Name: רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: חקור לוקליזציה של חלבונים ברשתית דג זברה באמצעות מיקרוסקופיית רזולוציה סופר ואלקטרונית. שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של חלבונים בהקשר מבני תאי לחקר התפתחות רשתית ומחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון יון ו- RGB: השוויצרי הלאומי למדע קרן Ambizione ניקוד-להעניק PZ00P3 142404/1 ו- PZ00P3 163979.

כל הניסויים בוצעו על פי המשפט ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון ואושרו על-ידי הרשויות המקומיות.
 1. הכנה של זגוגית בסעיפים על שבבי סיליקון קיבוע הדגימה <ol><li><ol><li>להכין את הפתרון מקבע המכיל 0.1% גלוטראלדהיד, 4% פורמלדהיד במאגר cacodylate 0.1 M. 
		הערה: זהירות! באמצעי זהירות כאשר עובדים עם מאגר גלוטראלדהיד, פורמלדהיד, cacodylate, ללבוש ציוד מגן אישי המתאים והעבודה בשכונה fume.</li>
		<li>המתת חסד 5 ימים פוסט הפריה (5 dpf) הזחלים דג זברה עם tricaine (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate, 0.4% w/v ב- PBS (פוספט מאגר מלוחים, pH 7)) כפי שתואר לעיל 15.</li>
		<li>לתקן את הזחלים על ידי טבילה בפתרון מקבע טרום מקורר על קרח. להסיר את הראש, דגירה בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין.</li>
		<li>לנתח את העיניים על ידי חיתוך לרקמת סביב העין באמצעות מלקחיים בסדר אזמל microdissection (תחת משקפת) בתמיסה מקבע צוננת על צלחת מיטות agarose 1%. להעביר את העיניים צינור עם מקבע טריים מצוננים מראש.</li>
		<li>לשטוף פעמיים ב- PBS (פוספט מאגר מלוחים, pH 7.4) עבור 5 דקות כל כביסה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	</ol></li> <li>חדירה הג'לטין ואת הרכבה <ol><li>לחמם 15 מ"ל מזון מקומי המותג ג'לטין 12% w/v ב PB (מאגר פוספט, 0.1 M pH 7.4) בגיל 40 מעלות צלזיוס. להסיר את PBS ולהוסיף ג'לטין פתרון הצינורות המכילים את העיניים. הקש על הצינור בעדינות כדי להבטיח תסנין ג'לטין המדגם תקופת דגירה של 10-30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס thermoblock עם טלטול עדין או באמבט מים.</li>
		<li>למלא 12 מ מ x 5 מ מ x 3 מ מ סיליקון או פוליאתילן שטוח הטבעה בתבניות עם ג'לטין חמים בתוך אמבט מים 40 ° C. להוסיף שתי עיניים לכל עובש באמצעות פיפטה של, ליישר אותן כראוי תחת המשקפת באמצעות מחט לנתיחה ותני הג'לטין להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה, להקשיח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות</li>
		<li>מחדש לקצץ את הבלוק ג'לטין תחת התאום להתאמת עין אחת לכל בלוק באמצעות סכין גילוח.</li>
		<li>להעביר את העיניים ג'לטין מוטבע 2.3 M סוכרוז ב PB על קרח. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>Exchange 2.3 M סוכרוז פתרון חדש, חנות 4 ° C או-20 ° C; לאחר שלב זה, דוגמאות מוכנים חלוקתה או שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד חודשים.</li>
		<li>חתוך מחדש את הבלוק ג'לטין כדי כמעט בגודל של העין לפני העברת הקפאה-pin. הקפאה בחנקן נוזלי, העברה הקפאה-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>110 לחתוך nm עבה-סעיפים ב-120 ° C עם סכין יהלום הקפאה-ultramicrotome.</li>
