Name: שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למד שיטת HPLC-MS מותאמת לניתוח סימולטני של Ivacaftor ו-Lumacaftor בדגימות פלסמה מחולי סיסטיק פיברוזיס. השיטה מאפשרת ניטור תרופתי מדויק ומהיר לשיפור הבנת פרמקוקינטיקה ויעילות טיפולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L. T.V. נתמכים על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AI111965). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של המכון הלאומי של האלרגיה, מחלות זיהומיות או מכוני הבריאות הלאומיים. MC הוא NHMRC האוסטרלי חוקר בכיר. ג' ל' הוא אוסטרלי הלאומי לבריאות ו המועצה למחקר רפואי (NHMRC) עמית מחקר, בטלויזיה האוסטרלי NHMRC התעשייה הקריירה פיתוח ברמה 2 עמית מחקר. E.K.S 2017 השגריר הצעיר שנקבע עבור ASM (החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה) והיא נתמכת על ידי כל הפרס לתארים מתקדמים אוסטרלי. חלקים של עבודה זו הוצג ב 12תאנון Australiasian כנס סיסטיק פיברוזיס ב מלבורן (5-8ה של אוגוסט 2017).

אישור לאתיקה הושג מ מונש אוניברסיטת האנושי מחקר אתיקה הוועדה (MUHREC).
 1. יישום של וזמינותו: החולה מדגם אוסף <ol><li>לרשום את הזמן כאשר המטופל לוקח מינון רגיל שלהם של 150 מ"ג ivacaftor או ivacaftor 125 מ"ג /lumacaftor 200 מ ג.</li>
	<li>הערה למטה בדיוק הזמן כאשר נאסף את דגימת הדם המטופל. 
	הערה: מומלץ איסוף דגימות 4-5 במהלך הזמן מספר 24 שעות ביממה. אם האוסף של מדגם אחד בלבד אפשרי, נקודת הזמן המצוין הוא 2.5-4 h פוסט ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor שילוב מינון כמו C מקס ריכוזים-מצב יציב יהיה בר השגה לאחר &#62; 5 ימים של טיפול רציף.</li>
	<li>לאסוף 4-5 מ של דם זמינים מסחרית צינורות כחול לא מטופל.</li>
	<li>לאחר אוסף של כל הדם, לאפשר את הדם להיקרש על ידי השארת אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר. 
	הערה: זה בדרך כלל לוקח 15-30 דק...</li>
	<li>להסיר קריש הדם על ידי צריך שתוציאו ב 1,000-2,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ומפרידה בקירור. תייעד את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך פלזמה.</li>
	<li>בעקבות צנטריפוגה, להעביר מיד את תגובת שיקוע (פלזמה) לתוך צינור פוליפרופילן נקי באמצעות פיפטה של פסטר. תווית הפלזמה צינור עם החולה מזהה (למשל, החולה 1), התרופה מנוהל (למשל, שילוב ivacaftor-lumacaftor) ולאחר זמן הדגימה החולה היה שנאספו (למשל, המינון שלאחר 2.5 h).</li>
	<li>שמור על דגימות ב 2-8 ° C במהלך הטיפול. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-&#8211; 20 מעלות צלזיוס</li>
	<li>במידת הצורך, למשלוח דגימות עם שליח שאושרו למכון וניתוח. 
	הערה: כדי להישלח על קרח יבש עד ההגעה ודוגמאות יש לשמור על &#8211; 80° C עד ניתוח.</li>
</ol> 2. הכנה, עיבוד של דגימות שנצברו ותקנים הערה: פלזמה של תמים בריא תורמים לטיפול ivacaftor/lumacaftor היה מתקבל מן הצלב האדום אוסטרלי. כדי להבטיח את התקינות, יש לשמור כל דגימות/תקנים של 2-8 ° C במהלך איסוף ועיבוד. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-&#8211; 20 מעלות צלזיוס
<ol><li>שוקל לצאת IVA, IVA-carboxylate, hydroxymethyl-IVA, LUMA, אשר ישמש כנקודת התייחסות הסטנדרטים פנימי.</li>
	<li>להכין שני פתרונות מניות עצמאית של כל analyte (IVA, M1, M6, LUMA) ב- LC-MS כיתה מתנול µg 100/mL וכן ב 10 µg/mL. 
	הערה: תרכובות יפוג לאחר 10 ימים ב- benchtop.</li>
	<li>טריים להכין LC-MS סטנדרטים כיול לפני כל הפעלה אנליטי על ידי דילול של הסטנדרטים כיול פתרונות מניות לתוך לפלסמה אנושית כדי להשיג בעקבות ריכוזים: 0.01 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 µg/mL. דגימות אלה נקראות תקנים.</li>
	<li>כדי לזרז חלבונים, הכנת 0.1% חומצה פורמית (FA) acetonitrile (לחצן מצוקה, LC-MS כיתה) ולהשאיר במקרר עד הצורך.</li>
</ol> 3. טיפול קדם של דגימות שנצברו ותקנים <ol><li>לאפשר בשתי דגימות פלסמה החולה, ריק כדי equilibrate לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבולת לערבב כל מדגם פלזמה 15 לשנייה בכל דגימה.</li>
