רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

המטרה הכוללת של שיטת מיקרוסקופיה זו היא למקם במדויק את ביטוי החלבון ביחס לאברונים תת-תאיים שונים ברשתית דג הזברה על ידי מתאם ברזולוציה סופר וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי התפתחות הרשתית והמסלול התאי, כגון חקר מיקום שגוי של חלבונים במוטציות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת רזולוציית על עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להשיג נתוני לוקליזציה מדויקים ביותר של חלבון בהקשר המבני של הדגימה.

אוסף חלקי טוקויאסו על פרוסות סיליקון מקל באופן משמעותי על הטיפול והשימוש בהצללת פלטינה לניגודיות מספק טופוגרפיה טובה של הדגימה. לכן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחקרי רשתית של דג הזברה של הזחלים. אחד היתרונות העיקריים שלו הוא שניתן ליישם אותו גם על מערכות ביולוגיות רבות אחרות, כגון זיהוי ביטוי חלבונים ברקמת עכבר.

לאחר ניתוח העיניים מזחלי דג הזברה הקבועים על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחמם 15 מיליליטר של 12% ג'לטין של מותג מזון מקומי ב-PBS ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו את ה- PBS מצינורות העיניים והוסיפו את תמיסת הג'לטין. הקש בעדינות על הצינור כדי להבטיח שהג'לטין חודר לדגימה, ודגר אותו במשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בתרמובלוק עם ניעור עדין או באמבט מים.

באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס, מלאו תבניות הטבעה שטוחות של סיליקון או פוליאתילן בגודל 12 על חמישה על שלושה מילימטר בג'לטין חם. לאחר מכן בעזרת פיפטה הוסף שתי עיניים לכל תבנית ומתחת למשקפת השתמש במחט דיסקציה כדי ליישר אותן כראוי. לאחר שנתנו לג'לטין להתקרר בטמפרטורת החדר למשך דקה, הניחו אותו על ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להתקשות.

מתחת למשקפת, השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ מחדש את גוש הג'לטין כך שיתאים לעין אחת לכל בלוק. העבירו את העיניים המוטבעות בג'לטין לסוכרוז מולארי של 2.3 ב-PBS על קרח. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן החלף את הדגימות לתמיסת סוכרוז טרייה של 2.3 טוחנת. ואחסן את הרקמה בארבע מעלות צלזיוס, או מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון עד מספר חודשים. חתוך מחדש את גוש הג'לטין כמעט לגודל העין לפני העברתו לסיכת קריו.

לאחר מכן הקפיאו את הבלוק בחנקן נוזלי, והעבירו אותו לקריו-אולטרה-מיקרוטום. בעזרת סכין יהלום בקריו-אולטרה-מיקרוטום חתכו חלקים בעובי 110 ננומטר במינוס 120 מעלות צלזיוס. בחר את החלקים עם לולאה חוטית המכילה טיפה של 2% מתיל צלולוז ותמיסת סוכרוז טוחנת 2.3

לאחר מכן העבירו את החלקים לפרוסת סיליקון בגודל שבעה על שבעה מילימטרים. כדי לשטוף את הוופלים, פיפטה ארבע טיפות והניחו את הוופלים הפוכים על הטיפות. דגרו את הוופלים על הטיפות באפס מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן שטפו את הוופלים פעמיים ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות כל אחת. דגרו את הדגימות שלוש פעמים ב-0.15% גליצין ב-PBS למשך דקה אחת כל אחת. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים למשך דקה אחת לכל שטיפה.

דגרו מראש את הרקמה עם PBG למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף ארנב אנטי-Tom20 ב-PBG לסעיפים. ודוגרים את הוופלים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

עם PBG, שטפו את הטישו שש פעמים למשך דקה אחת בכל כביסה. לאחר מכן דגרו מראש את הדגימות עם PBG בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. החלף את ה-PBG בשברי Fab דו-ערכיים נגד ארנב של Alexa 647 ב-PBG, ודגירה למשך 30 דקות.

שטפו את הדגימות ב-PBG שש פעמים למשך דקה אחת בכל שטיפה. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הוופלים שלוש פעמים למשך שתי דקות. הוסף DAPI ו-PBS לפרוסות ודגירה למשך 10 שניות.

לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים למשך שתי דקות כל אחת. הנח את הוופל על טיפה של תמיסה אחת לאחת של 80% גליצרול ומאגר הדמיה המכיל מערכת ניקוי חמצן ודגר אותה לזמן קצר. העבירו את הוופלים, כשצד הרקמה כלפי מטה, על טיפה טרייה של תערובת אחת לאחת של 80% גליצרול וחוצץ הדמיה על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית.

השתמש בפיפטה מכל הצדדים כדי להסיר את רוב הנוזל מתחת לפרוסת. לאחר מכן השתמש בפסי סיליקון כדי לקבע את הוופל לתחתית צלחת הפטרי. הנח את החלקים המותקנים על מיקרוסקופ הפוך עם מטרת טבילה בשמן צמצם מספרי גבוה.

לפני ההדמיה, הניחו לדגימה להתאזן לטמפרטורת המיקרוסקופ על מנת למזער או להפחית את הסחיפה הרוחבית והצירית. מרכז את אזור העניין ורכוש תמונות ייחוס אפיפלואורסצנטיות בשדה רחב. עבור למצב פעולה ברזולוציה גבוהה.