		<li>לבחור את הסעיפים עם לולאה קווית המכיל droplet של 2% methylcellulose (במים) 2.3 M סוכרוז פתרון (1:1). להעביר חלקים רקיק סיליקון 7 מ"מ x 7 מ"מ. לאחסן סעיפים ב 4 ° C עד עיבוד נוסף-</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>לשטוף מוצרי קונדיטוריה עם PBS ב-0 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על 4 טיפות על ידי הנחת את מוצרי קונדיטוריה במהופך על הטיפות. כביסה ב- PBS 2 x 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה 3 פעמים ב- 0.15% גליצין ב- PBS, עבור 1 דקות כל אחד. לשטוף x 3 עבור 1 דקות/לשטוף עם PBS. Incubate מראש עם זה פשוט (PBS עם 0.5% אלבומין שור BSA וסוג ג'לטין 0.2% B) עבור 5 דק</li>
	<li>Incubate עם הארנב אנטי-Tom20 (ראה טבלה של חומרים) בזה פשוט (4 µg/mL) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ x 6 עבור מינימום 1/שטיפת בזה פשוט. Incubate מראש עם זה פשוט עבור 5 דקות ב- RT. Incubate עם אלקסה 647 F(ab&#39;) נגד הארנב 2 (ראה את הטבלה של חומרים) בזה פשוט (7.5 µg/mL) במשך 30 דקות</li>
	<li>לרחוץ x 6 עבור מינימום 1/שטיפת בזה פשוט. רחץ 3 x 2 min ב- PBS. דגירה עם דאפי (4 µg/mL) ב- PBS 10 ס' לשטוף 2 x 2 min ב- PBS.</li>
</ol> 3. מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה <ol><li>Incubate כשהפחד לזמן קצר (10 s) על-ידי הצבתו על droplet של פתרון 1:1 של גליצרול (80%) והדמיה מאגר המכיל חמצן ניקוי מערכת (200 מ"מ פוספט מאגר המכיל 10% גלוקוז, 0.5 מ"ג/מ"ל glucoseoxidase, 40 µg/mL קטלאז, 15 מ מ בטא-mercaptoethylamine הידרוכלוריד (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>להעביר את מוצרי קונדיטוריה (סעיף כלפי מטה) הזכוכית התחתונה (עובי 170 ± 5 מיקרומטר) פטרי על גבי טיפה טריים של תערובת 1:1 של גליצרול (80%) והדמיה מאגר (כמו שלב 3.1).</li>
	<li>להסיר מכל הכיוונים, עם פיפטה, רוב הנוזל מתחת לחם הקודש. השתמש סיליקון פסים כדי לתקן את וופל לתחתית הפטרי. 
	הערה: סיליקון פסים עשויים שני סיליקון-דבק (3 מ"מ x 12 מ"מ).</li>
	חלקים <li>התמונה במיקרוסקופ הפוכה באמצעות צוהר מספרית גבוהה (למשל 160 X / נה 1.43; ראה הטבלה של חומרים) שמן טבילה רזולוציה סופר אובייקטיבית ייעודי. לפני הדמיה, תן הדגימה equilibrate לטמפרטורת מיקרוסקופ על מנת למזער/להפחית להיסחף לרוחב ו צירית.</li>
	<li>מרכז את תחום העניין ולרכוש את התמונות הראשונות של הפניה epifluorescence widefield. לשנות מצב הפעולה של סופר רזולוציה. להתאים את זמן החשיפה של המצלמה כדי 15 ms ולהגדיר את האלקטרון הכפלת רווח (EM) למספר המרבי של 300.</li>
	<li>מאירים מדגם עם 642 ננומטר לייזר מתמשך wave-עוצמת הלייזר המרבי (תואם ל- ~2.8 kW/cm 2) במצב epifluorescence. ברגע מולקולה בודדת ומהבהבת מופרדים היטב בכל אחת מהמסגרות, כך הסבירות היא נמוכה כי אותות נפרדים חופפים, להגדיר את עוצמת הלייזר ~0.7 kW/ס מ 2. להקליט את תמונת raw במצב epifluorescence על-ידי השגת מינימום של מסגרות 30,000. 
