שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

זהו הפרוטוקול להכנת הדגימות עבור בדיקת הפלזמה. שימו לב, כדי להבטיח את שלמותן, יש לשמור את כל הדגימות והתקנים בטמפרטורה של 2 עד 8 מעלות צלזיוס במהלך האיסוף והעיבוד. לאחר סיום הטיפול, יש לאחסן את כל הדגימות במינוס 20 מעלות.

עבור ההכנה הסטנדרטית, הכין שני תמיסות מלאי עצמאיות של כל אניליד, ivacaftor, מטבוליט M1, מטבוליט M6 ו-lumacaftor במתנול בריכוזים של 100 microgram per milliliter ו-10 microgram per milliliter. שימו לב, התרכובות פוקעות לאחר 10 ימים על משטח העבודה. עבור הסטנדרטים, העבר 100 microliters של פלזמה אנושית לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה מポリפרופילן בנפח 1.5 milliliter.

המשיכו לבצע זאת עבור כל שאר הדגימות שלכם. לאחר מכן, הוסיפו את התקן הפנימי לכל מבחנה. לדוגמה, נבחר 0.01 µg/mL מתוך התקן שהוכן.

כעת מבחנה זו מכילה פלסמה שהושלך אליה התקן הפנימי. המשיכו כך עם כל שאר התקנים. קחו את התקנים שלכם וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך מספר שניות כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית המבחנה.

המשיכו לבצע זאת עבור כל 40 התקנים שלכם. עבור דגימות המטופלים, העבירו 100 microliters ממבחנת דגימת המטופל אל מבחנת המיקרו-צנטריפוגה. דגימת המטופל האמיתית אינה מחודקת עם תקן פנימי.

סובב את דגימת המטופל בצנטריפוגה למשך מספר שניות כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית המבחנה. השלבים הבאים מיועדים הן לדגימות והן לתקנים. הוסף 200 microliters של 0.1% formic acid ב-acetonitrile לכל מבחנת דגימה כדי להשקיע חלבוני פלזמה.

המשיכו לבצע זאת עבור כל התקנים ודגימות המטופלים. ערבבו כל דגימה ב-Vortex בעוצמה למשך כ-15 שניות. המשיכו לבצע זאת עבור כל התקנים והדגימות המקוריות (incurred samples).

המתינו 10 דקות במקרר כדי להקל על השקיעה. לצורכי הדגמה, אצנטריפוג רק דגימה אחת וסטנדרט אחד. אנו מבצעים צנטריפוגה במהירות של 10,000 rpm למשך 10 דקות במכשיר Eppendorf Centrifuge 5430 בטמפרטורה של ארבע מעלות.

כעת נסנן את הנוזל העליון (supernatant) לתוך מבחנות Phenomenex. לשם כך, אנו משתמשים במסנן מזרקה של 13 מילימטר עם מסנני nylon מסוג Grace של 0.45 micrometers שנרכשו מארה"ב, ואנו מסננים לתוך מבחנות HPLC בעלות קיבול של 1.5 milliliters. לאחר הסינון, נעביר 100 microliters של הנוזל העליון למבחנות LC/MS לצורך אנליזת LC/MS.

דגימה זו מוכנה כעת לניתוח. כעת פשוט הניחו את כל הדגימות שלכם במעמד המבחנות. אנו משתמשים במערכת Shimadzu 8030 LC/MS, המחוברת לספקטרומטר מסות בעל משולש קוואדרופולים.

המתינו להגעת המערכת לשיווי משקל לפני הניתוח. לאחר הגעה לשיווי משקל, תהליך שלוקח כ-15 דקות, לחצו על כפתור ה-Start. עבור כל מטבוליט, בנו עקומת כיול על ידי שרטוט יחסי שטחי הפסגות של האנילידים אל מול הריכוז הנומינלי של תמיסאות הכיול.

השתמשו במשוואת הרגרסיה של עקומת הכיול כדי לחשב את ריכוזי האנילידים בדגימה המעשית. כרומטוגרמה טיפוסית מוצגת באיור זה. רזולוציה כרומטוגרפית אופטימלית הושגה באמצעות פאזה ניידת של 100% acetonitrile ו-0.1% formic acid במים עם אלואציה במדרג (gradient elution) בעמודה מסוג Phenomenex Kinetex C8.

זמני השריטה (retention times) ב-LC היו כדלקמן. עבור M6, דקה אחת. עבור M1, 1.3 דקות.

עבור ivacaftor, 1.55 דקות. עבור lumacaftor, 2.3 דקות. בכל דגימות הפלסמה הריקות, לא נצפתה הפרעה לזמן השהייה של אף אחד מה-anilides, ולא זוהתה הפרעה מהשילוב של ivacaftor עם lumacaftor.

באמצעות ניתוח בשקיפות גבוהה (high-throughput) של כמות גדולה של דגימות חולים, ביצענו אופטימיזציה לשיטה שדיווחנו עליה, באמצעות שימוש בעמודת כרומטוגרפיה פאזה הפוכה (reversed-phase chromatography) עם גודל נקבים קטן יותר, עמודת Phenomenex C8, ומערכת ממס במדרג (gradient solvent system) במקום an elution איזוקרטי. דבר זה מקצר את זמן ההרצה לשישה דקות לדגימה, כולל שלב השטיפה. שיטה מהימנה וחדשנית זו מציעה גישה פשוטה, רגישה ומהירה לניטור תרופתי של ivacaftor, שילוב של ivacaftor-lumacaftor, ובנוזלים ביולוגיים.

נוכח הצורך בפיתוח קשרי חשיפה-תגובה כדי למקסם את יעילות התרופה ובו זמנית להכיל את עלויות הבריאות, יש לפתח ולתקף כלים רגישים יותר שיסייעו לקלינאים בשימוש בטיפול מבוסס ראיות ובטכניקות אנליטיות בעלות תפוקה גבוהה עבור חולים הסובלים מ-CF. על ידי יישום השיטה האנליטית המוצעת במחקרים קליניים של פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה, עולה ההזדמנות לבחון לעומק את הפרמטרים הפרמקוקינטיים של ivacaftor או השילוב של ivacaftor-lumacaftor בקבוצת חולים גדולה יותר.