G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

המטרה הכוללת של הליך זה לריצוף עמוק של DNA מתאים שמוינו בזרימה לפי שלב מחזור התא היא לזהות אזורים בגנום המשכפלים מאוחר מאוד במחזור התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שכפול ה-DNA, כגון אילו אזורים בגנום מתקשים להשלים את שכפול ה-DNA ולכן פגיעים במיוחד לסידור מחדש של הגנום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלמרות שהיא פשוטה מאוד מנקודת מבט ניסויית, היא מספקת מבט עשיר באופן מפתיע על הדינמיקה של שכפול גנומי.

כדי להתחיל, יש לחסן מבחנות של 15 מיליליטר המכילות שמונה מיליליטר YEPD בתאי שמרים מעניינים. מדיום סינטטי או עשיר מקובל. תרבית התאים למשך הלילה למשך 12 שעות לפחות כדי לאסוף אותם במהלך התפלגות שלב היומן האמיתית שלהם.

למחרת, כאשר התרביות נמצאות בצפיפות של חמישה עד 15 מיליון תאים למיליליטר, סובבו את התאים והשעו אותם מחדש ב -1.5 מיליליטר של אתנול 70%. לאחר מכן העבירו את המתלה לצינור מיקרופוגה של 1.6 מיליליטר ותנו לתאים לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה או לפחות שלוש שעות על קרח. לאחר החיסון, סובב את התאים והשהה אותם מחדש במיליליטר אחד של נתרן ציטראט.

לבסוף, סוניקציה קצרה של התאים פעמיים. לאחר מכן חזור על מחזור הצנטריפוגה והשהה מחדש את השמרים במיליליטר אחד של נתרן ציטראט המכיל RNase. אפשר ל-RNase להגיב עם השמרים ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעה או לילה ב-37 מעלות צלזיוס בבלוק חום או באמבט מים.

לאחר הטיפול ב- RNase, הוסיפו לתערובת 50 מיקרוליטר של תמיסת פרוטאינאז K והמשיכו בתגובה למשך שעה בחום של 50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של נתרן ציטראט. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ושואב את הסופרנטנט באמצעות ואקום.

לאחר מכן, באור עמום, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של נתרן ציטראט עם כתם חומצת גרעין ירוקה. כעת דגרו בשמרים בחושך למשך שעה בטמפרטורת החדר. כדי להמשיך, ספרו את התאים באמצעות סדרן תאים באמצעות נתוני פליטה של 530 ננומטר.

מיין אותם לפי תכולת ה-DNA שלהם לשלבי מחזור התא שלהם, G1 S, G2 מוקדם ו-G2 מאוחר. אסוף לפחות 1.6 מיליון תאים הפלואידים מכל שלב. מיד לאחר מיון התאים, סובב אותם למשך 20 דקות. שאפו את הסופרנטנט והקפיאו את הגלולה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לאחסון.

מצאנו שהשלב הקריטי ביותר להליך זה הוא פשוט סיבוב התאים מיד לאחר איסוףם, שעה לכל היותר לאחר המיון. מיצוי זה מבוסס על ערכת מיצוי DNA גנומי של שמרים. התחל בהוספת 120 מיקרוליטר של חיץ עיכול וחמישה מיקרוליטרים של אנזים ליטי שמרים.

לאחר מכן מערבבים את התאים לתערובת התגובה באמצעות מערבולת ודוגרים על התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 60 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 120 מיקרוליטר של מאגר ליזה ומערבלו את התערובת במהירות גבוהה למשך 10 עד 20 שניות. לאחר מכן מוסיפים 250 מיקרוליטר כלורופורם ולמשך דקה מערבבים היטב את תכולת הצינור.

לאחר מכן, סובב את הצינור במהירות מקסימלית למשך שתי דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לעמודת קשירת הדנ"א. סובב את הסופרנטנט דרך העמודה באמצעות מחזור צנטריפוגה במהירות מקסימלית של דקה אחת.

כדי לשטוף את ה-DNA על קרום העמוד, העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש ומרחו 300 מיקרוליטר של מאגר שטיפת DNA. לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. חזור על שלב הכביסה הזה פעם נוספת.

כדי לאסוף את הדנ"א, העבירו את עמוד הסיבוב לצינור חדש. מוסיפים 60 מיקרוליטר מים וממתינים דקה עד שלוש דקות. לאחר מכן צנטריפוגה של העמודה במהירות מקסימלית למשך 10 שניות כדי לבודד את המים המכילים את ה-DNA המנומק.

כעת הוסף בין חמישה ל-195 מיקרוליטר של מאגר DNA דו-גדילי בעל רגישות גבוהה המכיל ריאגנט בריכוז של 1 עד 200. לאחר מכן מדוד את הקרינה של הדגימה כדי לחשב את התשואה. צפו לאסוף בין 10 ל-50 ננוגרם של DNA.

כעת השתמש בסוניקציה כדי לפרק את ה- DNA לשברים שהם בין 250 ל -350 זוגות בסיסים. לאחר מכן השתמש בערכה סטנדרטית כדי להכין ספריית DNA ולרצף אותה באמצעות לפחות 10 מיליון 50 זוגות בסיסים קריאות קצה יחיד. ההליך המתואר שימש לזיהוי אתרי שכפול מאוחרים בשמרים ניצנים.

תאים נורמליים הושוו לאלה שחסרו Sir2, חלבון דאצטילאז. הנתונים הגולמיים הכילו קוצים גדולים בעיקר בשל נוכחותם של אלמנטים של TY. קוצים אלה הוסרו על ידי הגבלת עומק הקריאה פי 2.5 מהעומק האדום החציוני עבור כל דגימה.

לאחר מכן הוחלקו הנתונים עם חלון הזזה של 20 קילו-בייט. לבסוף, הנתונים נורמלו ושורטטו כיחסים לרמות ב-G1. תא לא משוכפל לחלוטין יופיע ב-0.5 ותא משוכפל לחלוטין יופיע באחד. בנתונים אלה מכרומוזום שבע, הייתה עדות לאזור ידוע של שכפול מאוחר במוטציה Sir2.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות את אותם אזורים בגנום שהם האחרונים להשלים את שכפול ה-DNA, ולכן הם פגיעים במיוחד לשבירות DNA ולבעיות אחרות הקשורות לשכפול מאוחר.