	הערה: כל פרמטר אלה עשויים להשתנות בהתאם פרטים שונים ולקרוא צפיפויות.</li>
	<li>מן הנתונים הגולמיים, ליצור רשימה אירוע שחזור (הגרסא המקומית של כל מצמוץ מולקולה בודדת בתמונה raw) באמצעות סף גילוי של 30 פוטונים (צריך להיות מותאם על פי המדגם) על-ידי לחיצה על &#34; הערך &#34;, &#39; t-סדרה ניתוח &#39; תחת &#39; כלי &#39;.</li>
	<li>לדמיין את התמונה ברזולוציה סופר על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 16 החלת גודל פיקסל עיבוד של 4 nm על ידי לחיצה על &#34; ליצור תמונה &#34; ב &#39; אירוע רשימת עיבוד לוח &#39; תחת &#39; כלים. &#39; 
	הערה: עבור יצירת תמונת סופר נפתרה בכלי תוכנה משולבת של המערכת השתמשו במחקר זה הועסקו. עם זאת, ההדמיה ברזולוציה סופר תיאר יכולה להתבצע בכל מערכת הלוקליזציה מבוסס אחרים של מולקולה בודדת, ואת הנתונים יכול להיות מעובד עם כלי תוכנה קוד פתוח כמו רעמים 17.</li>
</ol> 4. Shadowing פלטינה <ol><li>להסיר סיליקון פסים ולהוסיף טיפה של PBS בקרבת קצות כשהפחד להרים אותו מן הפטרי. לשטוף את לחם הקודש 2 x 2 min ב- PBS, אז פוסט לתקן אותו עם גלוטראלדהיד 0.1% ב- PBS עבור 5 דק לשטוף 2 x למשך 2 דקות/לשטוף ב- PBS.</li>
	<li>דגירה כשהפחד פעמיים במשך 5 דקות הדגירה בטיפה 1 של methylcellulose 2% במים על קרח. הכנס את פרוסת סיליקון שפופרת צנטרפוגה ו centrifuge ב 14,100 x g עבור הר ש 90 שזה על גדם אלומיניום SEM עם ניצוח מלט פחמן.</li>
	<li>להוסיף שכבה של 2-10 nm של פלטינה/פחמן על הדגימה על-ידי הוספת צל רוטרי ב ° 8 באמצעות אלקטרון לשגר הגדרות התקן אידוי: 1.55 kV, 55 אמא, nm 0.3/s, ואת זווית של ° 8, סיבוב רמה 4-</li>
</ol> 5. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק <ol><li>התמונה מקטעים בסריקת אלקטרון microscope-1.5 kV, 2 מ מ עבודה מרחוק, עם In עדשה משני אלקטרונים גלאי.</li>
</ol> 6. יישור של אור ושל תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים <ol><li>פתוח שני סוגים של תמונות עם פיג'י 18 על ידי לחיצה על &#34; קובץ | פתוח &#34;. התאם גודל בד על ידי לחיצה &#34; תמונה | התאם | גודל בד ציור &#34; להביא גם תמונות בערימה על ידי לחיצה &#34; תמונה | ערימות | תמונות לערום &#34;. לשמור בה את המחסנית כסוג קובץ tiff.</li>
	<li>ב פיג'י, לפתוח ממשק חדש של 19 TrackEM2 על-ידי לחיצה על &#34; קובץ | חדש | TrackEM2 (חדש) &#34;. לייבא את המחסנית עם שתי תמונות על-ידי לחיצה ימנית על החלון השחור ובחירה &#34; ייבוא מחסנית &#34;.</li>
	<li>אור ישר תמונת מיקרוסקופ כדי תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים באופן ידני עם ציוני דרך על-ידי באמצעות לחיצה ימנית על התמונה ובחירה &#34; ישר | יישור השכבה באופן ידני עם ציוני דרך &#34;.
	<ol><li>פיק בחר כלי (החץ השחור) כדי להוסיף ציוני דרך. השתמש בצורת גרעינים כהפניה כדי לבחור בקצוות אותו בתמונות הן (משלים איור 1). הוסף מספר נקודות (שלוש נקודות המינימום צריך להיבחר). להחיל יישור עם מודל affine על-ידי העכבר הימני לחיצה ובחירה &#34; להחיל שינוי צורה | מודל affine &#34;.</li>
	</ol></li> <li>לשנות את שקיפות השכבה (ראה איור משלים 1) כדי להעריך את האיכות של היישור.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
<li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beams+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה זו משלבת לוקליזציה חלבון סופר-נפתרה עם מידע בהקשר כדי לקבוע את מיקום מדויק של חלבונים ב- אברון. נדגים כאן השלמת הניסוי כדי להמחיש את הביטוי של Tom20 הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ויחסה אחרים organelles כמו גרעינים או מקטעים החיצוני של קולט אור ברשתית דג זברה זחל.
Tokuyasu הקפאה-חלוקתה דורש הכשרה לרכוש חלקים שהשתמרה היטב. עם זאת, זוהי שיטה המועסקים מעבדות רבות עם הצלחה והפגינו21. העברת המקטעים פרוסות הסיליקון היא פשוטה מאוד, אין שיקולים מיוחדים נדרשים. השימוש של גליצרול במאגר הדמיה הוא שלב קריטי מאוד כדי למנוע ייבוש של הסעיפים. עבור הדמיה ברזולוציה סופר התוצאות הטובות ביותר מתקבלים כאשר כשהפחד קרוב מאוד בתחתית הכוס צלחת פטרי. הפסים סיליקון לסייע לשמירה על כשהפחד בתנוחה זו. טיפול מיוחד יש לנקוט בעת הסרת הפסים על מנת למנוע נזק הסעיפים.
