שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס
October 15th, 2017
שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.
זהו הפרוטוקול להכנת הדגימה לבדיקת הפלזמה. שימו לב, כדי להבטיח את שלמותם, יש לשמור על כל הדגימות והתקנים בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס במהלך האיסוף והעיבוד. לאחר השלמת הטיפול, אחסן את כל הדגימות במינוס 20 מעלות.
להכנה הסטנדרטית, הכינו שתי תמיסות מלאי עצמאיות של כל אניליד, איוואקפטור, מטבוליט M1, מטבוליט M6 ולומקפטור במתנול ב-100 מיקרוגרם למיליליטר ו-10 מיקרוגרם למיליליטר. שימו לב, התרכובות פגות לאחר 10 ימים על ספסל. עבור התקנים, העבירו 100 מיקרוליטר פלזמה אנושית לצינורות המיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 1.5 מיליליטר.
המשך לעשות זאת עבור כל הדוגמאות האחרות שלך. לאחר מכן הוסף את התקן הפנימי לכל צינור. לדוגמא, אנו בוחרים 0.01 מיקרוגרם למיליליטר מתוך התקן המוכן.
עכשיו השפופרת הזו מכילה פלזמה עם התקן הפנימי. המשך כך עם כל התקנים האחרים. קח את הסטנדרטים שלך וסובב אותו למשך מספר שניות כדי לוודא שכל הנוזל נמצא בתחתית הצינור.
המשך לעשות זאת עבור כל 40 התקנים שלך. עבור דגימות המטופל, העבירו 100 מיקרוליטר מצינור הדגימה של המטופל לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה. מדגם המטופלים האמיתי אינו מתווסף לתקן פנימי.
סובב את דגימת המטופל כלפי מטה למשך מספר שניות כדי לוודא שכל הנוזלים נמצאים בתחתית הצינור. השלבים הבאים מיועדים הן לדוגמאות והן לתקנים. הוסף 200 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל לכל צינור דגימה כדי לזרז חלבוני פלזמה.
המשך לעשות זאת עבור כל התקנים ודגימות המטופלים. מערבולת כל דגימה במרץ במשך כ-15 שניות. המשך לעשות זאת עבור כל התקנים והדגימות שנגרמו.
מניחים לעמוד 10 דקות במקרר כדי להקל על המשקעים. למטרות הדגמה, אני אעשה צנטריפוגה רק דגימה אחת ותקן אחד. אנחנו צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד למשך 10 דקות על צנטריפוגה אפנדורף 5430 בארבע מעלות.
כעת נסנן את הסופרנטנט לתוך בקבוקוני הפנומנקס. לשם כך אנו משתמשים במסנן מזרק 13 מילימטר עם מסנני ניילון גרייס 0.45 מיקרומטר שנרכשו מארה"ב, ואנו מסננים לבקבוקוני HPLC שיכולים להכיל 1.5 מיליליטר. לאחר הסינון, נעביר 100 מיקרוליטר של סופרנטנט לבקבוקוני LC/MS לניתוח LC/MS.
מדגם זה מוכן כעת לניתוח. עכשיו פשוט הכניסו את כל הדוגמאות שלכם למתלה הבקבוקונים. אנו משתמשים במערכת Shimadzu 8030 LC/MS, יחד עם מפרט מסה משולש מרובע.
תן למערכת להתאזן לפני הניתוח. לאחר שיווי המשקל, שלוקח כ-15 דקות, פשוט לחץ על כפתור התחל. עבור כל מטבוליט, בנה עקומת כיול על ידי התוויית יחסי שטח השיא של אנילידים לעומת הריכוז הנומינלי של תקני הכיול.
השתמש במשוואת הרגרסיה עבור עקומת הכיול כדי לחשב את ריכוזי האנילידים בדגימה שנגרמה. כרומטוגרמה טיפוסית מוצגת באיור זה. רזולוציה כרומטוגרפית אופטימלית הושגה באמצעות פאזה ניידת של 100% אצטוניטריל ו-0.1% חומצה פורמית במים עם פליטת שיפוע על עמודת Phenomenex Kinetex C8.
זמני השמירה של LC היו כדלקמן. עבור M6, דקה אחת. עבור M1, 1.3 דקות.
עבור ivacaftor, 1.55 דקות. עבור לומקפטור, 2.3 דקות. בכל דגימות הפלזמה הריקות לא נצפתה הפרעה לזמן השמירה של אף אחד מהאנילידים, וגם לא זוהתה הפרעה מהשילוב של איבקאפטור עם לומקפטור.
באמצעות ניתוח תפוקה גבוהה של כמות גדולה של דגימות חולים, ביצענו אופטימיזציה של השיטה המדווחת שלנו באמצעות עמודת כרומטוגרפיה קטנה יותר בגודל נקבוביות הפוך, עמודת Phenomenex C8 ומערכת ממס שיפוע במקום הפליטה האיזוקרטית הנוכחית. זה מקטין את זמן הריצה לשש דקות לכל דגימה, כולל שלב הכביסה. שיטה אמינה וחדשנית זו מציעה גישה פשוטה, רגישה ומהירה לניטור תרופות טיפוליות של שילוב איבקפטור ואיוואקפטור-לומקפטור ונוזלים ביולוגיים.
