Name: אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למד פרוטוקול עיבוד רקמה עבה לניתוח תלת-ממדי בעור באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו שומרת על אנטיגניות ושלמות מבנית לחקר זקיקי שיער ושרירים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בחסות תרמו-פישר סיינטיפיק ומודים למרכז ההדמיה של ניקון בקינגס קולג &#39;בלונדון לתמיכה במהלך רכישת תמונות קונפוקאליות.

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li>
<li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis%3A+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li>
<li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li>
<li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+frozen+section+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Surg%22%5BJournal%5D)">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li>
<li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+dermal+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li>
<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

המחברים מבקשים לגלות כי פרסום כתב היד הזה מומן על ידי Thermo-Fisher Scientific Inc.

כאן אנו מציגים את טכניקת "הרכבה שלמה אופקית", שיש לה מספר יתרונות על פני קטעים קפואים קלאסיים. יתרון אחד של הטכניקה שלנו הוא שניתן לבצע אותה בקלות עם ציוד היסטולוגיה סטנדרטי ומיקרוסקופ קונפוקלי. שנית, שלמות הרקמה נשמרת בצורה מעולה בהשוואה להקפאות סטנדרטיות. לדוגמה, אדיפוציטים בתוך שכבת ההיפודרמיס (כלומר, אדיפוציטים לבנים עוריים (DWAT))9 משובשים קשות בהקפאות סטנדרטיות, מה שהופך את חקר הרקמות עמוסות השומן לבלתי אפשרי. הטכניקה שלנו מאפשרת ניתוח מלא של האדיפוציטים בשכבה זו ועשויה להיות מותאמת לרקמות אחרות עם תכולת שומן גבוהה. יתר על כן, זה מאפשר זיהוי משופר של תאים מזנכימליים במחקרי מעקב אחר שושלת 2,10.
הקפאות סטנדרטיות, מעצם טבען, לעולם לא יכולות לחשוף את ההיבטים התלת-ממדיים האמיתיים של רקמה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. המשמעות היא שקטעים עבים יותר הם יתרון בניתוח העור, שכן זקיקי שיער, כמו גם התשתיות שלהם, יכולים לחצות עומק העולה על העובי הסטנדרטי של 10 מיקרומטר המשמש בקריזוסקציות קלאסיות. אנו מסוקרנים מכך שלרקמות אחרות, כמו המעי והמוח, למשל, יש אתגרים דומים בכל הנוגע לראיית הרקמה כמבנה תלת-ממדי 2,7,11,12,13. באופן מעניין, הטכניקה שלנו כבר הוכחה כמועילה לשימוש ביישומים מסוימים במעיים14. אנו מאמינים שלפרוטוקול האופקי שלנו יש פוטנציאל להיות מיושם על כל רקמה אחרת הדורשת ניתוח תלת מימד.

