פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לשבט מספר RNA מדריכים (guide RNAs) לתוך וקטור CRISPR-concatemer יחיד ולהשיג אלקטרופורציה יעילה מאוד באורגנואידים של מעי עכבר, וזאת כדי להשיג נוקאאוט סימולטני של מספר גנים. שיטה זו יכולה לשפר משמעותית את היעילות של מחקרי אובדן תפקוד (loss of function) על ידי כך שהיא מאפשרת להתגבר על ההשפעה הפוטנציאלית של פיצוי מקבילי. היתרונות המרכזיים של אסטרטגיית ה-CRISPR-concatemer שלנו הם הנוחות של שלב שיבוט יחיד והאפשרות לבצע נוקאאוט סימולטני של עד ארבעה גנים שונים.

הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי אלסנדרה מרנדה, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי. השבט של RNA מדריך או gRNAs אל תוך וקטור ה-CRISPR-concatemer מתחיל בתגובה בודדת להסב (anneal) את הגדילים העליונים והתחתונים עבור כל oligonucleotide של gRNA ולפוספוריל את קצותיהם. הכינו את תערובת התגובה על קרח; עבור שלושה concatemers, השתמשו ב-3 µL של gRNAs גדיל עליון, 3 µL של gRNAs גדיל תחתון, 2 µL של T4 DNA ligase buffer, 1 µL של T4 polynucleotide kinase ומים עד לנפח כולל של 20 µL.

ערבבו היטב באמצעות פיפטינג והפעילו את התרמוסייקלר בהגדרות הבאות: 37 °C למשך 30 דקות, 95 °C למשך חמש דקות, ירידה הדרגתית ל-25 °C בקצב של 0.3 °C לדקה, ושמירה ב-4 °C. השלב הבא הוא תגובת ה-Bbs1 shuffling, שבה האוליגונוקלאוטידים של ה-gRNA שעברו אנילינג מוקדם משולבים במיקום המתאים בתוך וקטור הקונקטמר. דללו את תערובת התגובה ביחס של 1:100 במים נקיים מ-DNA ו-RNA כדי להפיק וקטורי קונקטמר של שלושה וארבעה gRNA.

הכינו את תגובות השפלה (shuffling) של Bbs1 על קרח. השתמשו ב-100 nanograms של וקטור CRISPR-concatemer, ב-10 µL של תערובת אוליגו, במיקרוליטר אחד של חוצץ לאנזים הגבלה (restriction enzyme buffer), במיקרוליטר אחד של DTT, במיקרוליטר אחד של ATP, במיקרוליטר אחד של אנזים Bbs1, במיקרוליטר אחד של T7 ligase והוסיפו מים עד לנפח סופי של 20 µL. ערבבו היטב באמצעות פיפטינג, והוסיפו ביקורת שלילית המכילה את הוקטור.

הריצו את התגובות במכשיר תרמוסייקラー (thermocycler), בהתאם להגדרות הבאות: עבור שיבוט של שלושה וארבעה gRNA concatemers, הריצו 50 מחזורים של 37 °C למשך חמש דקות ו-21 °C למשך חמש דקות, השכינו ב-37 °C למשך 15 דקות ולאחר מכן השכינו ב-4 °C למשך זמן בלתי מוגבל. עבור שני gRNA concatemers, השתמשו באותן הגדרות עם 25 מחזורים של השלב הראשון. עם השלמת תגובת ה-Bbs1 shuffling, קחו 11 µL מכל תערובת ליגציה והוסיפו 1.5 µL של exonuclease buffer, 1.5 µL של ATP, 1 µL של DNA exonuclease ומים עד לנפח סופי של 15 µL.

דגרו בטמפרטורה של 37 degree celsius למשך 30 דקות, ולאחריהן בטמפרטורה של 70 degree celsius למשך 30 דקות. לאחר מכן, תערובת התגובה משמשת לטרנספורמציה של חיידקי E.Coli בעלי כשירות כימית, לפי פרוטוקול סטנדרטי. כדי לאשר את נוכחותם של מקטעי gRNA בווקטור ה-CRISPR-concatemer, בחרו מושבות חיידקים באמצעות לולאת דיגום וזריעו כל אחת מהן ב-4 milliliters של מצע LB.

גדלו את השיבוטים למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees celsius במכשיר ניעור אורביטלי. למחרת, הוציאו את ה-DNA באמצעות ערכה ל-plasmid miniprep, בהתאם להוראות היצרן. ערבבו כ-200 nanograms מכל דגימת DNA עם 10 units של EcoR1 וחמש units של BglII בתגובה של 10 microliter.

הוסיפו תערובת תגובה נפרדת עם הווקטור המקורי המתאים כביקורת חיובית להשוואת גודל. דגרו את התגובות ב-37 °C למשך שלוש שעות. הריצו את תגובות העיכול על ג'ל אגרוז 1% במתח של 90V למשך כ-20 דקות.

הדמייו את הג'ל באמצעות מאיר UV (transilluminator) כדי לזהות את השבטים בעלי גודל המקורז (insert) הנכון. כדי לאשר שה-gRNAs שוכפלו במיקום הנכון וכי כתוצאה מכך כל אתרי הזיהוי של Bbs1 אבדו, עכלו את השבטים שנבחרו עם חמש יחידות של Bbs1. כללו תערובת תגובה נפרדת, עם הווקטור המקורי התואם, כביקורת.

דגרו ב-37 degrees celsius למשך שלוש שעות, והריצו את תגובות העיכול על ג'ל agarose בריכוז 1% במתח של 90 volts למשך כ-20 דקות. הדמיאנו את הג'ל באמצעות UV transilluminator כדי לזהות את הווקטורים שלא נחתכו על ידי Bbs1. בעת פיצול אורגנואידים לאלקטרופורציה, זרעו לפחות שישה בארות של פלטת 48 בארות עבור כל טרנסווקציה.