העובי של הסעיפים-הקפאה, בסביבות 100 ננומטר, דק יותר רזולוציה אופטית ב Z-המימד, בנוסף מקלה את הדיוק של שיטת correlative כמו האות מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה מגיע רק שכבה דקה זו את מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה אות מציגה את הטופוגרפיה של המדגם. שיטה זו יכולה גם להיות משולב עם הדמיה ססגוניות. אולם, יש לקחת טיפול מיוחד כי המדגם יכולים לדימות תחת אותם תנאים (למשל מאגר הדמיה), קרוס לדבר יש למנוע.
מגבלה אחת של השיטה היא שלה דו מימדי מתקרב, מאז ניתן לאסוף רק מספר מוגבל של טורי מקטעים (בערך 3 עד 7 לכל פרוסת סיליקון). לפיכך, פרויקטים העוסקים ניתוח אמצעי האחסון לא יהיה אידיאלי. עם זאת, היא שיטה שניתן להחיל לזהות ביטוי חלבון בכל סוג של רקמה על-ידי חלוקתה פשוטה של המדגם. אנו מספקים שיטה ללא שימוש של סוכנים בניגוד קלאסית כמו ציטראט uranyl אצטט או עופרת. החדות על-ידי הוספת צל פלטינה מספקת ניגודיות הטופוגרפי מאוד אינפורמטיבי, אך במקרים מסוימים ממברנות שקשה לפתור. זה עשוי להוות בעיות עבור פרוייקטים צריך, לדוגמה, כדי לקבוע את הביטוי של חלבונים בתוך שלפוחית קטנה.
פרוטוקול שלנו, המבוסס על Tokuyasu הקפאה-מקטעים, משתמשת ציוד סטנדרטי כדי לקבל תוצאות correlative סופר רזולוציה ומיקרוסקופים אלקטרון סריקה. האוסף של קטעים על שבבי סיליקון המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות צעדים פשוטים כדי לספק יציבות הפארמצבטית כדי הכנת הדוגמא השימוש של פלטינה עבור חדות.

שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים והקשר שלהן כדי תאים שונים של התא הן כלי חיוני להבין את הפונקציות שלהם ואת האינטראקציות האפשריות. סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מספק מידע כזה1. מיקרוסקופ המחסור בקרקע ואחריו החזרה מולקולה בודדת (GSDIM) היא טכנולוגיה מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה תואם עם מגוון רחב של fluorophores אורגניים, גנטית מקודד2 , משיגה רזולוציה לרוחב עד 20 ננומטר 3. שילוב של שיטות עם רזולוציה גבוהה יותר מאשר במיקרוסקופ רגיל מוגבל עקיפה משפר את הדיוק של המתאם4,5,6. על מנת להשיג המתאם הטוב ביותר של ביטוי חלבון עם תא subcellular מסוים וכדי להקטין את עוצמת הקול של חוסר ודאות7 השימוש באותו מקטע ודק במיוחד עבור אור ואלקטרון מומלץ. בין השיטות השונות אופטים, פרוטוקול הקפאה-סעיף Tokuyasu אינה דורשת התייבשות או שרף הטבעה, בנוסף, משמר את antigenicity של epitopes רבים ומספק רקמות טוב ultrastructure8. מספר שיטות הוכיחו את הישימות של מקטעים אלה correlative ואור מיקרוסקופ אלקטרונים (קלם)4,5,9,10.