המהפכה של ציוד הדמיה מיקרוסקופית מספקת עבור מכשירים מתוחכמים, ברזולוציה גבוהה הדמיה. עם זאת, בעת רכישת תמונה מיקרוסקופית של מלא תלת מימדית (3D) רקמות חתך, הכנת הדגימה מציג אתגרים משמעותיים יכול להיות הגורם המגביל בהגדרת איכות התמונה. כל צעד נפרד ראוי שיקול זהיר על מנת לשמר מורפולוגיה רקמות ואת האנטיגניות של חלבונים היעד, כדי למזער חפצים המושרה עיבוד, כדי למקסם את איכות התמונה הסופית. לדוגמה, ניתוח מסורתי של העור דורש תמונה עם נוף של האפידרמיס ודרמיס, עם זקיקי השיער כי הם בכיוון הנכון, המאפשר ניתוח אנטומי של תא תא תרומות תא העור הומאוסטזיס 1 , 2 . זה דורש ריכוז יסודי על איך העור מוטבע וחתך. חשוב לציין, זקיקי השיער יכול להיות עבה יותרמ -100 מיקרומטר, אשר עולה בהרבה על פרפין רגיל או עובי סעיף קפוא, וכתוצאה מכך תקן נמוך יותר של ניתוח לעומת mounts כולו או חתכים עבים 3 , 4 , 5 . יחד, כל צעד של הכנת הדגימה לניתוח מיקרוסקופי הוא גורם מכריע שישפיע על ניתוח התמונה. כאן, פרוטוקול עיבוד חדשניים עבור עבה, 3D ניתוח חתך רוחב, אשר אנו מכנים &quot;הר שלם אופקי&quot;, מוצג. הפרוטוקול משמר מאוד אנטיגניות ומאפשר ניצול מלא של חלקים עבים של העור באמצעות ציוד הדמיה confocal רגיל. זהו מדריך מלא לשימוש בעור לעיבוד רקמות עבה חתך הדמיה, כולל קציר הקציר ו paraformaldehyde (PFA), cryopreservation (שלב 1), הדור של 100 מיקרומטר עבה רקמות חתך עם cryostat (צעד 2), תיוג אימונופלורסנט הרכבה (שלבים 3 ו -4). תוצאות נציג להשוות תמונות confocal של שתי טכניקות הכנה היסטולוגית ברורה - cryosectioning קלאסית עבה, רקמות 3D חתך חתך, הדגשת היתרונות של &quot;mounts אופקי שלם&quot; עבור המשתמש הפוטנציאלי של פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>ג'לטין תוצרת בית</td></tr><tr><td>, מעור דגי מים קרים</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250 מ"ל</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>BDH חומרי מעבדה</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. תרכובת</td><td>VWR כימיקלים</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>תבניות הטבעה של Peel-A-Way</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Square S-22</td></tr><tr><td>אבקת חלב ללא שומן</td><td>ביו בייסיק בע"מ</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>4&prime;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דילקטט (DAPI)</td> <td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC חולדה אנטי אנושית CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>עכבר/חולדה אינטגרין אלפא 8 נוגדן</td><td>R& D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד חולדות IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 חמור נגד עזים IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ כלי</td><td></td><td></td><td></td>תרבות</tr><tr><td>אזמל חד פעמי</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מתכתיים מחודדים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 צלחות באר</td><td>סיגמא</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul ו-1000 ul פיפטה</td><td>גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro; l XL בוגר TipOne Filter Tip (סטרילי)</td> <td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; l קצה מסנן משופע קצה מסנן אחד (סטרילי)</td> <td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td><td></td>שייקר נדנדה</tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ, משקפי</td> כיסוי <td></td><td>Superfrost Plus</td>של Menzel Glaeser <td>Thermos Aeros</td></tr>, <tr><td>Menzel Glaeser</td><td>Thermos Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

עיבוד רקמה של עניין כדי ליצור תמונה מיקרוסקופית התומכת טענה מדעית יכול להיות מאתגר. רכישת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה אינה תלויה לחלוטין באיכות המיקרוסקופ, אלא גם בשיטות עיבוד הרקמות, אשר לעיתים קרובות כרוכות בפעולות קריטיות או צעדים רבים. יתר על כן, סוגי תאים mesenchymal בעור ורקמות אחרות מייצגים אתגר חדש עבור הכנת רקמות הדמיה. כאן, אנו מציגים תהליך שלם, מן הקציר רקמות למיקרוסקופ. הטכניקה שלנו, המכונה &quot;הר שלם אופקית&quot;, הוא אחד כי טירונים יכולים להפוך במהירות בקיאים זה מאפשר שימור אנטיגן ו ב 60-300 מיקרומטר עבה חלקים לחתוך עם cryostat. חלקים של עובי זה מספק הדמיה משופרת של microarchitecture רקמות בסביבה תלת מימדי. בנוסף, הפרוטוקול משמר תאים mesenchymal באופן זה משפר את איכות התמונה כאשרלעומת קריסטוסט סטנדרטי או חלקים פרפין, ובכך להגדיל את היעילות והאמינות של immunostaining. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה ייהנה כל המעבדות לדמיין את העור, ואולי רקמות אחרות ואיברים.

