אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

המטרה הכוללת של פרוטוקול היסטולוגי והדמיה זה היא להציג מערכת חזקה המשמרת את האנטיגניות של האפיטול ואת השלמות המבנית של העור, המאפשרת ניצול מלא של שיטות הדמיה קונפוקליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כאשר יש דרישה לבחון את אופיו של כל סוג של תא בתוך ארכיטקטורת רקמה תלת מימדית מורכבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לטכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות הוא שהיא חזקה וקלה לביצוע.

בנוסף, הפרוטוקול משלים בצורה מושלמת ניתוח תלת מימדי במיקרוסקופיה קונפוקלית. התחל בחיתוך עור שנקטף מהאזור המדיאלי הגבי של עכבר לחתיכות מלבניות. כל חתיכה צריכה להיות בגודל כך שיתאים לתחתית של קריומולט.

כאן מודגם שטח של סנטימטר מרובע אחד של עור גב המתאים לקריומולד בגודל 22 מילימטר על 30 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר הקיבוע, דחפו את העור השטוף לתחתית התבנית המלאה ב-OCT כך שהוא ישכב צמוד לתחתית. סמן את כיוון זקיק השיער על קריומול, מכיוון שזה קובע את כיוון חיתוך הקריו.

העבירו את קוביות הקריו על צלחת מתכת במקפיא מינוס 80 מעלות כדי למנוע ציפה ופריקת הרקמה. עקוב אחר תהליך ההקפאה כדי לשמור על כיוון העור בתחתית הקריומולט, שכן בועות אוויר בלתי נראות עלולות לגרום לעור לעלות אל פני השטח של הקריומולט. התחל בקיבוע קריובלוק קפוא לשלב של קריוסטט עם כיוון זקיק השערה, כפי שמצוין בקריומולד לאורך מישור החיתוך.

התאמה נכונה של כיוון זקיק השיער המדויק על הקריוסטט היא קריטית, מכיוון ששלב זה קובע את מישור החתך המייצר פרוסות עור עם כל אורך זקיקי השיער שלמים. השתמש בקריוסטט כדי לחתוך קטע של 100 מיקרון. אחוז ב-OCT סביב פיסת העור המוטבעת בעזרת מלקחיים והעביר את החלק מהקריוסטט לתרבית 100 מילימטר מלאה ב-PBS.

בטמפרטורת החדר, ה-PBS ימיס את ה-OCT, וישאיר פרוסות עור שקל לטפל בהן בעזרת מלקחיים. לאחר החיתוך, השתמש במלקחיים כדי להעביר את חלקי העור הצפים לבאר של צלחת 12 בארות המכילה 2.5 מיליליטר PBS. התחל בתיוג אימונו-פלואורסצנטי על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר PB, לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מיליליטר.

השתמש בזהירות במלקחיים כדי להעביר את פרוסות העור מצלחת 12 הבארות לצינורות לחסימה. ודא שכל פרוסות העור שקועות לחלוטין. הנח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה על נדנדת מסור ב-10 תנודות לדקה או פחות, למשך שעה בטמפרטורת החדר.

סמן צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים של 1.5 מיליליטר לכל פרוסת עור, והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר PB המכיל את הכמות המתאימה של נוגדנים ראשוניים. לאחר שעה של חסימה, העבירו את פרוסות העור לצינורות הטריים המכילים את הנוגדנים. דוגרים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה במהירות נמוכה על נדנדה.

למחרת, העבירו את הפרוסות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכילים 500 מיקרוליטר PBS ושטפו במשך שעה בטמפרטורת החדר על נדנדה. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים של 1.5 מיליליטר המכילים 500 מיקרוליטר של מאגר PB עם ריכוז מתאים של נוגדנים משניים ו-DAPI. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה עם נדנדה, אם תרצה, ניתן לאחסן דגימות עד ארבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.

לפני ההדמיה, העבירו את פרוסות העור לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים המכילים 500 מיקרוליטר PBS כדי לשטוף את הנוגדנים המשניים וה-DAPI. לאחר מכן הניחו תלוש כיסוי של 22 מיליליטר על 50 מיליליטר על רקע כהה מתחת למיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של 1,000 מיקרוליטר כשקצה הקצה חתוך, כדי להוסיף טיפה אחת של 100% גליצרול על החלקת הכיסוי.

העבירו את פרוסת העור מצינור המיקרו-צנטריפוגה אל טיפת הגליצרול. לאחר מכן, תוך כדי התבוננות דרך המיקרוסקופ המנתח, השתמש במלקחיים מחודדים כדי לשחרר בזהירות את פרוסות העור המתכרבלות על ידי שידולן בחזרה לצורתן הטבעית תוך כדי ציפה בגליצרול. אל תכריח את היישור הלא טבעי של הפרוסה, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמה.

ברגע שכל אורך הקטע מכוון כראוי ומשוטח על החלקת הכיסוי. הרכיבו את הרקמה על שקופית מיקרוסקופ רגילה, שלב זה יישר עוד יותר את פרוסת העור. דמיין את חלקי העור המותקנים בגליצרול ביומיים הקרובים.

תמונה זו מציגה חתך קריו עור קלאסי בעובי 10 מיקרון המסומן באינטגרין אלפא שש ואינטגרין אלפא שמונה, כדי להמחיש את תא האפידרמיס ואת שרירי הפילי הבימוי בהתאמה. חתך רקמה תלת מימדי זה בעובי 100 מיקרון סומן באותו אופן. התמונה המוצגת היא ההקרנות המקסימליות של ערימת z גדולה.

פרטים משתי התמונות מושווים זה לצד זה כאן, בחלקים הקפואים הקלאסיים, רוב זקיקי השיער המוצגים עם אינטגרין אלפא שש לא נחתכו לכל האורך, מה שיצר בעיקר זקיקי שיער לא שלמים לכל חתך, בהשוואה לתושבות שלמות אופקיות. זקיקי שיער שלמים ושרירי פילי ארקטור שלמים כומתו הן בחלקים הקלאסיים והן בחלקים האופקיים של הרכבה ביתית. קטע אחד לשכפול ביולוגי כומת, כפי שניתן לראות כאן, לכל קטע ההרכבה יש שיעור גבוה יותר של זקיקים שלמים ושרירי פילי ארקטור.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקת הקפאה זו במהירויות של יותר מ-15 חלקים לדקה, תוך השגת דגימות בכיוון מושלם אם ההרכבה בוצעה כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבד ולנתח חתכי רקמות עבות בסביבה תלת מימדית.