	<li>העברה של aliquot 100 µL או פלזמה ריק עבור תקנים או דגימות החולה לניתוח לתוך צינור microcentrifuge פוליפרופילן 1.5-mL-</li>
	<li>להוסיף את IVA תקן פנימי לתוך כל הצינורות רגיל (למשל 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 ו- µg/mL 10.0 כדי לכסות את טווח הריכוז פוטנציאליים), לסגור את המכסה, מערבולת 2-3 ס' תו תקן פנימי זה הוא רק נוספו פלזמה ריק אין תקן פנימי יתווסף הדגימות החולה.</li>
	<li>חזור על שלב 3.4. עבור פנימי תקנים נוספים M1, M6, LUMA.</li>
	<li>ספין למטה כל שפופרת לזמן קצר כדי להבטיח שאין שום טיפות על המכסה.</li>
	<li>µL להוסיף 200 של המיקס של 0.1% פא בלחצן מצוקה לתוך כל שפופרת, כדי לזרז פלזמה חלבונים.</li>
	<li>מערבולת התערובת נמרצות על כ-15 ס</li>
	<li>לאפשר צינורות לעמוד 10 דקות במקרר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות ב 4 ° C, במידת האפשר.</li>
	<li>סינון של aliquot 200 µL של תגובת שיקוע דרך מסנן מזרק 13 מ מ לתוך בקבוקון HPLC 1.5 mL-</li>
	<li>µL 100 העברה של תגובת שיקוע לתוך הבקבוקון LC-MS לניתוח HPLC-MS-</li>
</ol> 4. ניתוח HPLC-MS הערה: HPLC-MS ניתוח בוצע במערכת LC-MS בשילוב עם ספקטרומטר מסה פאול טריפל (טבלה 1).
<ol><li>להפוך במערכת LC-MS, מניחים את המגש עם הדגימות האוטומטי-סמפלר.</li>
	<li>לצרף את העמודה לעמודת משמר, להתחבר למערכת LC-MS-</li>
	<li>לצרף שני בקבוקים של שלבים ניידים (בקבוק ת 100% לחצן מצוקה; בקבוק ב': 0.1% חומצה פורמית במים), equilibrate את המערכת LC-MS.</li>
	<li>לשלב את הפרמטרים הבאים פרוטוקול LC-MS-
	<ol><li>לפצל את זרימת שלב נייד לפני הכניסה את ספקטרומטר מסה על יחס של 2:1 (פסולת: כניסת MS).</li>
		<li>לבצע • תנאי הדרגתיות בקצב הזרימה של 0.5 mL/min משתמש שלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60, נקודת ההתחלה וי/v). שימו לב: האחוזים נפח של השלב ניידים שינויים לאורך כל ניתוח.</li>
		<li>להפעיל את ספקטרומטר מסה במצב יינון חיובי ספקטרומטריית electrospray.</li>
		<li>ודא שההגדרות LC-MS הן כדלקמן: יון ספריי מתח 4.5 kV, אנרגיית התנגשות 295.9 וי, nebulizing גז: חנקן ב 3 L/דקה; גז התנגשות: ארגון; ייבוש גז לזרום 20 L/min, עדשה מתח Q3:-22 V, טמפרטורה desolvation 250 ° C עם גוש חום הטמפרטורה של 400 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>10 להזריק µL אמצעי האחסון עבור דגימה.</li>
		<li>Analytes זיהוי באמצעות התגובה מרובים ניטור (MRM). לפקח על מעברים יון של m/z 392.49 &#8594; 393, מ/z 408.49 &#8594; 409, מ/z 422.47 &#8594; 423 ו- m/z 452.40 &#8594; 453 IVA, IVA-M1, IVA-M6, LUMA, בהתאמה. 
		הערה: שיטת אופטימיזציה החדש טרם לאימות באופן מלא לפי תקני ה-FDA-</li>
	</ol></li></ol> 5. עקומות כיול <ol><li>לבנות LC-MS עקומות כיול לפני כל הפעלה אנליטי באמצעות הקשר בין את היחס באזור השיא של כל אחד analytes ארבע כדי תקן פנימי את כיול סטנדרטי הנומינלי ריכוזי ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 או LUMA) בתוך התוכנית הגדרות LC-MS- 
	הערה: השלבים המדויקים לבנייה של עקומת כיול זה תלוי בדגם LC-MS הציוד בשימוש. מידע זה עשוי להיות זמין במדריך ציוד.</li>
	<li>לבצע ניתוח רגרסיה-שיטת הריבועים הפחותים על-ידי שקלול 1/C 2 לפי הדדיים של ריכוזים.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כפי שדווח בעבר, הקבוצה שלנו יש בפעם הראשונה שפותחה ואומת שיטה HPLC ו- LC-MS מהירה זיהוי, כימות של ivacaftor מטבוליטים הגדולות שלו hydroxymethyl-IVA M1 (פעיל) ו- M6 IVA-carboxylate (לא פעיל); lumacaftor פלזמה, ברוק של חולי CF14. וזמינותו שדווחו על-ידי הקבוצה שלנו בעבר שימש בהצלחה כדי לכמת את ריכוז LUMA, IVA, IVA-M1 ו- IVA-M6 ב פלזמה, ברוק של CF חולים שעברו טיפול סטנדרטי מצב יציב עם IVA 150 מ"ג /q12 h (המינוח הלטיני: quaque 12 שעות; פעם כל 12 שעות) או 200 מ ג /q12 h LUMA-125 מ ג /q12 h IVA ...

