Name: G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למד טכניקת G2-seq לזיהוי אזורי שיכפול מאוחרים בגנום באמצעות מיון תאים לפי מחזור התא וריצוף עמוק. שיטה זו חושפת דינמיקת שיכפול DNA ומסייעת לחקר יציבות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM117446 א.

1. הכנת התאים עבור Flow Cytometry מיון
<ol><li>לחסן 15 מ"ל מבחנות המכילות 8 מ ל כל אחד YEPD מרק כזה התרבויות להגיע צפיפות של 5 x 106 כדי 1.5 x 107 תאים לכל mL לאחר צמיחה לילה (ראה דיון הערה 1).</li>
	<li>ספין למטה תאי שמרים (1,400 x g, בטמפרטורת החדר או 4 ° C) בשפופרת צנטרפוגה בורג מכסה 15 mL במשך 5 דקות, resuspend תאים 1.5 מ ל-70% אתנול, העברת צינור microfuge מ ל 1.6, נותן זה שב h 1 בטמפרטורת החדר או לפחות 3 h בקרח ( ניתן לאחסן עד אין סוף ב 4 ° C) (ראה דיון פוינט (2)).</li>
	<li>ספין למטה תאי שמרים microfuge (14,000 x g, 4 ° C) במשך 1 דקה, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (g 14,000 x, 4 ° C) במשך 1 דקה, תשאף תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2 , המכילה 0.25 מ"ג/מ"ל פתרון RNAse h 1 ב 50 מעלות צלזיוס או ללון ב 37 מעלות צלזיוס באמבטיה בלוק או מים חום.</li>
	<li>הוספת µL 50 proteinase K פתרון (20 מ"ג/מ"ל resuspended ב- 10 מ מ טריס pH 7.5, מ מ 2 CaCl2, 50% משקל נפח גליצרול) ואת תקופת דגירה של h 1 ב 50 º C.</li>
	<li>ספין למטה תאים (14,000 x g, 4 ° C), resuspend תאים 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (14,000 x g, 4 ° C), תשאף תגובת שיקוע עם ואקום, resuspend ב 1 מ"ל 1 מיקרומטר חומצת גרעין ירוק זן resuspended ב-50 מ מ סודיום ציטרט , pH 7.2 ו דגירה בחושך לשעה בטמפרטורת החדר, sonicate 2 x עבור 2 s כל (פלט כוח 2 וואט).</li>
</ol>2. התא מיון
<ol><li>שימוש של סדרן התא, למיין תאים על פי תוכן ה-DNA לשלבים G1 ', ' S ', "G2 מוקדם", ו "G2 מאוחר", איסוף תאים הפלואידי לפחות 1.6 מיליון כל שלב מחזור התא כמו באיור 1 (ראה הדיון בנקודה (3)).</li>
	<li>להעביר תאים microfuge צינורות ו ספין למטה תאים עבור 20 דקות ב g 14,000 x-4 מעלות צלזיוס ב microfuge האחות תגובת שיקוע עם ואקום (בגדר ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C ללא הגבלת זמן; ראה דיון הצבע (4)).</li>
</ol>3. דנ א החילוץ, הכנת רצף ספריות
