים לאנפאזה ומפרידים את הכרומוזומים שלהם כצפוי.

טיפול בקור תשע שעות לאחר השחרור מחסימת תימידין כפולה מקל על שימור מיקרו-צינורות קינטוכור יציבים שהם יחסית פחות חזקים בתאים מדוללי Cdt1 בהשוואה לאלו בתוך תאים מדוללי ביקורת. רישוי מקור שכפול DNA אינו מופרע בתאים מדוללי Cdt1 או בקרה במהלך שלב G2-M, מכיוון שתאים אלה לא נמצאו כגורמים להצטברות של גמא H2AX זרחני, סמן לנזק ל-DNA, במהלך שלב ה-G2 שלאחר מכן. טרנספקציה של Cdt1 siRNA של תרביות אסינכרוניות, לעומת זאת, גורמת להצטברות של מוקדים חיוביים של פוספו גמא H2AX אולי בגלל נזק ל-DNA שנגרם על ידי רישוי שכפול DNA לא תקין.

לאחר פירוק המעטפת הגרעינית, תאים נורמליים נכנסים למיטוזה ועוברים התחלת אנפאזה כדי לצאת מהמיטוזה תוך כ-30 עד 60 דקות. עם זאת, נוקדאון בתיווך RNAi של Hec1, חלבון קינטוכור מרכזי הנדרש להיווצרות התקשרות חזקה של מיקרו-צינוריות קינטוכור, מעכב את ההתקדמות המיטוטית הרגילה להופעת אנפאזה או יציאה מהמיטוזה גם לאחר מספר שעות של עיכוב מיטוזה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור להמיס את התימידין לחלוטין לאחר הפשרתו מהמקפיא. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Western Blotting כדי לענות על שאלות נוספות כמו, מהם דפוסי הביטוי של חלבונים מעניינים במהלך המיטוזה בהשוואה לאינטרפאזה? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור ביוגנזה של סרטן במודלים של תרביות תאים אנושיים, ולהשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי לזהות את הפונקציות הקשורות למחזור התא של חלבונים מעניינים.

אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים כמו פרפורמלדהיד ו-DAPI עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.