כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו, היא לפתח גישה כימו-אנזימטית מודולרית לסינתזה של N-גליקנים על ידי בניית מיקרו-מערך גליקן חדש על שקופית זכוכית מצופה תחמוצת אלומיניום לזיהוי קשירה הטרוגליקנית של נוגדנים ל-HIV. שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בגליקוביולוגיה לזיהוי גליקנים ספציפיים לנגיף התא להתפתחות רבה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא זיהוי קשירה חלשה וזיהוי תערובת של סוכרים הנקשרים לחלבון כגון נוגדנים מחולה HIV.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחנה של זיהומי שפעת מכיוון שקטבוליסט סיאלי מתבטא על דרכי הנשימה האנושיות, תאי אפיתל ובעיות נפוצות בזמן הסימפטומים. לכן, גליקוריי יהיה כלי אידיאלי לקביעת הספציפיות של תת-סוגים פראיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק מבפנים את הספציפיות של הגליקן של נוגדנים ל-HIV, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון, אבחון של סוגי סרטן שונים על סמך דפוס הקישור של נוגדנים בסרום אנושי לאנטיגנים ספציפיים בסרום אנושי המודפסים על פני השטח.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 2-5 מיקרומול של גליקן שהוכן בעבר ובקבוק תחתון עגול של חמישה מיליליטר. הוסף מוט ערבוב מגנטי לבקבוק וכסה אותו במחיצת גומי. הוסף לבקבוק 400 מיקרוליטר DMF מיובש טרי ו-10-25 מיקרומול של מקשר החומצה הפוספונית.

לאחר מכן, מערבבים את תערובת התגובה בחום של 800 סל"ד למשך חמש שעות. לאחר השלמת התגובה, אידוי הממס באמצעות מאייד סיבובי בלחץ ואקום של 5 עד 10 מיליבר ו-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ממיסים את תערובת התגובה המיובשת ו -0.5 מיליליטר מים ומעמיסים על גבי מיטת ג'ל פוליאקרילאמיד.

יש להוציא את המוצרים באמצעות מים ולאסוף שברים של מיליליטר עד שניים. כדי לבדוק את השברים שנאספו על ידי TLC, זהו כל שבר על צלחת TLC וטבלו את הצלחת ב-0.25 טוחנות Cerium Ammonium Molybdate. מחממים את הצלחת המוכתמת בעזרת פלטה חמה כדי לדמיין את המוצר.

לאחר שילוב המוצר המכיל שברים והקפאת התמיסה יש לבצע ביופוליזציה לקבלת המוצר הרצוי כאבקה לבנה. לאחר מכן, ממיסים את המוצר המיובש בשני מיליליטר מים ומוסיפים פלדיום הידרוקסיד. חבר בלון המכיל מימן לבקבוק וערבב את תערובת התגובה ב-800 סל"ד למשך 15 שעות באטמוספירת מימן.

לאחר השלמת התגובה, סנן את התערובת דרך מיטת Celite ושטוף עם שני מיליליטר מתנול ושני מיליליטר מים מזוקקים דה-יונים. לאחר מכן, אידוי הממס באמצעות מאייד סיבובי בלחץ ואקום של 300 מיליבר ו-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ממיסים את התערובת הגסה בכמיליליטר מים ומעמיסים אותה על גבי מצע ג'ל פוליאקרילאמיד.

יש לשטוף את המוצר במים ולאסוף שברים של מיליליטר עד שניים. לאחר שילוב המוצר המכיל שברים והקפאת התמיסה יש לבצע ביופוליזציה לקבלת המוצר הרצוי כאבקה לבנה. לאחר שהמוצר יבש, אפיינו אותו על ידי אנימאר וספקטרוסקופיה מסה באמצעות תחמוצת דאוטריום כממס.

לאנודיזציה של פני השטח, הגדר חממה מבוקרת טמפרטורה לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו תמיסת חומצה אוקסלית מימית 0.3 טוחנת שהוכנה בעבר לכוס של 500 מיליליטר המכילה מוט ערבוב מגנטי. הנח מוט פלטינה באורך 10 ס"מ כקתודה לתמיסה.

המשיכו לערבב את החומצה האוקסלית ב-300 סל"ד לאורך כל תהליך האנודיזציה. בתוכנת מעקב המעבדה, לחץ על כפתור ההגדרה ולאחר מכן לחץ על בחירת הפונקציה Sweep Voltage. הגדר את מתח ההתחלה והעצירה ל-25.8 וולט.

מספר הנקודות ל- 100, התאימות לאחת והשהיית הניקוי ל- 1200 אלפיות השנייה. לאחר מכן, לחץ על אישור. מהדק מגלשת זכוכית מצופה אלומיניום הפונה לכיוון הקתודה.

לחץ על כפתור בדיקת ההפעלה וצפה במדידה הנוכחית. לאחר אנודיזציה של פני השטח, שטפו היטב את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים כפולים וטהרו יבש בגז חנקן. אחסן את מגלשת הזכוכית בתא לחות יחסית של 30% עד לשימוש נוסף.