בהתחשב בצורך לפתח קשרי חשיפה-תגובה כדי למקסם את יעילות התרופות כמו גם להכיל את עלויות הבריאות, יש לפתח ולתקף כלים רגישים יותר כדי לסייע לרופאים בשימוש בטיפול מבוסס ראיות ובטכניקות אנליטיות בעלות תפוקה גבוהה עבור מטופלים הסובלים CF.By יישום השיטה האנליטית המוצעת למחקרים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים קליניים, נוצרת ההזדמנות להמשיך לחקור את הפרמטרים הפרמקוקינטיים של איבקפטור או שילוב Ivacaftor-Lumacaftor על קולקטיב מטופלים גדול יותר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג טכניקת HPLC-MS מותאמת לניתוח סימולטני של ivacaftor והמטבוליטים העיקריים שלו, כמו גם lumacaftor. הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של תרופות חדשות אלו לפיברוזיס סיסטי אינן מובנות היטב, מה שמדגיש את הצורך בשיטות ניתוח משופרות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פרמקולוגיה
- כימיה אנליטית
- מחקר פיברוזיס סיסטי
רקע
- Ivacaftor ו-lumacaftor הם תרופות חדשות לפיברוזיס סיסטי.
- ישנה ידע מוגבל לגבי הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה שלהן.
- שיטות מותאמות לניתוח תרופות חיוניות להבנת ההשפעות שלהן.
- HPLC-MS היא טכניקה חזקה לניתוח תרופות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לניתוח ivacaftor ו-lumacaftor.
- להעריך את הפרמקוקינטיקה של ivacaftor והמטבוליטים שלו.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות ותרומת התרופות.
שיטות ששימשו
- הכנת דגימות לבדיקת פלזמה.
- אחסון דגימות בטמפרטורות מבוקרות.
- הכנת פתרונות בסיסיים במתנול.
- שימוש ב-HPLC-MS לניתוח סימולטני.
תוצאות עיקריות
- פיתוח מוצלח של טכניקת HPLC-MS מותאמת.
- הושג ניתוח של ivacaftor והמטבוליטים שלו.
- השיטה הדגימה אמינות למחקרים פרמקוקינטיים.
- תובנות שהושגו על פרמקולוגיה של תרופות לפיברוזיס סיסטי.
מסקנות
- השיטה המותאמת יכולה לסייע בהבנת התנהגות התרופות.
- יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את הפרמקודינמיקה.
- טכניקות ניתוח משופרות חיוניות לפיתוח תרופות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accelerated pharmacokinetic profiling of CFTR modulators is critical for optimizing dosing regimens and understanding exposure-response relationships in cystic fibrosis. This high-throughput LC-MS/MS method enables rapid quantification of ivacaftor, its metabolites, and lumacaftor, supporting larger-scale clinical studies and de-risking translational development. Reduced analysis time from 15 to 6 minutes per sample enhances laboratory throughput, facilitating population PK/PD investigations and portfolio-level decision-making for CF therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of drug and metabolite concentrations to interrogate CFTR modulation mechanisms and pathway engagement.
- Operational Value: Provides reproducible quantitative outputs for assessing target exposure in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers sensitive, selective detection of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological matrices.
- Operational Value: Gradient elution on sub-2µm C8 column ensures chromatographic resolution and assay robustness for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exposure-response modeling by generating reliable PK data from CF patient samples.
- Operational Value: Enables scalable sample processing for clinical PK studies, bridging discovery to clinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-translational continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and quantitative readouts for preclinical and clinical PK evaluation.
- Discovery Biology: Facilitates target engagement assessment through accurate metabolite profiling in biological systems.
- Screening: Ensures assay standardization and reproducibility for reliable compound evaluation across sample sets.
- Analytics: Provides peak area ratio-based quantification and calibration curves for precise concentration determination.
- Translational Research: Connects analytical output to clinical exposure metrics, enabling PK/PD correlation in patient populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for CFTR modulator programs, reducing method redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in drug exposure assessment, reduction of PK uncertainty in CFTR modulator studies.
- Operational Value: High-throughput capability, method sensitivity, and rapid turnaround for large sample cohorts.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on exposure data, improved capital efficiency in clinical development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of CF drug candidates using robust PK/PD datasets.
Implementation Considerations
- Expertise in LC-MS/MS method development and biological sample handling.
- Access to triple-quadrupole mass spectrometry and gradient HPLC systems.
- Standardization of sample preparation, protein precipitation, and filtration protocols.
- Adaptation considerations for different biological fluids (e.g., plasma, sputum) and stability monitoring.
- Requirement for controlled storage conditions (−20°C) and fresh standard preparation within 10-day stability window.