הרשתית דג זברה הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח ויזואלי ו מנגנוני מחלות אנושיות נתון מאוד שנשמרת מבנהו ותפקודו על פני בעלי חוליות. Photoreceptors מסוים, רשתית תצוגה אותה ארכיטקטורת כמו photoreceptors יונקים, עם סינפסה הבזליים, גרעין apico-basally מוארך, קיבוץ באשכולות של המיטוכונדריה על קטע הפנימי יותר הפסגה, קטע החיצוני מורכב של קרום דיסקים המיקום הכי הפסגה11. לוקליזציה של חלבון כדי התאים הסלולר מגוונות הוא שנשמרת בין דג זברה, אנושי, המאפשר חקירת הפונקציה הביולוגי של האדם חלבונים מחלות רלוונטיות12,13.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכין דג זברה זחל רשתית דגימות לפתור הלוקליזציה של החלבון מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית Tom20 על-ידי אור רזולוציה סופר correlative ואלקטרון. השיטה מבוססת על איסוף הקפאה-סעיפים על שבבי סיליקון, קבלת ניגודיות הטופוגרפי מידע שנוצר אחרי היישום של שכבה דקה של פלטינה. השלבים הבאים הם שיפורים טכניים ברור מבחינת נוחות השימוש, הפארמצבטית, ואת זמן להשלים ניסויים. לאחרונה הראו את הישימות של השיטה כדי לזהות נקבוביות הגרעין וחלבונים מיטוכונדריאלי העכבר רקמות14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade</td><td>EMS, ארה"ב</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>תבניות הטבעה שטוחות</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מותג המזון המקומי</td><td>Dr.Oetker</td><td>סוכרוז אקסטרה גולד</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>סיגמא</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין סוג B</td><td>סיגמא</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>Si-Mat סיליקון סוג חומרים</td><td></td><td>: P/בורון; התמצאות < 111> ואילך; שיטת גידול: CZ; התנגדות: 1-30 אוהם/ס"מ; משטח: מלוטש; חיתוך לייזר ב-7x7 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>תכשיר בלטי</td>#<td>16701950</td><td></td></tr><tr><td>לולאה חוטית "לולאה מושלמת"פסי</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>סיליקון</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוזאוקסידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>בטא-מרקפטואתילאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-טום20</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 שבר חמור אנטי ארנב IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, שוויץ</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול פתרון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי תחתית זכוכית</td><td>איבידי, גרמניה</td><td>צלחת u-צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית גבוהה, #81158</td><td></td></tr><tr><td>בדל אלומיניום SEM</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>מלט פחמן מוליך Leit-C</td><td>Plano, גרמניה</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</חזק></td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</strong</td></tr><tr><td>>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Widefield-TIRF מיקרוסקופ GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF אובייקטיבי</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

אנו מציגים שיטה לחקור לוקליזציה חלבון subcellular ברשתית דג זברה זחל על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. עקיפה תת מגבלת רזולוציה היכולות של מיקרוסקופ אור סופר-רזולוציה אפשר לשפר את הדיוק של הנתונים מתואם. בקצרה, 110 ננומטר בעובי הקפאה-מועברים רקיק סיליקון ומקטעים, לאחר immunofluorescence מכתים, הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה. לאחר מכן, הסעיפים נשמרים ב methylcellulose ו פלטינה מוצלל לפני הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תמונות מ האופנים האלה-מיקרוסקופ שני ימוזגו בקלות באמצעות ציוני דרך רקמות עם תוכנת קוד פתוח. כאן נתאר שיטת המותאמים עבור הרשתית דג זברה זחל. עם זאת, שיטה זו ישימה גם סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים. נדגים כי המידע המשלים מתקבל על ידי המתאם הזה הוא שאפשר לפתור הביטוי של חלבונים מיטוכונדריאלי ביחס עם הממברנות ואת cristae של המיטוכונדריה כמו גם לגבי תאים אחרים של התא.