כדי להדגיש את היתרונות של הטכניקה שלנו, השווה שלנו עבה, 3D רקמה חתך טכניקה, &quot;הר שלם אופקי&quot;, כדי קטעים קפואים קלאסיים. קטעים קפואים קלאסיים נחתכו כפי שתואר לעיל 5 . כדי לספק מבנה חזותי של האפידרמיס בתמונות מיקרוסקופיות, אנו אימונו-איסטנט עבור אינטגרין אלפא -6 (Itga6), שהוא מרכיב המעגן את תאי האפידרמיס לקרום המרתף שבבסיס 6 . כמו כן, שרטטנו את שריר הפילי ארקטור (APM), שאחראי על פילוארקציה (הידוע גם בשם &quot;צמרמורת&quot;), עם אינטגרין אלפא-8 7 . בקטעים הקפואים הקלאסיים, רוב זקיקי השיער שנדמיינו עם Itga6 לא נחתכו לאורך כל אורך הדרך, ויצרו זקיקי שיער חסרים ברובם לכל סעיף, בהשוואה לרכיבי שיער אופקיים ( איור 4 א -4 ד) </strong&gt;). חתך רקמות עבות מאפשרים לרכוש יותר Z- מחסנית שכבות לעומת מקובל 10 מיקרומטר סעיפים, המאפשר תמונה 3D מלאה יותר. זה הופך להיות אפילו יותר בולט כאשר לומדים את השלמות של APMs, אשר קשורים עם זקיקי השיער ואת קרום המרתף מעל. ב cryosections קלאסית, חלק עצום של APMs היו חלק ( איור 4 א -4 ד ). בנוסף, שלמות רקמות של תא hypodermal נשמר אופקי שלם mounts, לעומת הרס של adipocytes כאשר cryosections מחוברים שקופיות זכוכית חמה, אשר ידועה להקפיא-הפשרת חפץ ( איור 4a- b , להשוות את המזרק 8 ). <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> איור 4. mou אופקי שלםNt לעומת קריאוסקציה קלאסית. ( א ) התקבלו באופן קלאסי cryosections העור 10 מיקרומטר עבה ו ( ב ) 100 מיקרומטר עבה 3D רקמות חתכים היו מסומנים עם integrin אלפא -6 (Itga6) ו integrin alpha-8 (Itga8) כדי לדמיין את תא האפידרמיס ואת שרירי פיילי arrector , בהתאמה. התמונות של חתכים עבים רקמות מיוצגים כמו תחזיות מקסימלית של ערימת Z גדולה. המסגרות הלבנות מציינות את האזורים המורחבים, המוצגים ב ( ג ) החלקים הקלאסיים ( d ) האופטיים. ( ה ) זקיקי שיער שלמים ו ( f ) שרירי פילי שלם arrector היו לכמת בשני קטעים קלאסיים ואופקיים הר שלם. פסי סולם מצביעים על 100 מיקרומטר. הנתונים מיוצגים כ ממוצע ± שגיאת תקן של ממוצע (SEM). סעיף אחד לכל משכפל ביולוגי ( n = 3) היה לכמת. מבחן לא מסונכרן * P &lt;0.05, *** P &lt;0.0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

עבודה זו מציגה עיבוד חדש פרוטוקול הדמיה לניתוח עבה, תלת ממדי ניתוח חתך המאפשר ניצול מלא של modocalities הדמיה confocal. פרוטוקול זה משמר אנטיגניות ומייצג מערכת חזקה לנתח היסטולוגיה העור וסוגים אחרים של רקמות אחרות.