שתלו את האורגנואידים בטיפות של 20 מיקרוליטר של מטריצת בסיס (basement matrix) וגדלו אותם ב-250 מיקרוליטר של מצע WENR בתוספת ניקוטינאמיד לכל באר, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (carbon dioxide) באינקובטור עם לחות. ביום השני, החליפו את מצע ה-WENR בתוספת ניקוטינאמיד ב-250 מיקרוליטר של מצע EGF בתוספת noggin, מעכב GSK3 ומעכב ROCK, ללא אנטיביוטיקה. ביום השלישי, החליפו את מצע האורגנואידים למצע EGF בתוספת noggin, מעכב GSK3, מעכב ROCK ו-1.25% דימטיל סולפוקסיד (dimethyl sulfoxide), ללא אנטיביוטיקה.

ביום הרביעי, השקיפו את כיפות המטריצה של הבסיס באמצעות טיפ של פיפט של 1 מיליליטר והעבירו את האורגנואידים למבחנה של 1.5 מיליליטר. שאבו את התוכן של ארבעה בארות מלוח של 48 בארות למבחנה אחת. פרקו את האורגנואידים באופן מכני לשברים קטנים על ידי שאיבה ופליטה (pipetting up and down) עם פיפט P200 כ-200 פעמים.

סבב במערכת צנטריפוגה ב-600 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הסר את המצע מכל המבחנות ותלה את המשקעים ב-1 mL של פרוטאזה רקומביננטית בדרגת תרבית תאים. הדגר ב-37 °C למשך חמש דקות לכל היותר.

חשוב לנטר בקפידה את הטיפול בפרוטאז, כיוון שהצלחת האלקטרופורציה תלויה בהשגת סספנסיות של תאים המכילה צברים של תאים במקום תאים בודדים. יש לבדוק טיפה של 50 µL מהדגימה תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם עדשה של 4x. צברים של 10 עד 15 תאים הם הרצויים, שכן הדבר מגביר את הישרדות התאים לאחר האלקטרופורציה.

העבירו את תרחיף התאים לפ menutup של 15 מיליליטר בעל קישוריות נמוכה והפסיקו את הדיסוציאציה על ידי הוספה של תשעה מיליליטר של מצע בסיסי ללא אנטיביוטיקה. סובבו במערך צנטריפוגה ב-600 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את העילוי ושחקו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של מצע עם סרום מופחת.

ספרו את מספר התאים באמצעות תא בורק (Burke's chamber); נדרשים לפחות 1x10⁵ תאים לכל תגובת אלקטרופורציה. התחילו את הפרוצדורה על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מצע עם סרום מופחת לשפופרת של 15 מיליליטר המכילה את תרחיף התאים, וסובבו בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את כל הנוזל העליון (supernatant) והשביחו מחדש את המשקע בתמיסת אלקטרופורציה.

הוסיפו כמות כוללת של 10 micrograms DNA לשתי מבחנות חדשות. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת אלקטרופורציה לנפח סופי של 100 microliters ושמרו את תערובת התאים וה-DNA על קרח. העבירו את תערובת התאים וה-DNA לקובית האלקטרופורציה, והניחו את הקובית בתא של מכשיר האלקטרופורציה.

מדדו את העכבה (impedance) על ידי לחיצה על הכפתור המתאים באלקטרופורטור וודאו שהיא נעה בין 0.030 ל-0.055 ohm. בצעו אלקטרופורציה בהתאם להגדרות המצוינות בפרוטוקול הכתוב. הוסיפו 400 µL של electroporation buffer בתוספת rock inhibitor לקובטה, ולאחר מכן העבירו את כל תכולתה לשפופרת של 1.5 mL.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש. לאחר 30 דקות, סובבו ב-400 ×g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את המשקע (pellet) ב-20 µL של basement matrix לכל באר.

זריעה של בערך 1x10⁴ עד 1x10⁵ תאים למשבצת בלוח 48 משבצות, והוספה של מצע המכיל EGF plus noggin, מעכב GSK3, מעכב rock ו-1.25% dimethyl sulfoxide. דגירה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, החלפת המצע למצע המכיל EGF plus noggin, מעכב GSK3 ומעכב rock, ובדיקת יעילות הטרנספקציה על ידי תצפית על ביטוי GFP.

שמרו את האורגנואידים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר יומיים, החליפו את המצע במצע טרי. ארבעה ימים לאחר האלקטרופורציה, החליפו את המצע למצע WENR בתוספת ניקוטינאמיד ומעכב ROCK והמשיכו לדגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C.

נוכחותם של מספר המכניסים הנכון של gRNA בוקטור הקונקטמר מאושרת על ידי עיכול רסטריקציה כפול עם EcoR1 ו-BglII. הגודל הצפוי של הפס התחתון הוא בערך 1.6 kilobase עבור וקטור קונקטמר עם ארבעה gRNA ו-1.2 kilobase עבור וקטור קונקטמר עם שלושה gRNA. בנוסף, עיכול עם Bbs1 מאשר כי ה-gRNAs שוכפלו לתוך המיקום הנכון, וכתוצאה מכך, כל אתרי הזיהוי של Bbs1 אבדו.

סמיגמנטים מאושרים מועברים לאורגנואידים של מעי עכבר באמצעות אלקטרופורציה כדי להשיג יעילות טרנסווקציה של עד 70%, כפי שניתן לראות לפי ביטוי GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לייצר וקטורים של קונקטמר gRNA וכיצד להעבירם ביעילות לתרביות אורגנואידים בתלת-ממד באמצעות אלקטרופורציה, במטרה להשיג נוק-אאוט של מספר גנים בו-זמנית.