לייצור, הכינו תמיסות של 100 מיקרוליטר מכל הגליקנים החד-ערכיים באתנול גליקול בריכוז של 10 מילי-מולארי. יש לדלל את תמיסות הגליקן עם מאגר הדפסה ליצירת 100 תמיסות מיקרו-מולריות. עבור מחקר ההטרוליגנד, הוסף חמישה מיקרוליטרים של גליקן MAN-5 לחמישה מיקרוליטרים מכל תמיסת גליקן.

העבר את הגליקנים המוכנים לתוך המיקרו-צלחת 384 באר לשלב הדפסת מיקרו-מערך. לאחר הכנסת מיקרו-פלטת על טכנולוגיית מערך המדפסות, הדפס מיקרו-מערכים באמצעות סיכה רובוטית על ידי הפקדת 0.6 ננוליטר של תמיסות הגליקן על כל מגלשת זכוכית מצופה אלומיניום. לאחר מכן הכינו 70 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני PG-9 ומאגר PTSB המכיל 3% BSA.

לאחר מכן הכינו 120 מיקרוליטר של נוגדן פלואורסצנטי משני חמור ואימונוגלובולין G אנטי אנושי ומאגר PBST המכיל 3% BSA בחושך. מערבבים את PG9 ואת נוגדן התג הפלואורסצנטי המשני ביחס של 1:1. לאחר מכן דגרו על הנוגדנים המעורבבים מראש למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, טען מגלשת זכוכית מצופה אלומיניום לתוך תא הדגירה של המגלשה, המחולק ל-16 בארות. מעבירים 100 מיקרוליטר מהנוגדנים המעורבבים מראש למערך הגליקן. לאחר הדגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, הסר את הנוגדנים המעורבבים מראש ממערך הגליקן בעזרת פיפטה ולאחר מכן הסר את תא הדגירה בשקופיות.

שטפו את מגלשת הזכוכית במאגר PBST ובמים נטולי יונים. לאחר מכן סובב יבש את מגלשת הזכוכית בכוח הכבידה פי 2000. לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח התמונות של מיקרו-מערך.

הכנס את המגלשה המיובשת מזכוכית לסורק המערך כשהתכונות המסודרות פונות כלפי מטה. לחץ על תפריט ההגדרות. הגדר את רזולוציית התמונה לחמישה מיקרומטר לפיקסל.

והגדר את אורך הגל ל-635 ננומטר עם PMT 450 והספק ל-100%לחץ על כפתור הסריקה כדי להתחיל לדמות את השקופית. לבסוף, לחץ על סמל הקובץ כדי לשמור את תמונת הסריקה בפורמט TIF לניתוח תמונה. במחקר זה, מגוון רחב של N-גליקנים סונתזו באמצעות אסטרטגיה אנזימטית כימותרפית מודולרית.

כדי להדגים את יעילות האסטרטגיה סונתז מבנה איזומטרי דו-אנטני בשיטות כימו-אנזימטיות. גלקטוזילציה אנזימטית לדו-סוכר 1 ואחריה פוקוסילציה של טריסכריד 2 העניקה את הטטרסכריד 3 הרצוי. לכל סאטילציה והפחתת שינויים סופיים של אבן הבניין שתיים ושלוש, ניתנים לרצות מולקולה ארבע וחמש.

סטריאו-סלקטיבי שלוש O-glycosalyation של מודול 4 של trisaccharide 6 סיפק hexasaccharide 7. ביטול ההגנה והתגובה לפני מודול 5 הניבו dedecasaccharide 9. גילוי גלובלי העניק גליקן 10 שהתאפיין באנימאר וספקטרוסקופיה מסה.

גליקנים המכילים זנב פנטילמין בקצה המפחית שונו עם מקשרים של חומצה פוספונית וחוברו למשטח המצופה זכוכית אלומיניום באמצעות כימיה של פוספיניד. נוגדן מנטרל HIV-1 PG9 נבדק לספציפיות הגליקן שלו באמצעות מערכי הומו והטרוגליקן כדי להדגים לראשונה את חוסר הפעולה שלו עם הטרוגליקנים סמוכים בלולאת V1/V2 של משטח HIV1 PG120. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 24 שעות מקיבוע גליקן לניתוח בטא אם היא בוצעה כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשקופית זכוכית מצופה אלומיניום טרי עבור גליקן 10. להנחת הליך זה הם שקופיות ה-med-techs. ניתן לבצע קביעת קבוע הגוף על מנת לכמת את אינטראקציות הקישור בין פחמימה לחלבון המעניין.

לאחר פיתוח טכניקה זו, היא סללה את הדרך לחוקרים להבין טוב יותר את תפקיד הפחמימות במחלות זיהומיות בקניה ולסייע בפיתוח טיפולים חדשים נגד מחלות. אל תשכח שעבודה עם חומרים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת בגדים, משקפיים ומסכות בעת ביצוע ניסויים.