Name: כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: למד שיטה כימו-אנזימטית מודולרית לסינתזת N-glycans עבור מערכי גליקן בזכוכית מצופה אלומיניום. השיטה מאפשרת זיהוי קשרים חלשים של נוגדנים HIV ויישומים באבחון שפעת וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה את חטיבת טכנולוגיות סרט דק, מרכז מחקר טכנולוגיית כלי נגינה (ITRC), לאומי מוחל מעבדות מחקר, שער המזרח, טייוואן. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע (מענק. לא. רוב 105-0210-01-13-01), אקדמיה Sinica.

<ol><li>Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centralized+modularity+of+N-linked+glycosylation+pathways+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells.</a> PloS one. 4, e7317(2009).</li>
<li>Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Role+of+an+N-Linked+Glycan+on+the+Surface+Antigen+of+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Modulating+Virus+Sensitivity+to+Broadly+Neutralizing+Antibodies+Against+the+Receptor+and+Coreceptor+Binding+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.virol%22%5BJournal%5D)">Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites.</a> J.virol. 90, 829-841 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Strategy+for+the+Chemoenzymatic+Synthesis+of+Asymmetrically+Branched+N-Glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans.</a> Science. 341, 379-383 (2013).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Chemoenzymatic+Synthesis+of+an+N-glycan+Isomer+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library.</a> Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).</li>
<li>Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+Protein-Directed+Glycosylation+of+Native+Cleaved+HIV-1+Envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope.</a> J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).</li>
<li>Behrens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+Antigenic+Effects+of+Individual+Glycan+Sites+of+a+Trimeric+HIV-1+Envelope+Glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein.</a> Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).</li>
<li>Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+development+of+an+HIV-1+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Challenges in the development of an HIV-1 vaccine.</a> Nature. 455, 613-619 (2008).</li>
<li>Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Strategies+Targeting+HIV+Glycans+in+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design.</a> Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).</li>
<li>Wang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+carbohydrate+Antigens+for+HIV+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Glycosylation+on+an+Immunodominant+Region+in+the+V1V2+Variable+Domain+of+the+HIV-1+Envelope+gp120+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).</li>
<li>Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrates+of+human+Immunodeficiency+Virus.+Structures+of+Oligosaccharides+Linked+to+the+Envelope+Glycoprotein+120%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120.</a> The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).</li>
<li>Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+Structure+of+A+Native%2C+Fully+Glycosylated%2C+Cleaved+HIV-1+Envelope+Trimer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer.</a> Science. 351, 1043-1048 (2016).</li>
<li>Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+GlycanMicroarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Natural GlycanMicroarrays.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).</li>
<li>Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+Spots+in+Functional+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Sweet Spots in Functional Glycomics.</a> Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).</li>
<li>Dotsey, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Throughput+Protein+Microarray+Approach+to+Classify+HIV+Monoclonal+Antibodies+and+Variant+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens.</a> PLoS One. 10, e0125581(2015).</li>
<li>Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Development+of+Glycan+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">New Development of Glycan Arrays.</a> Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).</li>
<li>Scurr, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterization+of+Carbohydrate+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays.</a> Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+Covalent+Glycan+Array+for+Ligand+Profiling+of+Diverse+Glycan+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+Array+on+Aluminum+Oxide-Coated+Glass+Slides+Through+Phosphonate+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1, 773-783 (2016).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Convergent+Synthesis+of+Bi-%2C+Tri-%2C+and+Tetra-Antennary+Complex+Type+N-Glycans+and+Their+HIV-1+Antigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+synthesis+of+N-Glycans+and+Arrays+for+the+Hetero-Ligand+Binding+Analysis+of+HIV+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies.</a> Nat Chem. 8, 338-346 (2016).</li>
<li>McLellan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Hiv-1+gp120+V1%2FV2+Domain+with+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Nature. 480, 336-343 (2011).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Recognition+of+the+HIV-1+Trimer+by+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).</li>
<li>Willis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Antibody+HCDR3s+from+HIV-Native+Donors+Presented+on+a+PG9+Neutralizing+Antibody+Background+Mediate+HIV+Neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5499/performing-1d-thin-layer-chromatography">Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>de Castro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+approach+to+the+automation+of+analytical+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Automat+Chem%22%5BJournal%5D)">A useful approach to the automation of analytical processes?</a> J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5634/introduction-to-mass-spectrometry">Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="https://classes.soe.ucsc.edu/bme210/Spring07/GenePix_Pro_6.0_Manual_RevL.pdf">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial</a>. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).</li>
<li>GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/">http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</a> (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מחלקה של HIV-1 bNAbs כולל PG9, PG16 ו PGTs 128, 141-145 דווחו להיות חזק מאוד בהשמדת 70-80% של מחזורי מבודד HIV-1. Epitopes של bNAbs האלה מאוד נשמרים בין המשתנים של כל הקבוצה HIV-1 מ', ולכן הם להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור חיסון HIV שמעודדים נטרול נוגדנים23,24,25 . כחלק מהמאמצים הנמשכים שלנו לזהות את epitopes glycan של HIV-1 בהרחבה נטרול נוגדנים, סינתזה כימית, אנזימטי של פאנל של מנוז גבוהה היברידית, סוג מורכב oligosacchari...

