כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לפתח גישה כימו-אנזימטית מודולרית לסנתזה של N-glycans, באמצעות בנייה של מערך גליקן זעיר (glycan microarray) חדש על גבי שקופית זכוכית מצופה אלומינה, לצורך זיהוי קישור של הטרגליקנים על ידי נוגדני HIV. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של גליקנים (glycobiology) לצורך זיהוי גליקנים ספציפיים לנגיף התא לצורך פיתוח רב יותר. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא היכולת לזהות קישור חלש ולזהות תערובת של סוכרים הנקשרים לחלבון, כגון נוגדן ממטופל HIV.

ההשלכות של טכניקה זו חולשות על אבחון זיהומי שפעת, מכיוון שקטבוליזטורי סיאליים מבוטאים על תאי אפיתל של דרכי הנשימה האנושיות ובעיות אלו נפוצות בזמן התסמינים. לכן, glycoarray יהיה כלי אידיאלי לקביעת הספציפיות של תת-סוגים פראיים. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הספציפיות של גליקנים של נוגדני HIV, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים כגון אבחון של סוגי סרטן שונים, בהסתמך על תבנית הקישור של נוגדני סרום אנושיים כלפי אנטיגנים ספציפיים לסרום אנושי המודפסים על פני השטח.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף 2-5 micromoles של גליקאן שהוכן מראש לבקבוק תחתית עגולה בנפח של five milliliter. יש להוסיף לבקבוק מקל ערבוב מגנטי ולסגור אותו עם ספטום גומי. להוסיף לבקבוק 400 microliters של DMF מיובש טרי ו-10-25 micromoles של הלינקר חומצה פוספונית.

לאחר מכן, ערבבו את תערובת התגובה במהירות של 800 rpm למשך חמש שעות. עם השלמת התגובה, אידו את הממס באמצעות מאיד סיבובי (rotary evaporator) בלחץ ואקום של 5 עד 10 millibar ובטמפרטורה של 40 °C. לאחר מכן, המסו את תערובת התגובה המיובשת ב-0.5 milliliter של מים והעמיסו אותה על גבי שכבת ג'ל פוליאקרילאמיד.

בצע אלוציה של המוצרים באמצעות מים ואסוף פרקציות של מיליליטר אחד עד שניים. כדי לבדוק את הפרקציות שנאספו באמצעות TLC, נקוט כל פרקציה על לוחית TLC וטבול את הלוחית ב-0.25 molars Cerium Ammonium Molybdate. חמם את הלוחית הצבועה באמצעות פלטה חשמלית כדי להנמיך את המוצר.

לאחר איחוד הפראקציות המכילות את המוצר, הקפיאו את התמיסה באמצעות lyophilize כדי לקבל את המוצר הרצוי כאבקה לבנה. לאחר מכן, המיסו את המוצר המיובש בשני מיליליטר של מים והוסיפו Palladium Hydroxide. חברו בלון המכיל מימן לבקבוק והערבבו את תערובת התגובה ב-800 rpm למשך 15 שעות תחת אטמוספירה של מימן.

עם השלמת התגובה, סננו את התערובת דרך מצע Celite ושטפו בשני מיליליטר של methanol ובשני מיליליטר של מים מזוקקים ודה-יוניים. לאחר מכן, האדו את הממס באמצעות rotary evaporator בלחץ ואקום של 300 millibar ובטמפרטורה של 40 °C. לאחר מכן, המסו את תערובת הגולמי בכשמיליליטר אחד של מים וטענו אותה על גבי מצע של ג'ל polyacrylamide.

בצע אלוציה של המוצר באמצעות מים ואסוף פרקציות של 1 עד 2 מיליליטר. לאחר איחוד הפרקציות המכילות את המוצר והקפאת התמיסה, בצע ליאופיליזציה כדי לקבל את המוצר הרצוי כבסיס אבקה לבנה. ברגע שהמוצר יבש, אפיין אותו באמצעות NMR ומסספקטרומטריה תוך שימוש ב-Deuterium Oxide כממס.

עבור אנודזציה של פני השטח, הגדרו אינקובטור בבקרה טמפרטורלית ל-4 °C. לאחר מכן, העבירו תמיסת חומצה אוקסלית מימית 0.3 M שהוכנה מראש לכוס כימית בנפח 500 mL המכילה מקל ערבול מגנטי. מקמו מוט פלטינה באורך 10 cm בתוך התמיסה כקתודה.

המשיכו לערבב את חומצה האוקסלית ב-300 rpm לאורך כל תהליך האנודיזציה. בתוכנת ה-lab tracer, לחצו על כפתור ה-setup ולאחר מכן לחצו על בחירת הפונקציה Sweep Voltage. הגדירו את מתח ההתחלה והסיום ל-25.8 volts.

הגדירו את מספר הנקודות ל-100, את הציות (compliance) ל-1, ואת השהיית הסריקה (sweep delay) ל-1200 milliseconds. לאחר מכן, לחצו על אישור. חבקו זכוכית עם ציפוי אלומיניום כך שתפנה לעבר הקתודה.

לחצו על כפתור הרצת הבדיקה ועקבו אחר המדידה הנוכחית. לאחר האנודיזציה של הפנין, שטפו את תגית הזכוכית ביסודיות במים מזוקקים פעמיים וייבשו אותה באמצעות זרם של גז חנקן. אחסנו את תגית הזכוכית בתא בעל 30% relative humidity עד לשימוש הבא.

