פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה, היא לשכפל מספר RNA מנחה לווקטור CRISPR-concatemer אחד ולהשיג אלקטרופורציה יעילה ביותר באורגנואידים במעי עכבר, על מנת להשיג נוקאאוט בו זמנית של מספר גנים. שיטה זו יכולה לשפר מאוד את היעילות של מחקרי אובדן תפקוד בכך שהיא מאפשרת להתגבר על ההשפעה הפוטנציאלית של פיצוי מקביל. היתרון העיקרי של אסטרטגיית ה-CRISPR-concatemer שלנו הוא הנוחות של שלב שיבוט יחיד והאפשרות לבצע נוקאאוט בו זמנית של עד ארבעה גנים שונים.

הדגמת ההליך תיעשה על ידי אלסנדרה מרנדה, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. השיבוט של RNA מנחה או gRNAs לתוך וקטור ה-CRISPR-concatemer מתחיל בתגובה יחידה לחישול הגדילים העליונים והתחתונים עבור כל אוליגונוקלאוטיד gRNA ולזרחן את קצותיהם. הכן את תערובת התגובה על קרח, עבור שלושה קונקטרים, השתמש בשלושה מיקרוליטרים של gRNAs גדיל עליון, שלושה מיקרוליטרים של gRNAs גדיל תחתון, שני מיקרוליטר של מאגר ליגאז T4 DNA, מיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטיד קינאז ומים עד לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.

מערבבים היטב על ידי פיפטינג והפעלת התרמוסייקלר באמצעות ההגדרות הבאות, 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, רמפה ל-25 מעלות צלזיוס ב-0.3 מעלות צלזיוס לדקה והחזק בארבע מעלות צלזיוס. השלב הבא הוא תגובת הדשדוש Bbs1, שבה משולבים האוליגונוקלאוטידים של gRNA מחוסמים מראש במיקום המתאים של וקטור הקונקטמר. לדלל את תערובת התגובה 1 עד 100 ב-DNA, מים נטולי RNA כדי ליצור שלושה וארבעה וקטורים של gRNA.

הרכיבו את תגובות הדשדוש של Bbs1 על קרח. השתמש ב-100 ננוגרם של וקטור CRISPR-concatemer, 10 מיקרוליטר תערובת אוליגו, מיקרוליטר אחד של מאגר אנזים הגבלה, מיקרוליטר אחד של DTT, מיקרוליטר אחד של ATP, מיקרוליטר אחד של אנזים Bbs1, מיקרוליטר אחד של T7 ליגאז ומים עד לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי פיפטינג, כוללים בקרה שלילית המכילה את הווקטור.

הפעל את התגובות במחזור תרמי, באמצעות ההגדרות הבאות, לשיבוט שלושה וארבעה מחברי gRNA, הפעל 50 מחזורים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ו-21 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, החזק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן החזק בארבע מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. עבור שני קונקטמרים של gRNA, הפעל את אותן הגדרות עם 25 מחזורים של שלב ראשון. כאשר תגובת הדשדוש של Bbs1 הושלמה, קח 11 מיקרוליטר מכל תערובת קשירה והוסף 1.5 מיקרוליטר של מאגר אקסונוקלאז, 1.5 מיקרוליטר ATP, מיקרוליטר אחד של אקסונוקלאז DNA ומים לנפח כולל של 15 מיקרוליטר.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, תערובת התגובה משמשת לשינוי חיידקי E.Coli בעלי יכולת כימית, בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי. כדי לאשר את נוכחותם של מוסיף gRNA בווקטור CRISPR-concatemer, בחר מושבות חיידקים עם לולאת חיסון וחסן כל אחת בארבעה מיליליטר של מדיום LB.

גדל את השיבוטים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלולי. למחרת, ה-DNA מופק באמצעות ערכת מיני-הכנה של פלסמיד, על פי הוראות היצרן. מערבבים כ-200 ננוגרם מכל דגימת DNA עם 10 יחידות של EcoR1 וחמש יחידות של BglII בתגובה של 10 מיקרוליטר.

כלול תערובת תגובה נפרדת עם הווקטור המקורי המתאים כבקרה חיובית להשוואת גודל. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. הפעל את תגובות העיכול על ג'ל אגרוז 1% ב-90 וולט למשך כ-20 דקות.

דמיין את הג'ל באמצעות טרנס-מאיר UV כדי לזהות את השיבוטים עם גודל ההכנסה הנכון. כדי לאשר ש-gRNAs שוכפלו למיקום הנכון וכתוצאה מכך כל אתרי הזיהוי של Bbs1 אבדו, עכל את השיבוטים שנבחרו עם חמש יחידות של Bbs1. כלול תערובת תגובה נפרדת, עם הווקטור המקורי המתאים כבקרה.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, הפעל את תגובות העיכול על ג'ל אגרוז 1% ב-90 וולט למשך כ-20 דקות. דמיין את הג'ל באמצעות טרנסמאייטור UV כדי לזהות את הווקטורים שאינם נחתכים על ידי Bbs1. בעת פיצול אורגנואידים לאלקטרופורציה, זרע מינימום שש בארות של צלחת 48 בארות לכל טרנסבקציה.