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית נפוצה מעורבים בלוטות הריר אקסוקרינית של הריאות, הכבד, הלבלב, המעי גורם לכשל איברים רב פרוגרסיבי, כגון ירידה תפקוד הריאות, הלבלב אי ספיקה1, 2,3. Ivacaftor (IVA) הראשון המזון והתרופות (FDA-ארה ב), סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה סיסטיק פיברוזיס הטרנס-הממברנה מוליכות הרגולטור (CFTR) potentiator סמים, עם יעילות קלינית evidenced ייצור משמעותי שיפור בתפקודי הריאה מעל פלצבו תת קבוצה קטנה של חולי סיסטיק פיברוזיס הנושאת את G551D-CFTR [גליצין (G) בעמדה 551 מוחלף על ידי חומצה אספרטית (D)] missense מוטציה (~ 4-5% מהאוכלוסייה CF)4,5. זה בעל-פה מנוהל סמים מגביר את הערוץ CFTR פתיחה, ובכך מגדילים את זרם יון כלוריד של משחק את הפגם העיקרי שמוביל המאפיינים הקליניים של CF4,6. למרבה הצער, IVA יחידני אינו יעיל בחולים עם המוטציה נפוץ יותר F508del homozygous [במחיקת מסגרת הגן CFTR אשר גורמת לאובדן של פנילאלנין (נ) במיקום 508] שתוצאתה misfolded CFTR, אשר נראה ב ~ 50% CF האוכלוסייה7,8.
לאחרונה, ה-FDA העניק אישור עבור שילוב IVA עם מתקן CFTR סמים lumacaftor. האסטרטגיה המתוחכם של שילוב של מתקן CFTR (lumacaftor, LUMA) אשר מצילה F508del-CFTR השטח תא עם אפנן (IVA) אשר potentiates CFTR ערוץ פעילות, ביעילות מרחיבה את החלון הטיפול רוב האוכלוסייה CF5 . שאלות נותרו על תרופות אלו ימלא את ההבטחה שלהם כפי הופיעו מספר דיווחים סותרים הספק יצוק על היעילות הקלינית שלהם,9,10. בנוסף, שיפור תפקוד הריאות היו צנועים (2.6-4% בלבד עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor) לעומת ההצלחה מושגת עם יחידני IVA אצל חולים הנושאת מוטציה (10.6-12.5%) G551D8. אינטראקציות-תרופתיים אויבת פוטנציאלית בין IVA וכי LUMA העלול להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor באים שלה פחות אידיאלי של המאפיינים פרמוקוקינטיים7,11. IVA עובר מטבוליזם בהרחבה על ידי ציטוכרום P450 אנזימים (CYP), בעיקר כדי של המטבוליט הפעיל hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) וטופס לא פעיל IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. משרן CYP3A4 LUMA, מצד שני, היא לא בהרחבה חילוף חומרים, מופרש בעיקר לא השתנה בתוך צואה11. כפי CYP3A4 inducers זירוז חילוף החומרים ציטוכרום, ריכוזי ivacaftor (CYP3A4 המצע) יכול להיות מופחת. יתר על כן, IVA והן LUMA מולקולות הידרופוביות מאוד, ~ 99% מאוגדים פלזמה חלבונים, אשר באופן משמעותי מגביל את ריכוז סמים (פעילים) חינם1,13.
באופן קולקטיבי, גורמים אלה אולי יבוא יחד כדי להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor. לא ידוע אם ריכוזים מיטביים פלזמה מושגות תחת משטר המינון הנוכחי עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor או אם הסף הטיפולי נשמר8. תוך זמן קצר, יש במחסור של מידע לגבי פרמוקוקינטיים פרמטרים כגון הפסגה וריכוזי הפלסמה מצב יציב של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. בהינתן החומרים ראוה של ivacaftor ו- lumacaftor, פיקוח על מערכות יחסים חשיפה-תגובה הוא נחוץ כדי להשיג משטרי המינון האופטימלי לטיפול ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. הקבוצה שלנו לאחרונה לאור השיטה HPLC/LC-MS הראשונה עבור בקרה של מערכות יחסים חשיפה-תגובה של IVA, LUMA14. אין טכניקות חלופיות של מדידת ריכוז ivacaftor שלה מטבוליטים, lumacaftor דווחו עד היום. כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של קולקטיב המטופל גדול יותר, כדי להפחית באופן משמעותי את זמן הניתוח, הקבוצה שלנו כולל אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת ממיס צבע זה מפחית את עלות ושעות פועל.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (ארה"ב).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (חתול#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (ארה"ב).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-קרבוקסילאט (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>קלירסינת' (קנדה).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הידרוקסימתיל-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>קלירסינת' (קנדה).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול (דרגת MeOH, LC-MS),&NBSP;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל (דרגת ACN, LC-MS)&NBSP;</td>חומצה פורמית <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משולש-מרובע שימדזו 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2.6 ומיקרו; m C8 100 &Aring;; 50 ופעמים; 2.1 מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(מסנן בשורה KrudKatcher Ultrea HPLC 0.5 מ' מסנן עומק x 0.004inID).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 מ"ל (VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק 13 מ"מ (0.45 ומיקרו; מ ניילון, גרייס, ארה"ב)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 מ"מ, PP, 300 ומיקרו; L, PTFE / מחיצות סיליקון].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת אופטימיזציה lc-ms/ms לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