N- glycans על glycoproteins covalently מקושרים של אספרגין (Asn) שאריות של sequon Asn-Xxx-Ser/חמישי הקונצנזוס, אשר משפיעים על מספר תהליכים ביולוגיים כגון זיהוי חלבונים קונפורמציה, antigenicity, המסיסות, לקטין 1 , 2. סינתזה כימית של N-oligosaccharides מקושר מייצג סינתטי אתגר משמעותי בשל הטרוגניות מיקרו מבני ענק ואדריכלות מסועף מאוד שלהם. בחירה זהירה של הגנה על קבוצות לכוון תגובתיות של אבני הבניין, להשגת סלקטיביות מרכזי anomeric, ועל שימוש נכון יזם / activator(s) הם רכיבי מפתח של סינתזה של oligosaccharides מורכבים. כדי לפתור בעיה זו של מורכבות, כמות גדולה של עבודה כדי לקדם סינתזה - glycan Nדווח לאחרונה3,4. למרות הגישות האלה חזקים, מציאת שיטה יעילה עבור הכנת מגוון רחב של N- glycans שרידים (~ 20,000) תואר אתגר.
קצב מוטציה מהירה של HIV-1 כדי להשיג את מגוון גנטי מקיף ואת יכולתו לברוח מן לנטרל תגובת נוגדנים, הוא בין האתגרים הגדולים ביותר כדי לפתח את החיסון בטוח, אמצעי מניעה נגד HIV-15,6 , 7. אחד טקטיקה יעילה HIV משתמש כדי למנוע את התגובה החיסונית של המארח הוא גליקוזילציה post-translational של המעטפה gp120 גליקופרוטאין עם מגוון N-מקושרים glycans נגזר מארח גליקוזילציה מכונות8, 9. דו ח זה התבצעה לגבי ניתוח מדויק של גליקוזילציה gp120 HIV-1 monomeric רקומביננטי מתאי 293T כליה אנושית עובריים (HEK) מרמז על המופע של microheterogeneity מבניים עם תבנית ספציפית תא אופיינית10 , 11 , 12. לפיכך, הבנה specificities glycan של HIV-1 bNAbs דורש טוב מאופיין gp120 הקשורים N- glycan מבנים בכמות מספקת לצורך ניתוח.
גילוי glycan microarray טכנולוגיה בתנאי חקר מבוססות תפוקה גבוהה של specificities של מגוון רחב של חלבונים פחמימות-כריכה, וירוסים/בקטריאלי adhesins, רעלים, נוגדנים lectines13,14 . הסידור glycans שיטתית בתבנית ערוכים מבוססי שבב יכול לקבוע זיקה נמוכה בעייתי אינטראקציות חלבון-glycan דרך המצגת multivalent15,16,17,18. סידור glycan מבוססי שבב זה מופיע בנוחות לחקות ביעילות תאים תאים ממשקים. כדי להעשיר את הטכנולוגיה להתגבר על הבעיה לא אחידה המשויך מערך קונבנציונאלי תבניות, הקבוצה שלנו פותח לאחרונה מערך glycan שקופית הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) באמצעות glycans הסתיימה חומצה phosphonic כדי לשפר את עוצמת האות, הומוגניות, רגישות19,20.
כדי לשפר את ההבנה הנוכחית על glycan epitopes של לאחרונה מבודד HIV-1 בהרחבה נטרול נוגדנים (bNAbs), פיתחנו אסטרטגיה מודולרי יעילה במיוחד עבור הכנת מערך רחב של N-מקושרים glycans21 ,22 יודפס על ACG שקופית (ראה איור 1). ירידה לפרטים מחקרים פרופיל של HIV-1 bNAbs על מערך ACG הציע זיהוי חריג הטרו-glycan מחייב התנהלות חזק מאוד bNAb PG9 שהיה מבודד HIV נגוע יחידים23,24,25.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>אנהידריד אצטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי נטול מים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>בורון טריפלואוריד אתיל אתראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>109637</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>ביו-ג'ל P2 פוליאקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-1, 4 Galactosyl transferases מחלב בקר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיית BioDot Cartesion עם סיכה רובוטית SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סריום אמוניום מוליבדט</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>סריום אמוניום חנקתי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית נקייה&nbsp;</td><td>שוט&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine-5&prime;-monophospho-N-acetylneuraminic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>Deuterated</td><td>Chloroform Sigma Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 Conjugated</td><td>Jackson Immuno Research, USA</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>דיאתילאמינוגופרית טריפלואוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>דימתילפורממיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>אקרוס אורגני</td><td>107211</td><td></td></tr><tr><td>תאי דגירה של שקופיות מסגרת</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5'- מלח דיסודיום דיפוספו-B-L-פוקוז&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer תוכנה 2.0&nbsp;</td><td></td><td></td><td>סעיף 4 של קורא הפרוטוקול</td></tr><tr><td>GenePix Pro 4300A (ניתוח תמונות מיקרו-מערך)</td> <td>התקנים מולקולריים</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>תוכנת GraphPad Prism (עיבוד תמונה)</td> <td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr> <tr><td>ליתיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>N-בוטנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אוקסלית</td><td>אקרוס אורגני</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>פלדיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>פירידין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>P-טולואן חומצה סולפונית מונוהידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>כסף טריפלטה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>2923286</td><td></td></tr><tr><td>סודיום ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>144558</td> נתרן סיגמא אולדריץ' 7647145 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>נתרן</td></tr><tr><td> מימן פחמתי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מתוקסיד&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>טולואן&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>N/A</td><td>דרגה טהורה במיוחד</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Amresco</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של n- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן hiv פרופיל