הערה: השלבים הבאים מבוססים על "פרוטוקול אני" בהפקת דנ א גנומי שמרים קיט (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>הוסף µL 120 "מאגר עיכול," מאגר קנייני המאפשרת שמרים אנזים lytic לעכל את דופן התא, µL 5 של האנזים lytic שמרים, resuspend על ידי vortexing של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 120 "מאגר פירוק," מאגר קניינית המכיל חומרי ניקוי, ואת מערבולת קשה עבור s 10-20.</li>
	<li>הוסף כלורופורם µL 250 - לערבב היטב עבור 1 דקות.</li>
	<li>ספין במהירות מקסימלית microfuge למשך 2 דקות.</li>
	<li>לטעון את תגובת שיקוע עמודה איגוד ה-DNA ועל צנטריפוגה במהירות מקסימלית microfuge עבור 1 דקות.</li>
	<li>להוסיף 300 µL "ה-DNA שטיפה מאגר," מאגר קניינית המכיל אתנול, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות מקסימלית microfuge. למחוק את הזרימה, להוסיף 300 µL מאגר ה-DNA לשטוף, לחזור על התהליך לשטוף.</li>
	<li>להעביר את העמודה ספין צינור microfuge טריים, להוסיף 60 µL של מים (לא טה) - לחכות 1-3 דקות, ואז צנטריפוגה 10 s כדי elute את ה-DNA.</li>
	<li>למדוד ריכוז על ידי הוספת 5 µL של ה-DNA µL 195 של ריאגנט רגישות גבוהה dsDNA, כי כבר 1:200 מדולל במאגר רגישות גבוהה dsDNA ולאחר מכן פלורסצנטיות מדידה ב fluorometer, באמצעות µL 10 התקנים שסופקו לכיול; מצפה בין 10 עד 50 ng של התשואה הכוללת הדנ א.</li>
	<li>Sonicate (שיא האירוע כוח 450, פקטור חובה 30%, מחזורים לכל פרץ 200, טיפול זמן 60 s, מפלס המים 6) כדי לשבור את ה-DNA לחלקים bp 250-350.</li>
	<li>להכין ספריה באמצעות ערכת הכנה דגימת דנ א, רצף זה (לפחות 10 מיליון 50 bp יחיד-end reads) על הכלי רצפי DNA במצב מהיר (ראה הערה לדיון (5)).</li>
</ol>4. ניתוח של רצף נתונים והפקת שכפול פרופילים
<ol><li>ליישר רצפי הגנום sacCer3 האפייה באמצעות Gsnap12 (ראה הערה לדיון (6)).</li>
	<li>לקבוע לכל בסיס זוג לקרוא לעומק באמצעות תוכנת Bedtools' "genomeCoverageBed"13.</li>
	<li>להסיר קוצים artefactual בעומקים קרא, אם מתנה (ראה הערה לדיון (7)).</li>
	<li>חלקה לקרוא לעומק על ידי כרומוזום באמצעות medians 20 kb הזזה חלון באמצעות הפונקציה "runMean" ב- R חבילת "caTools" (ראה הערה לדיון (8)).</li>
	<li>מגרש לקרוא לעומק שלב S, G2 מוקדם ו G2 מאוחר כאחוז משוכפל לגמרי במעמקי קריאה (ראה הערה לדיון (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