הביטוי של החלבון Tom20, יחידת משנה של ה translocase מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית מורכבת20, נקבע, בסעיפים דק של דג זברה זחל הרשתית, על ידי מיקרוסקופ אור super-resolution (איור 1), מידע זה היה השלים עם האות הטופוגרפי מתקבל על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הצללת פלטינה הנוכשה. אלה נתונים correlative לאשר הלוקליזציה של חלבון בשיתוף עם תא מסוים, הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי, בנוסף לספק מידע על הזיקה של החלבון עם אחרים organelles של התא.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
איור 1: קלם על הרשתית דג זברה. א הגדלה נמוכה widefield תמונה של דג זברה 5 dpf סעיף ברשתית, גרעינים צבעונית עם דאפי (ציאן). B. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים באותו האזור. ג. הגדלה גבוהה יותר widefield תמונה של מסגרת גרעינים ב מוכתם דאפי (ציאן), צביעת מיטוכונדריאלי Tom20 מופיע באדום. ד Widefield תמונה של אותו סעיף בהגדלה גבוהה יותר. התבנית של Tom20 הביטוי הוא האשכולות של המיטוכונדריה. אי ביטוי של Tom20 (נקודות אדומות) זוהה על ידי מיקרוסקופ GSDIM. הגרעינים מוכתם עם דאפי (ציאן). פ באותו מקטע כמו E שילוב רזולוציה סופר correlative וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים. Tom20 מכתים (נקודות אדומות) מופיע על האשכול מיטוכונדריאלי (ז) בקרום החיצוני של המיטוכונדריה. קרינה פלואורסצנטית דאפי האות הגרעינים (N) תואמת הטופוגרפיה של תמונת SEM. G. התמונה בהגדלה של מסגרת ב- F. סריקה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים מספק בהקשר לתמונה GSDIM (נקודות אדומות). Cristae מיטוכונדריאלי נראה בבירור, ההכתמה Tom20 הוא מקומי כדי בקרום החיצוני של המיטוכונדריה. הממברנות של המקטע החיצוני photoreceptors (OS) נפתרות בבירור. התמונה פיקסל בגודל 5 ננומטר. גודל ברים: A, B ו- c: 10 מיקרומטר; D: מיקרומטר 2; E ו- f: 1 מיקרומטר וז: 0.2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלים איור 1: יישור של תמונות אור ואלקטרון. A-צילום מסך מתוך ממשק TrackEM2 עם תמונות SEM וציוני ממוספרות (צהוב) לאורך גרעינים שונים. B. צילום מסך מתוך ממשק TrackEM2 עם פלורסצנטיות תמונות וציוני ממוספרות (צהוב) לאורך דאפי שונים צבעונית גרעינים. כדי לשנות את שקיפות השכבה המחוונים בחלק העליון השמאלי של התפריט יכול לשמש. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

המטרה הכללית של שיטת מיקרוסקופיה זו היא למקם באופן מדויק ביטוי של חלבונים ביחס לאבנים תת-תאיות שונות ברשתית של זבוב-דגים (zebrafish) בשלב הזחל, וזאת באמצעות קורלציה בין תמונות של מיקרוסקופיית רזולוציה-על (super-resolution) לבין תמונות של מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הפיתוח הרשתי והמסלולים התאיים, כגון מחקר של מיקום שגוי של חלבונים במוטנטים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השילוב בין רזולוציה-על לבין מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי להשיג נתוני מיקום מדויקים ביותר של חלבונים בתוך ההקשר המבני של הדגימה.איסוף של חתכי Tokuyasu על גבי פרוסות סיליקון מקל באופן משמעותי על הטיפול בדגימות, והשימוש בצלליות פלטינה (platinum shadowing) ליצירת ניגוד מספק טופוגרפיה טובה של הדגימה. לכן, שיטה זו יכולה לספק תובנות במחקרי רשתית של זבובי זבב (zebrafish) בשלב הזחלי. אחד מיתרונותיה המרכזיים הוא שניתן להחילה אותה גם על מערכות ביולוגיות רבות אחרות, כגון זיהוי ביטוי חלבונים ברקמת עכבר.לאחר הפקת העיניים מזחלי Zebrafish מקובעים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, חממו 15 milliliters של ג'לטין 12% של local food brand ב-PBS בטמפרטורה של 40 degrees Celsius. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS מהמבחנות עם העיניים והוסיפו את תמיסת הג'לטין. הקישו בעדינות על המבחנה כדי להבטיח שהג'לטין יחלחל לדגימה, והדגרו אותה למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורה של 40 degrees Celsius בתוך thermoblock עם ניעור עדין או באמבט מים.