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

אנו מציגים דרך יעילה במיוחד עבור הכנה מהירה של מגוון רחב של N-מקושרים oligosaccharides (מוערך יעלה על 20,000 מבנים) אשר נמצאים בדרך כלל על אדם glycoproteins. כדי להשיג את הגיוון מבניים הרצוי, האסטרטגיה החל הסינתזה כימותרפיה-אנזימטי של שלושה סוגים של מודולים פלואוריד oligosaccharyl, ואחריו שלהם stepwise glycosylations α-סלקטיבית של 3-O ו 6-O עמדות של מנוז שאריות trisaccharide ליבה משותפת שיש חיבור אמיתי מכריע β-mannoside. בהמשך קשרנו את N- glycans השטח של שקופיות זכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) כדי ליצור מערך מעורב קוולנטיות לניתוח של הטרו-ליגנד אינטראקציה עם נוגדן HIV. בפרט, הקלד התנהגות מחייב שזה עתה מבודד HIV-1 נטרול בהרחבה נוגדנים (bNAb), PG9, לתערובת של האיש צפופים5GlcNAc2 (אדם5) ומורכב 2, 6-di-sialylated דו-antennary N- glycan (SCT ) על מערך ACG, פותח שדרה חדש כדי להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור פיתוח החיסון HIV. בנוסף, מערך ACG שלנו מגלם כלי רב עוצמה כדי ללמוד אחרים נוגדנים HIV להתנהגות הטרו-ליגנד מחייב.