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול היסטולוגי ודימוי זה היא להציג מערכת חזקה השומרת על האנטיגניות של האפיטופ ועל השלמות המבנית של העור, מה שמאפשר ניצול מלא של שיטות דימוי קונפוקאליות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח כאשר קיים צורך לבחון את טבעם של סוגי תאים שונים בתוך ארכיטקטורה רקמנית תלת-ממדית מורכבת. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לטכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות הוא שהיא חזקה וקלה לביצוע.בנוסף, הפרוטוקול משלים באופן מושלם ניתוח תלת-ממדי במיקרוסקופיה קונפוקלית. התחילו בקיטום עור שנלקח מהאזור המדיאלי-דורסלי של עכבר לחתיכות מלבניות. כל חתיכה צריכה להיות בגודל המתאים לתחתית של תבנית הקפאה (cryomold).כאן מוצג שטח של סנטימטר רבוע אחד של עור גב המותאם לתבנית קירור (cryomold) בגודל 22 מילימטר על 30 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר הקיבוע, דחפו את העור השטוף לתחתית התבנית המלאה ב-OCT כך שישב בצורה שטוחה על הקרקע. סמנו את כיוון זקיקי השיער על תבנית הקירור, שכן הדבר קובע את כיוון החיתוך במקריוסטט (cryostat).העבירו את בלוקי הקריו ללוח מתכת במקפיא של 80- מעלות כדי למנוע ציפה והעתקה של הרקמה. עקבו אחר תהליך ההקפאה כדי לשמור על כיוון העור בתחתית תבנית הקריו (cryomold), מאחר שבועות אוויר שאינם נראים עלולים לגרום לעור לעלות לפני השטח של התבנית. התחילו בקיבוע בלוק קריו קפוא לשולחן של קריוסטט כאשר כיוון זקיקי השיער הוא כפי שסומן על תבנית הקריו לאורך מישור החיתוך.כיוון מדויק של אוריינטציית זקיקי השיער במקראוסטט הוא קריטי, שכן שלב זה קובע את מישור החיתוך המייצר פרוסות עור שבהן כל אורכן של זקיקי השיער נשמר. השתמשו במקראוסטט כדי לחתוך פרוסה בעובי 100 micron. אחזו ב-OCT סביב פיסת העור המוטמעת באמצעות פינסטה והעבירו את הפרוסה מהמקראוסטט אל תוך כלי תרבית בנפח 100 millimeter הממולא ב-PBS.בטמפרטורת החדר, ה-PBS ימיס את ה-OCT, וישאיר פרוסות עור שקל לטפל בהן באמצעות פינצטה. לאחר החיתוך, השתמש בפינצטה כדי להעביר את פרוסות העור הצפות לבאר של פלטת 12 בארות המכילה 2.5 milliliters של PBS. התחל את הסימון האימונופלואורסצנטי על ידי הוספה ראשונית של 500 microliters של PB buffer לתוך מבחנות מיקרוצנטריפוגה מסומנות בנפח 1.5 milliliter.העבירו בזהירות באמצעות פינצטה את פרוסות העור מפלטת 12 הבארים אל המבחנות לצורך חסימה. ודאו שכל פרוסות העור שקועות במלואן. הניחו את מבחנות המיקרו-צנטריפוגה על רוקר (see saw rocker) בקצב של 10 תנודות לדקה או פחות, למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.סמנו מבחנות מיקרוצנטריפוגה נפרדות של 1.5 milliliter עבור כל פרוסת עור, והוסיפו 500 microliters של PB buffer המכיל את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני. לאחר שעה אחת של חסימה, העבירו את פרוסות העור למבחנות שהוכנו acabado המכילות את הנוגדנים. דגרו את הפרוסות בטמפרטורה של ארבע degrees celsius למשך הלילה במהירות נמוכה על rocker.למחרת, העבירו את הפרוסות לשפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter המכילות 500 microliters של PBS ושטפו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מכשיר נדנדה (rocker). לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לשפופרות מיקרוצנטריפוגה נפרדות של 1.5 milliliter המכילות 500 microliters של באפר PB בריכוז המתאים של נוגדנים שניוניים ו-DAPI. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת תוך נדנוד; במידת הצורך, ניתן לאחסן את הדגימות עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 4 degrees celsius עד לשלב העיבוד הבא.לפני הדמיה, העבירו את פרוסות העור לשפופרות מיקרוצנטריפוגה נפרדות המכילות 500 µL של PBS כדי לשטוף את הנוגדנים המשניים ואת ה-DAPI. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי בגודל 22 מילימטר על 50 מילימטר על רקע כהה תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, השתמשו בפיפט של 1,000 µL שקצה התהו שלו נגזר, כדי להוסיף טיפה אחת של 100% glycerol על זכוכית הכיסוי.העבירו את פרוסת העור מהשפופרת של המיקרוצנטריפוגה אל טיפת הגליצרול. לאחר מכן, בעודכם מביטים דרך מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמשו בפינצטה מחודדת כדי לפתוח בזהירות את פרוסות העור המגולגלות, על ידי הדרכתן חזרה לצורתן הטבעית בעודן צפות בגליצרול. אין להפעיל כוח כדי ליישר את הפרוסה באופן מאולץ, שכן הדבר עלול לגרום נזק לרקמה.לאחר שכל אורך החתך מיוון כראוי ומושטח על לוחית המכסה, יש להצמיד את הרקמה לשקף מיקרוסקופ רגיל; שלב זה יישר עוד יותר את פרוסת העור. יש לצלם את חתיכות העור המורכבות בגליצרין במהלך השניים הבאים.תמונה זו מציגה נתח קריו (cryo section) קלאסי של עור בעובי 10 מיקרון, המסומן עם integrin alpha six ו-integrin alpha eight, לצורך ויזואליזציה של מדור האפידרמיס ושל שרירי ה-directorial pili בהתאמה. נתח רקמה תלת-ממדי זה בעובי 100 מיקרון סומן באופן דומה. התמונה המוצגת היא היטל מקסימלי (maximum projection) של z-stack רחב.פירוט משני התמונות מושווה כאן זה לצד זה; בחתכים הקפואים הקלאסיים, רוב זקיקי השיער שדומיינו באמצעות integrin alpha six לא נחתכו לאורך כל אורכם, מה שהוביל בעיקר לזקיקי שיער לא שלמים בכל חתך, בהשוואה לדגימות שלמות במישור אופקי. זקיקי שיער שלמים ושרירי arrector pili שלמים נספרו הן בחתכים הקלאסיים והן בחתכים האופקיים של דגימות שלמות. חתך אחד עבור כל שכפול ביולוגי נספר; כפי שניתן לראות כאן, בחתך של דגימה שלמה יש שיעור גבוה יותר של זקיקים ושרירי arrector pili שלמים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את שיטת החיתוך בקירור (cryosectioning) במהירות של יותר מ-15 חתכים לדקה, תוך השגת דגימות מכוונות באופן מושלם, בתנאי שהקיבוע בוצע נכון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן העיבוד והניתוח של חתכי רקמה עבים בסביבה תלת-ממדית.