פגמים המתקן מוליכות הטרנס-הממברנה סיסטיק פיברוזיס (CFTR) הן הגורם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה עם סכנת חיים ביטויים ריאתי. Ivacaftor (IVA) ivacaftor-lumacaftor (LUMA) שילוב שתי תרופות פריצת דרך CF חדש ישירות לווסת את הפעילות וסחר של החלבון-CFTR פגומים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, יש עדיין מחסור של הבנה על פרמטרים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic פרמקולוגיה של ivacaftor ושל lumacaftor. הטכניקה HPLC-MS לניתוח בו זמנית של הריכוזים של ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate ו- lumacaftor של נוזלים ביולוגיים בחולים שקיבלו תקן שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor טיפול כבר בעבר שפותחה על ידי הקבוצה שלנו ואומת חלקית בתקני ה-FDA. עם זאת, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול יותר של דוגמאות החולה, הקבוצה שלנו יש אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל (2.6 מיקרומטר, C8 100; 50 x 2.1 מ"מ) ו (מערכת ממיס צבע של 0-1 דקות: 40% ב'; 1-2 דקות: 40-70% ב'; מינימום 2-2.7: שנערך ב-70% ב'; 2.7-2.8 מין: 70-90% ב'; 2.8-min 4.0: 90% B כביסה; 4.0-4.1 מין: 90-40% ב'; 4.1-6.0 מין: שנערך ב- 40% B) במקום • תנאי איזוקראטית. מטרת מחקר זה הייתה כדי לצמצם את הזמן ניתוח HPLC-MS עבור דגימה באופן דרמטי מ ~ 15 דקות רק 6 דקות לכל דגימה, אשר חיוני לניתוח של כמות גדולה של דגימות החולה. שיטה זו מועיל יהיה של השירות ניכר ללימודים למערכות יחסים חשיפה-תגובה של תרופות אלו CF פריצת דרך.