אסטרטגיה כימותרפיה-אנזימטי מודולרי לסינתזה של מגוון רחב של N -glycans מוצג באיור1. האסטרטגיה היא מבוססת על העובדה כי ניתן ליצור גיוון בהתחלה על ידי כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של המודולים חשוב שלוש, ואחריו את mannosylation ספציפיים α-ה 3-O ו/או 6-O המיקום של השאריות מנוז המשותפים trisaccharide הליבה של N- glycans. בהתחשב המגוון מבנית של bi - tri-, סוג מורכב טטרה-antennary N- glycan מבנים, אנו מאמינים כי ערכה של תורמים...

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לפתח גישה כימו-אנזימטית מודולרית לסנתזה של N-glycans, באמצעות בנייה של מערך גליקן זעיר (glycan microarray) חדש על גבי שקופית זכוכית מצופה אלומינה, לצורך זיהוי קישור של הטרגליקנים על ידי נוגדני HIV. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של גליקנים (glycobiology) לצורך זיהוי גליקנים ספציפיים לנגיף התא לצורך פיתוח רב יותר. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא היכולת לזהות קישור חלש ולזהות תערובת של סוכרים הנקשרים לחלבון, כגון נוגדן ממטופל HIV.ההשלכות של טכניקה זו חולשות על אבחון זיהומי שפעת, מכיוון שקטבוליזטורי סיאליים מבוטאים על תאי אפיתל של דרכי הנשימה האנושיות ובעיות אלו נפוצות בזמן התסמינים. לכן, glycoarray יהיה כלי אידיאלי לקביעת הספציפיות של תת-סוגים פראיים. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הספציפיות של גליקנים של נוגדני HIV, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים כגון אבחון של סוגי סרטן שונים, בהסתמך על תבנית הקישור של נוגדני סרום אנושיים כלפי אנטיגנים ספציפיים לסרום אנושי המודפסים על פני השטח.כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף 2-5 micromoles של גליקאן שהוכן מראש לבקבוק תחתית עגולה בנפח של five milliliter. יש להוסיף לבקבוק מקל ערבוב מגנטי ולסגור אותו עם ספטום גומי. להוסיף לבקבוק 400 microliters של DMF מיובש טרי ו-10-25 micromoles של הלינקר חומצה פוספונית.לאחר מכן, ערבבו את תערובת התגובה במהירות של 800 rpm למשך חמש שעות. עם השלמת התגובה, אידו את הממס באמצעות מאיד סיבובי (rotary evaporator) בלחץ ואקום של 5 עד 10 millibar ובטמפרטורה של 40 °C. לאחר מכן, המסו את תערובת התגובה המיובשת ב-0.5 milliliter של מים והעמיסו אותה על גבי שכבת ג'ל פוליאקרילאמיד.בצע אלוציה של המוצרים באמצעות מים ואסוף פרקציות של מיליליטר אחד עד שניים. כדי לבדוק את הפרקציות שנאספו באמצעות TLC, נקוט כל פרקציה על לוחית TLC וטבול את הלוחית ב-0.25 molars Cerium Ammonium Molybdate. חמם את הלוחית הצבועה באמצעות פלטה חשמלית כדי להנמיך את המוצר.לאחר איחוד הפראקציות המכילות את המוצר, הקפיאו את התמיסה באמצעות lyophilize כדי לקבל את המוצר הרצוי כאבקה לבנה. לאחר מכן, המיסו את המוצר המיובש בשני מיליליטר של מים והוסיפו Palladium Hydroxide. חברו בלון המכיל מימן לבקבוק והערבבו את תערובת התגובה ב-800 rpm למשך 15 שעות תחת אטמוספירה של מימן.עם השלמת התגובה, סננו את התערובת דרך מצע Celite ושטפו בשני מיליליטר של methanol ובשני מיליליטר של מים מזוקקים ודה-יוניים. לאחר מכן, האדו את הממס באמצעות rotary evaporator בלחץ ואקום של 300 millibar ובטמפרטורה של 40 °C. לאחר מכן, המסו את תערובת הגולמי בכשמיליליטר אחד של מים וטענו אותה על גבי מצע של ג'ל polyacrylamide.