horizontal-whole-mount-novel-processing-imaging-protocol-for-thick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

אנו מציגים גישת רישום תמונה לשחזור נפח היסטולוגיה תלת מימדית (תלת מימדית), המאפשרת לחקור את השינויים של איבר ברמת מבני המאקרו המורכבים מתאים. באמצעות גישה זו, חקרנו את השינויים התלת-ממדיים בין בלוטות חלב מסוג בר לבלוטות חלב Igfbp7-null.

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים - כמו זקיקי שיער וקצות עצבים - שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

כאן נתאר שיטת הדמיה כולה-הר ברזולוציה גבוהה בעור האוזן והעכבר כולו למבוגרים, אשר מאפשרת לנו לדמיין מורפוגנזה מסעף והמתבנת של העצבים ההיקפיים, כלי הדם, כמו גם התפלגות תא החיסון.

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע הדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים, ובכך מאפשרים הדמיה של המורפולוגיה, הרכב סוג התא והאינטראקציות ביניהם.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

השילוב של איטרטיבי-הלבנה-הרחבה-ריבוי (IBEX) ובדיקת תיוג נוקלאוטידים מסחרית (Click-iT EdU) מאפשר זיהוי וסיווג של סוגי תאים מתחלקים בתהליכים דינמיים ביותר בקטעי רקמת עכברים קפואים קבועים. יתר על כן, צינור עיבוד תמונה חדש בקוד פתוח מספק רכישה וניתוח של תמונות בתפוקה גבוהה.

זרימת עבודה של הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה להערכת פנוטיפים של תאי עור ומצבי התפשטות בדגימות רקמה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאימונופלואורסצנציה מרובה המותאם לאפיון הארכיטקטורה התלת מימדית של גרורות צפק.

הדמיה תלת מימדית של רקמה נושאת גידול באמצעות הלבנה איטרטיבית מרחיבה את גישת המולטיפלקסיות

למד פרוטוקול עיבוד רקמה עבה לניתוח תלת-ממדי בעור באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו שומרת על אנטיגניות ושלמות מבנית לחקר זקיקי שיער ושרירים.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

גלה סרטונים נוספים