עבור הייצור, הכין תמיסות של 100 µL של כל הגליקנים החד-ערכיים באתנול גליקול בריכוז של 10 mM. דלל את תמיסות הגליקנים בעזרת תמיסת באפר להדפסה כדי להכין תמיסות בריכוז של 100 µM. עבור מחקר ההטרוליגנד (Heteroligand Study), הוסף 5 µL של גליקן MAN-5 ל-5 µL מכל תמיסת גליקן.

העבירו את הגליקנים שהוכנו לפלטת מיקרו של 384 בארות לצורך שלב ההדפסה של המיקרו-מערך. לאחר הכנסת פלטת המיקרו למכשיר הדפסת המערכים, הדפיסו את המיקרו-מערכים באמצעות פין רובוטי על ידי השקעת 0.6 nanoliters של תמיסות הגליקן על כל שקופית זכוכית מצופה אלומיניום. לאחר מכן, הכינו 70 microliters של נוגדן ראשוני PG-9 ותמיפת PTSB המכילה 3%BSA.

לאחר מכן, הכין בחושך 120 מיקרוליטר של נוגדן משני מסומן פלואורסצנטיתי מסוג Donkey and Anti-human Immunoglobulin G וחוצץ PBST המכיל 3% BSA. ערבב את PG9 ואת הנוגדן המשני המסומן פלואורסצנטיתי ביחס של 1:1. לאחר מכן, דגור את הנוגדנים שערבבת מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הכניסו למסגרת דגירת השקופיות, המחולקת ל-16 בארות, שקופית זכוכית מצופה אלומיניום. העבירו 100 µL של הנוגדנים המעורבבים מראש למערך הגליקן. לאחר דגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך 16 שעות, הסירו את הנוגדנים המעורבבים מראש ממערך הגליקן באמצעות פיפט, ולאחר מכן הסירו את מסגרת דגירת השקופיות.

שטוף את פלסת הזכוכית בבופר PBST ובמים דה-יוניים. לאחר מכן, ייבש את פלסת הזכוכית באמצעות סבב (spin dry) ב-2000 times gravity. לאחר מכן, פתח את התוכנה לניתוח תמונות מיקרו-מערכים (microarray).

הכנס את השקופית הזכוכית המיובשת לסורק המערך כאשר התכונות המערכיות פונות כלפי מטה. לחץ על תפריט ההגדרות. הגדר את רזולוציית התמונה ל-5 µm לפיקסל.

הגדירו את אורך הגל ל-635 nanometers עם PMT 450 ואת העוצמה ל-100%. לחצו על כפתור הסריקה (scan) כדי להתחיל בדימות של הפיתח. לבסוף, לחצו על אייקון הקובץ כדי לשמור את תמונת הסריקה בפורמט TIF לצורך ניתוח תמונה. במחקר זה, מגוון רחב של N-Glycans סונתז באמצעות אסטרטגיה כימו-אנזימטית מודולרית.

כדי להדגים את יעילות האסטרטגיה, סונתזה מבנה איזומטרי דו-אנטנרי בשיטות כימו-אנזימטיות. גלקטוזילציה אנזימטית עבור דיסכריד 1, ולאחריה פוקוזילציה של טריסכריד 2, הניבו את הטטראסכריד 3 הרצוי. פר-אצטילציה ומודיפיקציות של הקצה המצמצם של אבני הבניין שתיים ושלוש, הניבו את המולקולות ארבע וחמש הרצויות.

O-גליקוזילציה סטריאו-סלקטיבית של מודול ארבעה של טריסכריד six הניבה את הקססכריד seven. הסרה של קבוצות הגנה ותגובה לפני מודול חמש הניבו את הדדקסכריד nine. הסרה גלובלית של קבוצות הגנה הניבה את הגליקן 10, שאופיין באמצעות NMR ומס-ספקטרוסקופיה.

גליקנים המכילים זנב Pentylamine בקצה המפריע (reducing end) שונו באמצעות מקשרי חומצה פוספונית וחוברו למשטח זכוכית מצופה אלומיניום באמצעות כימיית פוספיניד. נוגדן נטרול רחב של HIV-1, מסוג PG9, נסרק לבדיקת הספציפיות שלו לגליקנים באמצעות מערכי הומו-הטרוגליקנים כדי להדגים לראשונה את האינטראקציה שלו עם הטרוגליקנים סמוכים בלולאת V1/V2 על פני השטח של HIV1 PG120. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך 24 שעות, החל מקיבוע הגליקנים ועד לאנליזת בטא, במידה והיא בוצעה כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בנחית זכוכית מצופה אלומיניום שעבר אנודייז טרי עבור Glycan 10. לצורך ביצוע פרוצדורה זו משתמשים בנחית של טכנאי מעבדה. ניתן לבצע קביעה של קבוע הגוף כדי לכמת את אינטראקציות הקישור בין הפחמימה לחלבון הנחקר.

לאחר פיתוח טכניקה זו, היא סללה את הדרך עבור חוקרים להבין טוב יותר את תפקידם של פחמימות במחלות זיהומיות בקניה ולסייע בפיתוח טיפולים חדשים נגד מחלות. זכרו כי עבודה עם חומרים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי מגן, משקפיים ומסכות בעת ביצוע ניסויים.