זרעו את האורגנואידים בטיפות מטריצת מרתף של 20 מיקרוליטר וגידלו אותם ב-250 מיקרוליטר של WENR בתוספת מדיום ניקוטינאמיד לבאר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בחממה לחה. ביום השני, החלף את מדיום ה-WENR בתוספת ניקוטינאמיד ב-250 מיקרוליטר של EGF בתוספת נוגין, מעכב GSK3 ומדיום מעכב סלעים ללא אנטיביוטיקה. ביום השלישי, שנה את המדיום האורגנואיד ל-EGF בתוספת נוגין, מעכב GSK3, מעכב סלעים ו-1.25% דימתיל סולפוקסיד ללא אנטיביוטיקה.

ביום הרביעי, שבשו את כיפות מטריצת המרתף, באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד והעבירו אורגנואידים לצינור של 1.5 מיליליטר. משוך את תכולת ארבע הבארות של צלחת 48 בארות לצינור אחד. שוברים מכנית את האורגנואידים לשברים קטנים על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P200 כ-200 פעמים.

צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הסר את המדיום מכל הצינורות והשהה מחדש את הפלטות במיליליטר אחד של פרוטאז רקומביננטי בדרגת תרבית תאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לכל היותר.

חשוב לעקוב בקפידה אחר הטיפול בפרוטאז מכיוון שהצלחת האלקטרופורציה תלויה בהשגת תרחיף תאים המכיל אשכולות תאים במקום תאים בודדים. בדוק טיפה של 50 מיקרוליטר של דגימה תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מטרה פי ארבעה. אשכולות של 10 עד 15 תאים רצויים מכיוון שהדבר מגביר את הישרדות התאים לאחר אלקטרופורציה.

העבירו את תרחיף התאים לצינור בעל קשירה נמוכה של 15 מיליליטר וחזירו את הדיסוציאציה על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מדיום בסיסי ללא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הפלטה במיליליטר אחד של מדיום סרום מצומצם.

ספרו את מספר התאים עם תא בורקס, יש צורך במינימום אחד כפול 10 עד חמישי תאים לכל תגובת אלקטרופורציה. התחל הליך זה על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מדיום סרום מופחת לצינור של 15 מיליליטר המכיל את תרחיף התאים והצנטריפוגה ב-400 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את כל הסופרנטנט והשהה מחדש את הפלטה בתמיסת אלקטרופורציה.

הוסף כמות כוללת של 10 מיקרוגרם DNA לשני צינורות חדשים. לאחר מכן, הוסף תמיסת אלקטרופורציה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר ושמור את תערובת ה-DNA של התא על קרח. העבירו את תערובת ה-DNA של התא לקוביית האלקטרופורציה, הניחו את הקובט בתא האלקטרופורטור.

מדוד את העכבה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים באלקטרופורטור וודא שהוא 0.030 עד 0.055 אוהם. בצע אלקטרופורציה בהתאם להגדרות המצוינות בפרוטוקול הטקסט. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה בתוספת מעכב סלע לקובט ולאחר מכן העבר את כל תכולתו לצינור של 1.5 מיליליטר.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש. לאחר 30 דקות, סובב ב -400 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הפלטה ב -20 מיקרוליטר לבאר של מטריצת מרתף.

זרע בערך פעם 10 לרביעית עד אחת כפול 10 לתאים החמישיים לבאר בצלחת של 48 בארות והוסף EGF בתוספת נוגין, מעכב GSK3, מעכב סלעים ומדיום דימתיל סולפוקסיד 1.25%. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שנה את המדיום ל-EGF בתוספת נוגין, מעכב GSK3 ומעכב סלע ובדוק את יעילות הטרנסבקציה על ידי התבוננות בביטוי GFP.

שמור על אורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יומיים לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום טרי. ארבעה ימים לאחר האלקטרופורציה, שנה את המדיום ל-WENR בתוספת ניקוטינאמיד ומדיום מעכב סלע והמשך לדגור על התאים ב-37 מעלות צלזיוס.

הנוכחות של המספר הנכון של מוסיף gRNA בווקטור הקונקטמר מאושרת על ידי עיכול הגבלה כפולה עם EcoR1 ו-BglII. הגודל הצפוי של הפס התחתון הוא כ-1.6 קילו-בסיס עבור וקטור קונקטמר של ארבעה gRNA ו-1.2 קילו-בסיס עבור וקטור קונקטמר של שלושה gRNA. בנוסף, עיכול עם Bbs1 מאשר ש-gRNAs שובטו למיקום הנכון וכתוצאה מכך, כל אתרי הזיהוי של Bbs1 אבדו.

מבנים מאושרים מועברים לאורגנואידים במעי העכבר על ידי אלקטרופורציה כדי להשיג יעילות טרנסבקציה של עד 70% כפי שמוצג על ידי ביטוי GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור וקטורים של gRNA concatemer וכיצד להעביר אותם ביעילות לתרביות אורגנואידים תלת מימדיות באמצעות אלקטרופורציה, על מנת להשיג נוקאאוט של מספר גנים בו זמנית.