בתוך מקלח מים בטמפרטורה של 40 °C, מלאו תבניות הטבעה שטוחות מסיליקון או פוליאתילן בגודל 12 על 5 על 3 מ"מ בג'לטין חם. לאחר מכן, בעזרת פפית, הוסיפו שתי עיניים לכל תבנית וסדרו אותן כראוי באמצעות מחט דיסקציה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי. לאחר המתנה של דקה אחת לקירור הג'לטין בטמפרטורת החדר, הניחו את התבניות בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות להקשחה.תחת מיקרוסקופ בינוקולרי, השתמש בתער כדי לחתוך מחדש את בלוק הג'לטין כך שכל בלוק יכיל עין אחת. העבר את העיניים הטבולות בג'לטין לתוך sucrose בריכוז 2.3 molar ב-PBS על קרח. הדגר את הדגימות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר מכן, העבירו את הדגימות לתמיסת סוכרוז רעננה בריכוז 2.3 molar. שמרו את הרקמה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, או במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון למשך מספר חודשים. חתכו מחדש את בלוק הג'לטין לגודל הקרוב לגודלו של העין לפני העברתו ל-cryo-pin.לאחר מכן, הקפיאו את הבלוק בחנקן נוזלי והעבירו אותו למיקרוטום אולטרה-דק בהקפאה (cryo-ultramicrotome). בעזרת סכין יהלום במיקרוטום, חתכו דקיקים בעובי 110 nanometer בטמפרטורה של minus 120 °C. אספו את הדקיקים באמצעות לולאת סבב המכילה טיפה של תמיסת 2% methylcellulose ו-2.3 molar sucrose.לאחר מכן, העבירו את הנתחים לוופר סיליקון בגודל שבעה על שבעה מילימטרים. לשטיפת הוופרים, טפטפו ארבע טיפות, והניחו את הוופרים הפוך על הטיפות. דגרו את הוופרים על הטיפות בטמפרטורה של 0 °C למשך 20 דקות.לאחר מכן, שטפו את הפרוסות פעמיים ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות בכל פעם. דגרו את הדגימות שלוש פעמים ב-0.15% glycine ב-PBS למשך דקה אחת בכל פעם. לאחר מכן, השתמשו ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים למשך דקה אחת לכל שטיפה.יש להדגיר מראש את הרקמה עם PBG למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו לחתכים rabbit anti-Tom20 ב-PBG. הדגירו את הפרוסות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.בעזרת PBG, שטפו את הרקמה שש פעמים למשך דקה אחת לכל שטיפה. לאחר מכן, בצעו דגירה מקדימה של הדגימות עם PBG בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. החליפו את ה-PBG ב-Alexa 647 anti-rabbit divalent Fab fragments ב-PBG, ודגרו למשך 30 דקות.שטוף את הדגימות ב-PBG שש פעמים, למשך דקה אחת לכל שטיפה. לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים למשך שתי דקות. הוסף DAPI ו-PBS לפרוסות והדגס למשך 10 שניות.לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים, למשך שתי דקות בכל פעם. הנח את הווייפר על טיפה של תמיסת יחס אחד לאחד של 80% glycerol ובופר דימוי (imaging buffer) המכיל מערכת לספיחת חמצן, דגור אותו למשך זמן קצר. העבר את הווייפרים, כאשר צד הרקמה פונה כלפי מטה, אל טיפה רעננה של תערובת אחד לאחד של 80% glycerol ובופר דימוי בתוך צלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית.השתמשו בפיפט מכל הצדדים כדי להסיר את מרבית הנוזל שמתחת לוופר. לאחר מכן, השתמשו בפסי סיליקון כדי לקבע את הוופר לתחתית צלחת הפטרי. הניחו את החתכים המקובעים על מיקרוסקופ הפוך עם עדשת שמן בעלת מפתח נומרי גבוה.לפני הדימיג', יש להמתין עד שהדגימה תגיע לשיווי משקל עם טמפרטורת המיקרוסקופ, וזאת כדי למזער או להפחית סחף לטרלי ואקסיאלי. מרכזו את אזור העניין ורכשו תמונות ייחוס של פלואורסצנציה אפיפואורסצנטית בשדה רחב. עברו למצב פעולה של רזולוציה-על (super-resolution).כווננו את זמן החשיפה של המצלמה ל-15 milliseconds והגדירו את הגבר של הכפל האלקטרונים למקסימום של 300. לאחר מכן, האירו את הדגימה במצב אפי-פלוורסצנציה (epifluorescence) באמצעות לייזר של 642 nanometer בעוצמת לייזר מקסימלית. ברגע שההבזקים של המולקולות הבודדות מופרדים היטב בכל פריים, כך שהסבירות לחפיפה בין אותות בודדים היא נמוכה, הפחיתו את עוצמת הלייזר לכמעט 1/3.הקליטו את התמונה הגולמית במיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epifluorescence) על ידי רכישת מינימום של 30,000 פריימים. מהנתונים הגולמיים, תחת Tools, ב-t-Series Analysis השתמשו בסף גילוי (detection threshold) של 30 פוטונים. לחצו על Evaluate כדי להפיק רשימה של אירועי לוקליזציה.תחת Tools, בלוח ה-Eventlist Processing, לחץ על Create Image כדי להציג את תמונת הרזולוציה-העל באמצעות התאמה גאוסיאנית (Gaussian fitting), תוך הפעלת גודל פיקסל לרינדור של ארבעה ננומטרים. הסר את פסי הסיליקון, והוסף טיפה של PBS סמוך לקצוות של ה-wafer כדי להרים אותו מתוך צלחת הפטרי. לאחר שטיפת ה-wafer פעמיים עם PBS למשך שתי דקות בכל פעם, השתמש ב-0.1% glutaraldehyde ב-PBS לקיבוע משלים (post-fix) למשך חמש דקות.