כוונן את זמן החשיפה של המצלמה ל-15 אלפיות השנייה והגדר את רווח הכפלת האלקטרונים למקסימום של 300. לאחר מכן, האירו את הדגימה במצב אפיפלואורסצנטי עם לייזר 642 ננומטר בעוצמת לייזר מקסימלית. ברגע שהמולקולה הבודדת מהבהבת מופרדת היטב בכל פריים, כך שההסתברות נמוכה שאותות בודדים חופפים, הפחיתו את עוצמת הלייזר לכמעט 1/3.

הקלט את התמונה הגולמית באפיפלואורסצנציה על ידי רכישת מינימום של 30,000 פריימים. מהנתונים הגולמיים, תחת כלים, ניתוח מסדרת t משתמש בסף זיהוי של 30 פוטונים. לחץ על הערך כדי ליצור רשימת אירועי לוקליזציה.

תחת Tools, בחלונית Eventlist Processing, לחץ על Create Image כדי להציג תמונה ברזולוציה גבוהה לפי התאמה גאוסית, תוך החלת גודל פיקסל עיבוד של ארבעה ננומטרים. הסר את פסי הסיליקון, והוסף טיפת PBS קרוב לשולי הוופל כדי להרים אותו מצלחת הפטרי. לאחר שימוש ב-PBS לשטיפת הוופל פעמיים במשך שתי דקות כל אחת, השתמש ב-0.1% גלוטרלדהיד ב-PBS כדי לתקן אותו לאחר מכן למשך חמש דקות.

לאחר מכן שטפו את הדגימה שוב פעמיים למשך שתי דקות לכל שטיפה ב-PBS. דגרו את הוופל בטיפה אחת של 2% מתיל צלולוז במים על קרח פעמיים למשך חמש דקות בכל דגירה. לאחר מכן הכנס את הוופל לצינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה ב 14, 100 פעמים גרם למשך 90 שניות.

לאחר הסיבוב, השתמש במלט פחמן מוליך כדי להרכיב את הוופל על בדל אלומיניום SEM. בעזרת מכשיר אידוי קרן אלקטרונים, הוסף שכבה של שניים עד 10 ננומטר של פחמן פלטינה על הדגימה על ידי הצללה סיבובית עם ההגדרות הבאות. קטעי תמונה עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ב-1.5 קילו-וולט, מרחק עבודה של שני מילימטרים, ועם גלאי אלקטרונים משני בעדשה.

השתמש בפיג'י כדי לפתוח תמונות מיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ אלקטרונים על ידי לחיצה על קובץ, פתח. התאימו את גודל בד הציור על ידי לחיצה על תמונה, התאמה, גודל בד ציור. לאחר מכן הביאו את שתי התמונות לאוסף על-ידי לחיצה על Image, Stacks, Images to Stack.

בפיג'י, פתח ממשק EM2 רצועה חדש על ידי לחיצה על קובץ, חדש, עקוב אחר EM2 חדש. ייבא את האוסף עם שתי התמונות על ידי לחיצה ימנית על החלון השחור ובחירה ב-Import stack. יישר את תמונת מיקרוסקופ האור לתמונת מיקרוסקופ האלקטרונים באופן ידני עם ציוני דרך על ידי שימוש בלחיצת עכבר ימנית על התמונה ובחירה באפשרות יישור, יישר שכבה באופן ידני עם ציוני דרך.

בחר את הכלי Select כדי להוסיף ציוני דרך. השתמש בצורת הגרעינים כהתייחסות כדי לבחור את אותם קצוות בשתי התמונות ולהוסיף מספר נקודות. החל יישור עם מודל אפין על ידי לחיצה ימנית ובחר החל טרנספורמציה, מודל אפין.

לבסוף, שנה את שקיפות השכבה כדי להעריך את איכות היישור. פאנל זה מציג תמונת שדה רחב בהגדלה נמוכה של קטע רשתית דג הזברה חמישה ימים לאחר ההפריה. אותו אזור מוצג כאן על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

תמונות הגדלה גבוהות יותר אלה מראות את Tom20 מכתים באדום עם אשכולות במיטוכונדריה. הביטוי של Tom20 מוצג כאן כפי שזוהה על ידי מיקרוסקופ GSDIM. בתמונה זו, אותו קטע משלב רזולוציית על קורלטיבית ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

צביעת Tom20 מופיעה בתוך אשכול המיטוכונדריה בקרומים החיצוניים של המיטוכונדריה. אות ה-DAPI הקרינה בגרעינים תואם את הטופוגרפיה של תמונת ה-SEM. תמונת SEM זו מספקת הקשר לצביעה של Tom20 בתמונת GSDIM.

קריסטות מיטוכונדריאליות נראות בבירור, והצביעה של Tom20 ממוקמת בממברנות החיצוניות של המיטוכונדריה. הממברנות של הקטע החיצוני של קולטני הצילום נפתרות בבירור. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את פרמטרי התיוג וההדמיה שלך בצורה הטובה ביותר.

רק דגימות עם תווית אופטימלית מתאימות לרזולוציה גבוהה. אסור לדגימות להתייבש בשום עת במהלך הליך התיוג. ניתן להרחיב הליך זה לתיוג כפול של אימונופלואורסצנטיות, ובכך לאפשר לוקליזציה של שני חלבונים שונים בתוך מבנה מסוים.

במקרה של דגימות מורכבות יותר, מומלץ להשתמש בסמנים פידוציאליים כדי להשיג יישור מדויק של התמונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מחקרי קורלציה למיקום חלבונים ביחס לאברונים השונים של התא בדגימת רקמה מורכבת עם דיוק ברזולוציה גבוהה.