מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

אנו חוקרים כיצד תאים מתחלקים מעבירים את הכרומוזומים שלהם בנאמנות במהלך מיטוזה, תוך התמקדות במכונות המולקולריות ובמנגנונים שמבטיחים הפרדה מדויקת של הכרומוזומים. אנחנו מסנכרן תאים כדי לחקור תהליכים מולקולריים שמשתנים עם מחזור התא. ללא שיטות אלו, שינויים מרכזיים היו מוסתרים באוכלוסיית תאים לא מסונכרנת.

בהשוואה לשיטות סינכרון אחרות, עצירה אלפא-פקטור במוטנטים של BAR1 מספקת עיכוב G1 נקי והפיך, ומאפשר לנו לעקוב אחר תרבית שמרים שלמה המתקדמת בסינכרון לאורך המחזור. העבודה שלנו חושפת מיקום דינמי של חלבונים ושינויים בפעילות לאורך מחזור התא, ומאירה תהליכים מיטוטיים מרכזיים, כמו הפרדת כרומוזומים ושמירה על הציר. כדי להתחיל, החריסו שמרים לתוך 25 מיליליטר של מדיום YPAD, ודגרו את השמרים במהלך הלילה כדי להגיע לצפיפות אופטית של 600 ננומטר בין 0.5 ל-2.0.

מדלל את תאי השמרים לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.5. הוסף גורם אלפא לתרבית כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. ב-2.5 עד 3.5 שעות לאחר הוספת פקטור אלפא, יש לספור את אחוז התאים הלא-נבוטים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את עצירת התאים.

לאחר מכן, סובבים את התרבית בצנטריפוגה ב-3,000 גרם למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס. שפוך בזהירות את הסופרנטנט כדי להסיר את גורם האלפא. החזירו את כדור התאים ל-25 מיליליטר של YPAD המכילים 1% דימתיל סולפוקסיד כדי לשטוף את התאים.

העבר את כדור התא לצינור חדש וחזור על השטיפות פעמיים נוספות לסך הכל של שלוש שטיפות כדי להסיר כל גורם אלפא שנותר. לאחר מכן, הוסף YPAD לתאים השטופים כדי להביא את הנפח הסופי ל-25 מיליליטר, ולהעביר את המתלה לבקבוק חדש להמשך דגירה או שימוש. אסוף את דגימת נקודת הזמן של דקה אפס מיד לאחר השחרור וקבע את הדגימה.

ב-60 דקות לאחר השחרור, יש להעריך את הסינכרון של אוכלוסיית התאים תחת מיקרוסקופ אור. אם רוצים, להוסיף שוב את גורם האלפא 60 דקות לאחר השחרור לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר כדי לחסום את ההתקדמות למחזור התא הבא. המשך לאסוף דגימות לפי נקודת זמן כל 15 דקות עד 180 דקות או למשך כל זמן שצריך.

כדי לקבע את תאי השמרים, צנטריפוגה מיליליטר של תרבית למשך דקה במהירות מקסימלית. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין. לאחר מכן, החזירו את הכדור ל-500 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע ודגרו בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש עשרה דקות.

לאחר הצנטריפוגה של התאים הקבועים, שאיפת הסופרנטנט והשתה את הכדור ב-500 מיקרוליטר של בופר פספט אשלגן 0.1 מולר ב-pH 6.4. לפני ההדמיה, צנטריפוגה את התאים הקבועים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך דקה במהירות מקסימלית. לאחר שהסופרנטנט נשיפה, החזירו את הכדור ל-10 עד 100 מיקרוליטרים של טריטון, DAPI ותמיסת סורביטול.

פיפטה כ-0.8 מיקרוליטר של מתלה התא המוצבע מונח ישירות על מרכז כיסוי נקי. השתמש בקצה פיפטה כדי לפזר בעדינות את הטיפה לאזור עגול בגודל של כ-1 סנטימטר רבוע. הניחו את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופיה.

בעזרת קימווייפ, לחצו בעדינות סביב קצוות הכיסוי כדי לפזר את הדגימה באופן שווה. לאחר מכן, אטמו את קצוות הכיסוי עם לק לציפורניים כדי לאבטח את הדגימה. קח את השקופית המוכנה למיקרוסקופ המצויד בהגדלה של פי 60, מטרה לטבילה בשמן בצמצם מספרי 1.42, ומערך לייזר ומסנן אדום, ירוק, כחול ואדום רחוק.

למקד את המיקרוסקופ על תאי השמרים שמחוברים לכיסוי. לאחר המיקוד, כוונן את הגדרות החשיפה לכל ערוץ פלואורסצנציה כדי להגיע ליחס אות לרעש של לפחות שלושה לאחד. כוונו את הגדרות הרכישה כדי לאסוף 14 עד 20 תמונות z-stack כאשר כל פרוסה מרוחקת ב-0.2 מיקרומטר, ומכסה עומק z כולל של שניים עד ארבעה מיקרומטרים.

במיקרוסקופים המצוידים במודולי עיבוד לאחר מכן, בחרו אפשרויות דה-קונבולוציה והקרנה מהירה לכל תמונת z-stack. לרכוש ערימות z של הדגימה, וללכוד מספיק תמונות כדי לתעד כ-100 עד 200 תאי שמרים לכל תנאי ניסוי או נקודת זמן. לניתוח, פתח את התמונות המוקרנות בתוכנת ImageJ.

כוון את הבהירות והניגודיות של כל ערוץ פלואורסצנציה כדי לשפר את הראות. כדי לנתח התקדמות מחזור התא, סופר 100 תאים לכל נקודת זמן וסווג אותם כמכילים גרעין אחד או שניים. כדי לחשב את אחוז התאים המציגים נקטת Stu2-GFP, תקן את הגדרות בהירות הערוץ הירוק בכל התמונות.

לספור תאים שמראים פנקטות Stu2-GFP שמתמקדות עם פונקטות Spc110-mCherry כחיוביות למיקום קינטוכור. לאחר מכן, כדי לכמת את עוצמת הפונקטה של החלבון, השתמשו בכלי הבחירה החופשית כדי לתאר את אזור העניין סביב האות. הוסף את הבחירה למנהל אזור העניין על ידי לחיצה על T או בחירה באפשרות מתפריט מנהל ROI.

במנהל ה-ROI, לחץ על 'מדידה' כדי לחשב את עוצמת הפונקטה. כדי להמחיש שינויים לאורך זמן, צייר את העוצמה הממוצעת עם טווחי ביטחון של 95% לכל נקודת זמן. לספור כ-100 תאים לכל מצב.

בתאי G1 עצורים, Stu2-GFP התמקם בנקטום פרוקסימלי יחיד עם קטב ציר עם אות מפוזר נוסף לאורך מיקרוטובולים ציטופלזמיים. ב-60 דקות לאחר השחרור, Stu2-GFP התמקם כשני פונקטות סמוכים לעמודי ציר כפולים המסומנים על ידי Spc110-mCherry. ב-90 דקות, במהלך האנפאזה, Stu2-GFP הופיע הן ליד קטבי הציר והן לאורך מיקרוטובולים החוצים את הציר היחיד.

לאחר יציאה מיטוטית, בדקה 120, Stu2-GFP הופיע מחדש על מיקרוטובולים אסטרליים בציטופלזמה. כימות גילה כי עוצמת Stu2-GFP ליד קוטבי הציר עלתה במהלך מיטוזה מוקדמת, הגיעה לשיא לפני האנאפאז וירדה לאחר מכן. אחוז התאים הבינוקליטיים הגיע לשיא של כ-90 דקות, מה שמעיד על כניסה מסונכרנת לאנפאזה.