טכניקה זו היא חזקה, יחסית ישר קדימה, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות מוקדש הבאות:
(1) אנו ממליצים כי תרבויות לגדול במשך לפחות 12 שעות לפני שהם מגיעים שלב יומן, שכן ההבדלים באה לידי ביטוי מחזור התא הפצות אם תרבויות נקצרים לאחר שהגיעו ה הרצוי צפיפות 4 רק לאחר חיסון. ההנחה שלנו היא כי התפלגות מחזור התא זה הגיע שיווי משקל יציב יחסית מייצג טוב יותר התפלגות שלב יומן "אמיתי" יותר התפלגות זה עדיין בתוך השטף כאשר תרבות רווי הועבר לאחרונה כדי בינוני טרי.
(2) במקום של ספינינג למטה...

שכפול גנום האיקריוטים מאותחלת באתרים נפרדים מרובים, שנקרא מקורותיה של שכפול, בשכפול אילו מזלגות להמשיך בשני הכיוונים (שבתוך Fragkos. et al., 20151). המקורות נבדלים הן שלהם העיתוי ואת היעילות של ירי, מספר טכניקות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות מקור שכפול, להבהיר את הסיבות של וריאציה זו. הפעילות של המקורות הבודדים שניתן להסיק מן רמות של דנ א חד גדילי2, המהווה סביב מקורות פעילים, או באמצעות דו-ממדית בג'ל כדי לפקח על שכפול ספציפי ביניים3, אשר שניהם להיות מזוהה עם הגששים רדיואקטיבי. שניהם של טכניקות אלה יוחלו ביתר קלות לפי cerevisiae ס מאשר בתאי יונקים, כי מקורות מוגבלים ספציפית ידועים רצפי לשעבר. עם כניסתו של מיקרו-מערכים, זה הפך אפשרי להעריך מקור ירי באופן גלובלי. זה נעשה לראשונה על ידי תיוג DNA עם איזוטופים כבדים, שחרור תאים בלוק G1 לתוך בינוני המכיל אור האיזוטופים, וניטור ואז היווצרות של כבד-אור היברידית DNA ברחבי הגנום4. המבוא של רצפי התפוקה גבוהה מותר הגנום כולו דומה ניטור של מקור פעילות ללא הדרישה של תיוג איזוטרופי יקר. התאים היו ממויין של cytometer הזרימה על פי תוכן ה-DNA ו- DNA שלהם נתון רצף עמוק. בגלל רצף כיסוי בהתאמה מ 1 x 2 x במהלך שלב S, תזמון שכפול יחסית יכול להיות מוערך על ידי השוואת בעומק קריאה של תאים בשלב S לאלה ב- G1 או G25,6. שיטות אלה, במיוחד שהוחל שמרים, הובילה הבנה עמוקה יותר של כיצד רצף הדנ א הכרומטין, חלבונים שכפול ה-DNA להסדיר מקור תזמון ויעילות.
הנאמן והעברת מידע גנטי במהלך ההפצה הסלולר מחייב חניכה לא רק מוצלח של שכפול ה-DNA, באישון מוצאו, אלא גם סיומו המוצלח של שכפול, אשר מתרחשת שבו נפגשים מזלגות שכפול. כמו חניכה של שכפול, העיתוי של השלמת השכפול משתנה לאורך הגנום עם אזורים מסוימים שנותרו unreplicated אפילו מאוחר במחזור התא. אזורים כאלה עשויים להיות רחוקים במיוחד ממוצא שכפול active או עשוי להכיל רצפים או מבנים כרומטין הפוגעים דנ א polymerases. מאוחר לבצע שיכפול אזורים עלולים להתבטא כמו אתרים שבירים, אשר משויכות כרומוזומלית וקצבי מוטציה גבוהה יותר, היו מעורבים בסרטן, הזדקנות-7,-8,-9. עם זאת, למרות החשיבות של השלמה נאותה של שכפול ה-DNA בתחזוקה של יציבות הגנום, ההבנה שלנו של איפה ואיך זה מתרחש יש פיגרה של שכפול חניכה. בעוד גנים בודדים שכפול מאוחר אשר שויכה המחלה נחקרו עם, למשל, qPCR10, מחקרים הכללית מכוונת שחקרתי את המיקומים, שבבסיס גורם של המנוח מחסירה שכפול. כאן נתאר טכניקה שאנו מתייחסים כאל "G2 seq" שבו אנו משלבים cytometry זרימה עם תפוקה גבוהה רצף לשפוך אור על השלמתו של שכפול גנום של שמרים11. עם שינויים קלים, ניתן להתאים פרוטוקול זה תאים שניתן זרימה ממוין על פי תוכן ה-DNA.

<table><tbody><tr><td>ערכת DNA גנומי של YeaStar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>מושעה ב 50 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 מ"מ נתרן ציטראט, תמיסת pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase (0.25 מ"ג / מ"ל)</td> <td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 מ"ג / מ"ל RNaseA מושעה ב 50 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2, מרתיחים תמיסת RNase למשך 10 דקות לפני השימוש הראשון בלבד, ומכאן ואילך יש לאחסן ב -20 מעלות;</td></tr><tr><td>תמיסת פרוטאינאז K (20 מ"ג / מ"ל)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>מושעה ב -10 מ"מ Tris, pH 7.5, 2 מ"מ CaCl2, 50% גליצרול, יש לאחסן בטמפרטורה של -20&deg; C</td></tr><tr><td>דגם 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III עמודות</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris דגם LE220 ממוקד-אולטראסוניקטור</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT ערכת הכנה לדוגמא</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 מכשיר</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap יישור תוכנה</td><td>תוכנת קוד פתוח / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