בצע אלוציה של המוצר באמצעות מים ואסוף פרקציות של 1 עד 2 מיליליטר. לאחר איחוד הפרקציות המכילות את המוצר והקפאת התמיסה, בצע ליאופיליזציה כדי לקבל את המוצר הרצוי כבסיס אבקה לבנה. ברגע שהמוצר יבש, אפיין אותו באמצעות NMR ומסספקטרומטריה תוך שימוש ב-Deuterium Oxide כממס.עבור אנודזציה של פני השטח, הגדרו אינקובטור בבקרה טמפרטורלית ל-4 °C. לאחר מכן, העבירו תמיסת חומצה אוקסלית מימית 0.3 M שהוכנה מראש לכוס כימית בנפח 500 mL המכילה מקל ערבול מגנטי. מקמו מוט פלטינה באורך 10 cm בתוך התמיסה כקתודה.המשיכו לערבב את חומצה האוקסלית ב-300 rpm לאורך כל תהליך האנודיזציה. בתוכנת ה-lab tracer, לחצו על כפתור ה-setup ולאחר מכן לחצו על בחירת הפונקציה Sweep Voltage. הגדירו את מתח ההתחלה והסיום ל-25.8 volts.הגדירו את מספר הנקודות ל-100, את הציות (compliance) ל-1, ואת השהיית הסריקה (sweep delay) ל-1200 milliseconds. לאחר מכן, לחצו על אישור. חבקו זכוכית עם ציפוי אלומיניום כך שתפנה לעבר הקתודה.לחצו על כפתור הרצת הבדיקה ועקבו אחר המדידה הנוכחית. לאחר האנודיזציה של הפנין, שטפו את תגית הזכוכית ביסודיות במים מזוקקים פעמיים וייבשו אותה באמצעות זרם של גז חנקן. אחסנו את תגית הזכוכית בתא בעל 30% relative humidity עד לשימוש הבא.עבור הייצור, הכין תמיסות של 100 µL של כל הגליקנים החד-ערכיים באתנול גליקול בריכוז של 10 mM. דלל את תמיסות הגליקנים בעזרת תמיסת באפר להדפסה כדי להכין תמיסות בריכוז של 100 µM. עבור מחקר ההטרוליגנד (Heteroligand Study), הוסף 5 µL של גליקן MAN-5 ל-5 µL מכל תמיסת גליקן.העבירו את הגליקנים שהוכנו לפלטת מיקרו של 384 בארות לצורך שלב ההדפסה של המיקרו-מערך. לאחר הכנסת פלטת המיקרו למכשיר הדפסת המערכים, הדפיסו את המיקרו-מערכים באמצעות פין רובוטי על ידי השקעת 0.6 nanoliters של תמיסות הגליקן על כל שקופית זכוכית מצופה אלומיניום. לאחר מכן, הכינו 70 microliters של נוגדן ראשוני PG-9 ותמיפת PTSB המכילה 3%BSA.לאחר מכן, הכין בחושך 120 מיקרוליטר של נוגדן משני מסומן פלואורסצנטיתי מסוג Donkey and Anti-human Immunoglobulin G וחוצץ PBST המכיל 3% BSA. ערבב את PG9 ואת הנוגדן המשני המסומן פלואורסצנטיתי ביחס של 1:1. לאחר מכן, דגור את הנוגדנים שערבבת מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, הכניסו למסגרת דגירת השקופיות, המחולקת ל-16 בארות, שקופית זכוכית מצופה אלומיניום. העבירו 100 µL של הנוגדנים המעורבבים מראש למערך הגליקן. לאחר דגירה בטמפרטורה של 4 °C למשך 16 שעות, הסירו את הנוגדנים המעורבבים מראש ממערך הגליקן באמצעות פיפט, ולאחר מכן הסירו את מסגרת דגירת השקופיות.שטוף את פלסת הזכוכית בבופר PBST ובמים דה-יוניים. לאחר מכן, ייבש את פלסת הזכוכית באמצעות סבב (spin dry) ב-2000 times gravity. לאחר מכן, פתח את התוכנה לניתוח תמונות מיקרו-מערכים (microarray).הכנס את השקופית הזכוכית המיובשת לסורק המערך כאשר התכונות המערכיות פונות כלפי מטה. לחץ על תפריט ההגדרות. הגדר את רזולוציית התמונה ל-5 µm לפיקסל.