לאחר מכן, שטפו שוב את הדגימה פעמיים למשך שתי דקות לכל שטיפה ב-PBS. דגרו את הפרוסה בטיפה אחת של 2% methylcellulose במים על קרח, פעמיים למשך חמש דקות לכל דגירה. לאחר מכן, הכניסו את הפרוסה למבחנה לצנטריפוגה, וסובבו ב-14,100 ×g למשך 90 שניות.לאחר הסבסוב, השתמשו בדבק פחמן מוליך כדי להרכיב את הפרוסה על תושבת אלומיניום עבור SEM. באמצעות מכשיר אידוי באלומה אלקטרונית, הוסיפו שכבה של 2 עד 10 nanometers של פלטינה-פחמן על הדגימה בשיטת הצללה סיבובית (rotary shadowing) עם ההגדרות הבאות. צלמו חתכים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק במתח של 1.5 kilovolts, מרחק עבודה של שני millimeter, ועם גלאי אלקטרונים משניים בתוך העדשה (in lens).השתמשו ב-Fiji כדי לפתוח תמונות של מיקרוסקופיה של אור ושל אלקטרונים על ידי לחיצה על File, Open. התאימו את גודל קנבס העבודה על ידי לחיצה על Image, Adjust, Canvas Size. לאחר מכן, הפכו את שתי התמונות לערימה (stack) על ידי לחיצה על Image, Stacks, Images to Stack.בתוכנת Fiji, פתחו ממשק track EM2 חדש על ידי לחיצה על File, New, Track EM2 new. ייבאו את הערימה (stack) הכוללת את שתי התמונות על ידי לחיצה ימנית על החלון השחור ובחירה ב-Import stack. יישרו את תמונת מיקרוסקופיית האור לתמונת מיקרוסקופיית האלקטרונים באופן ידני באמצעות נקודות ייחוס (landmarks), על ידי לחיצה ימנית על התמונה ובחירה ב-Align, Align layer manually with landmarks.בחרו בכלי הברירה (Select) כדי להוסיף נקודות סימון. השתמשו בצורת הגרעינים כנקודת ייחוס כדי לבחור את אותם הקצוות בשתי התמונות ולהוסיף מספר נקודות. בצעו יישור באמצעות מודל אפיני (affine model) על ידי לחיצה ימנית ובחירה ב-Apply transform, Affine Model.לבסוף, שנו את שקיפות השכבה כדי להעריך את איכות היישור. פאנל זה מציג תמונה בשדה רחב ובהגדלה נמוכה של חתך רשתית של דג זבראפיש חמישה ימים לאחר ההפריה. אותו אזור מוצג כאן באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת.תמונות אלו בהגדלה גבוהה יותר מציגות צביעה של Tom20 באדום עם צבירים במיטוכונדריה. ביטוי ה-Tom20 מוצג כאן כפי שזוהה באמצעות מיקרוסקופיית GSDIM. בתמונה זו, אותו חיתוך משלב מיקרוסקופיית סריקה אלקטרונית ורזולוציה-על קורלטיבית.צביעת Tom20 מופיעה בתוך צביר המיטוכונדריה בממברנות החיצוניות של המיטוכונדריה. אות פלואורסצנציית ה-DAPI בגרעינים תואם לטופוגרפיה של תמונת ה-SEM. תמונת SEM זו מספקת הקשר לצביעת ה-Tom20 בתמונת ה-GSDIM.קמטי המיטוכונדריה (cristae) נראים בבירור, וצביעת ה-Tom20 ממוקמת בממברנות החיצוניות של המיטוכונדריה. הממברנות של המקטע החיצוני של הפוטורצפטורים נפתרות בבירור. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה מיטבית ככל האפשר לפרמטרי הסימון והדימות.רק דגימות שעברו סימון אופטימלי מתאימות לרזולוציה-על (super-resolution). אין להניח לדגימות להתייבש בשום שלב במהלך הליך הסימון. ניתן להרחיב הליך זה לסימון אימונופלואורסצנטי כפול, ובכך לאפשר את מיקום שני חלבונים שונים בתוך מבנה ספציפי.במקרה של דגימות מורכבות יותר, מומלץ להשתמש בסימני ייחוס (fiducial markers) כדי להשיג התאמה מדויקת של התמונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע מחקרים קורלטיביים לאיתור חלבונים ביחס לאברוני התא השונים בדגימת רקמה מורכבת בדיוק של רזולוציה-על (super-resolution).

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

אנו מציגים שיטה יעילה לתאי גנגליון רשתית (RGCs) בדג זברה בוגר.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

פרוטוקולים אלה פותחו כדי לנתח מורפולוגיה עדשה קורטיקלית, שלמות מבנית של התפרים העדשה דג זברה בעדשות קבועות וחיות למדוד את המיקום של גרעין העדשה דג זברה לאורך הציר האחורי הקדמי.

הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

חקור לוקליזציה של חלבונים ברשתית דג זברה באמצעות מיקרוסקופיית רזולוציה סופר ואלקטרונית. שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של חלבונים בהקשר מבני תאי לחקר התפתחות רשתית ומחלות.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

גלה סרטונים נוספים