לאחרונה דיווחנו שיטה, לאמת חלקית בתקני ה-FDA, טריפל-פאול LC-MS, מערכת גלאי HPLC, משתמש בעמודה C8 (5 מיקרומטר, זיהוי 3.9 מ"מ x 50 מ"מ) עם השלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60 וי/v) בספיקה של 1 מ"ל לדקה. מתאם ליניארי של הפסגות נצפתה מעל טווח הריכוז מ 0.01 µg 10/mL בפלסמה אנושית עבור כל מטבוליטים, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 ו lumacaftor14. הנה שיטה זו מוטבה כדי לאפשר באופן דרמטי מופחתת LC השמירה פעמים ו, לכן, מהזמן וזמינותו, אשר חיוני לניתוח תפוקה גבוהה של כמות גדולה ש...

שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

זהו הפרוטוקול להכנת הדגימות עבור בדיקת הפלזמה. שימו לב, כדי להבטיח את שלמותן, יש לשמור את כל הדגימות והתקנים בטמפרטורה של 2 עד 8 מעלות צלזיוס במהלך האיסוף והעיבוד. לאחר סיום הטיפול, יש לאחסן את כל הדגימות במינוס 20 מעלות.עבור ההכנה הסטנדרטית, הכין שני תמיסות מלאי עצמאיות של כל אניליד, ivacaftor, מטבוליט M1, מטבוליט M6 ו-lumacaftor במתנול בריכוזים של 100 microgram per milliliter ו-10 microgram per milliliter. שימו לב, התרכובות פוקעות לאחר 10 ימים על משטח העבודה. עבור הסטנדרטים, העבר 100 microliters של פלזמה אנושית לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה מポリפרופילן בנפח 1.5 milliliter.המשיכו לבצע זאת עבור כל שאר הדגימות שלכם. לאחר מכן, הוסיפו את התקן הפנימי לכל מבחנה. לדוגמה, נבחר 0.01 µg/mL מתוך התקן שהוכן.כעת מבחנה זו מכילה פלסמה שהושלך אליה התקן הפנימי. המשיכו כך עם כל שאר התקנים. קחו את התקנים שלכם וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך מספר שניות כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית המבחנה.המשיכו לבצע זאת עבור כל 40 התקנים שלכם. עבור דגימות המטופלים, העבירו 100 microliters ממבחנת דגימת המטופל אל מבחנת המיקרו-צנטריפוגה. דגימת המטופל האמיתית אינה מחודקת עם תקן פנימי.סובב את דגימת המטופל בצנטריפוגה למשך מספר שניות כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית המבחנה. השלבים הבאים מיועדים הן לדגימות והן לתקנים. הוסף 200 mi

optimized-lc-msms-method-for-high-throughput-analysis-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

פרוטוקול זה מתאר בדיקה למדידת תפקוד CFTR ותגובות מודולטור CFTR ברקמות מתורבתות מנבדקים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). אורגנואידים במעי שמקורם בביופסיה מתנפחים בצורה מונעת cAMP, תגובה פגומה (או מופחתת מאוד) באורגנואידים של CF וניתן לשחזר אותה על ידי חשיפה למודולטורים של CFTR.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

מיומנות מטבולית של מערכות במבחנה ב הוא דרישת מפתח עבור biotransformation ומכירה של סמים toxicants. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של בדיקות מטבוליות התייחסות להעריך בשלב שאני המטבוליזם בתרביות תאים.

ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא תרבויות

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.

מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

פרוטוקול זה מתאר הליך למעקב אחר האבולוציה של מדדי רשת מזיאליים בחולי אפילפסיה של האונה הטמפורלית (TLE). הוא מבוסס על שילוב של הקלטות תוך גולגולתיות עם טכניקה נומרית חדשה לניתוח נתונים. באופן ספציפי, אנו מציגים פרוטוקול לניתוחי רשת של רישומי הנקב הסגלגל.

ניתוח רשת של הקלטות אלקטרודה foramen ovale בחולים עמידים בפני תרופות Temporal Lobe אפילפסיה

למד שיטת HPLC-MS מותאמת לניתוח סימולטני של Ivacaftor ו-Lumacaftor בדגימות פלסמה מחולי סיסטיק פיברוזיס. השיטה מאפשרת ניטור תרופתי מדויק ומהיר לשיפור הבנת פרמקוקינטיקה ויעילות טיפולית.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס (וידאו) | JoVE Journal

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

גלה סרטונים נוספים