הגדירו את אורך הגל ל-635 nanometers עם PMT 450 ואת העוצמה ל-100%. לחצו על כפתור הסריקה (scan) כדי להתחיל בדימות של הפיתח. לבסוף, לחצו על אייקון הקובץ כדי לשמור את תמונת הסריקה בפורמט TIF לצורך ניתוח תמונה. במחקר זה, מגוון רחב של N-Glycans סונתז באמצעות אסטרטגיה כימו-אנזימטית מודולרית.כדי להדגים את יעילות האסטרטגיה, סונתזה מבנה איזומטרי דו-אנטנרי בשיטות כימו-אנזימטיות. גלקטוזילציה אנזימטית עבור דיסכריד 1, ולאחריה פוקוזילציה של טריסכריד 2, הניבו את הטטראסכריד 3 הרצוי. פר-אצטילציה ומודיפיקציות של הקצה המצמצם של אבני הבניין שתיים ושלוש, הניבו את המולקולות ארבע וחמש הרצויות.O-גליקוזילציה סטריאו-סלקטיבית של מודול ארבעה של טריסכריד six הניבה את הקססכריד seven. הסרה של קבוצות הגנה ותגובה לפני מודול חמש הניבו את הדדקסכריד nine. הסרה גלובלית של קבוצות הגנה הניבה את הגליקן 10, שאופיין באמצעות NMR ומס-ספקטרוסקופיה.גליקנים המכילים זנב Pentylamine בקצה המפריע (reducing end) שונו באמצעות מקשרי חומצה פוספונית וחוברו למשטח זכוכית מצופה אלומיניום באמצעות כימיית פוספיניד. נוגדן נטרול רחב של HIV-1, מסוג PG9, נסרק לבדיקת הספציפיות שלו לגליקנים באמצעות מערכי הומו-הטרוגליקנים כדי להדגים לראשונה את האינטראקציה שלו עם הטרוגליקנים סמוכים בלולאת V1/V2 על פני השטח של HIV1 PG120. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך 24 שעות, החל מקיבוע הגליקנים ועד לאנליזת בטא, במידה והיא בוצעה כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בנחית זכוכית מצופה אלומיניום שעבר אנודייז טרי עבור Glycan 10. לצורך ביצוע פרוצדורה זו משתמשים בנחית של טכנאי מעבדה. ניתן לבצע קביעה של קבוע הגוף כדי לכמת את אינטראקציות הקישור בין הפחמימה לחלבון הנחקר.לאחר פיתוח טכניקה זו, היא סללה את הדרך עבור חוקרים להבין טוב יותר את תפקידם של פחמימות במחלות זיהומיות בקניה ולסייע בפיתוח טיפולים חדשים נגד מחלות. זכרו כי עבודה עם חומרים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת בגדי מגן, משקפיים ומסכות בעת ביצוע ניסויים.

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

מספר 2'-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על...

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

סרטון זה מדגים טכנולוגיית מערך גליקן מודפס לניתוח נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור בסרום עכברים. הנוגדנים בסרום אינטראקציה עם גליקנים ספציפיים על השבב, אשר אושר על ידי immunostaining ואחריו סריקה פלואורסצנטית.

איתור נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור הדם עם מערך גליקן מודפס

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

עבודה זו מציגה את הפוטנציאל של טכנולוגיית מערך (PGA) glycan המודפס על הניתוח של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים.

מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) היא טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח הרכב גליקנים בדגימות ביולוגיות.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

למד שיטה כימו-אנזימטית מודולרית לסינתזת N-glycans עבור מערכי גליקן בזכוכית מצופה אלומיניום. השיטה מאפשרת זיהוי קשרים חלשים של נוגדנים HIV ויישומים באבחון שפעת וסרטן.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

גלה סרטונים נוספים