טכניקות רבות פותחו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של שכפול ה-DNA באמצעות שלב S של מחזור התא. רוב שיטות אלה מכוונת כלפי הבהרה של המיקום והעיתוי של חניכה של שכפול גנום ולא להשלמתו. עם זאת, קריטי כי אנחנו מבינים אזורים בגנום כי הם אחרון להשלמת השכפול, כי אזורים אלה סובלים רמות גבוהות של כרומוזומלית, מוטציה, הם קושרו עם מחלה והזדקנות. כאן נתאר איך הרחבנו את טכניקה בה נעשה שימוש כדי לפקח על שכפול חניכה במקום לזהות אזורים אלה של הגנום אחרונה על שכפול מלאה. גישה זו מבוססת על שילוב של cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה. למרות הדו ח מתמקד היישום של טכניקה זו שמרים, הגישה ניתן להשתמש עם כל התאים ניתן למיין ב cytometer זרימה לפי תוכן ה-DNA.

השתמשנו ההליך המתואר לעיל כדי לזהות אתרים שכפול מאוחר ניצני שמרים. בדיקות גישה זו באמצעות אזור שכפול מאוחר ידוע על כרומוזום מלאכותי הוכיח את הטכניקה להיות מדויקות ואמינות. התוצאות שלנו הוכיחו את חשיבות במועד השלמת השכפול הביולוגית על-ידי הצגת מאוחר שכפול אזור בכרומוזום 7, אשר זיהינו כמו שכפול מאוחרת על בסיס התוצאות G2-seq שלנו, אבד יבול בתדירות גבוהה יותר מאשר דומות לשלוט באזור11.
דוגמה ספציפית את התוצאות...

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו לביצוע ריצוף עמוק של DNA מתאים לתאים שעברו מיון באמצעות זרימה (flow sorting) לפי שלבי מחזור התא, היא לזהות אזורים בגנום המשכפלים בשלב מאוחר מאוד של מחזור התא. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום השכפול של ה-DNA, כגון אילו אזורים בגנום מתקשים להשלים את שכפול ה-DNA ולפיכך פגיעים במיוחד לארגון מחדש של הגנום. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שלמרות שהיא פשוטה מאוד מהבחינה הניסויית, היא מספקת תובנה עשירה להפליא לגבי הדינמיקה של השכפול הגנומי.ראשית, יש להחדיר תאי שמרים רלוונטיים למבחנות בדיקה של 15 מיליליטר המכילות שמונה מיליליטרים של YEPD. ניתן להשתמש במצע סינתטי או במצע עשיר. יש לגדל את התאים למשך לילה, לפחות 12 שעות, כדי לאסוף אותם במהלך התפלגות שלב הלוגריטמי האמיתי שלהם.ביום למחרת, כאשר התרביות נמצאות בצפיפות של 5 עד 15 מיליון תאים למיליליטר, סבב את התאים במערבל (spin down) ושחזר אותם ב-1.5 milliliters של 70% ethanol. לאחר מכן, העבר את הסספנסיה למבחנה של 1.6 milliliter microfuge והשאר את התאים לדגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה, או למשך שלוש שעות לפחות על קרח. לאחר ההחדרה, סבב את התאים במערבל ושחזר אותם ב-1 milliliter של sodium citrate.לבסוף, בצעו סוניקציה קצרה של התאים פעמיים. לאחר מכן, חזרו על מחזור הצנטריפוגציה ושחזרו את השמרים ב-1 mL של נתרן ציטראט המכיל RNase. אפשרו ל-RNase להגיב עם השמרים ב-50 °C למשך שעה, או למשך הלילה ב-37 °C בבלוק חימום או במקלח מים.לאחר הטיפול ב-RNase, הוסיפו 50 µL של תמיסת proteinase K לתערובת והמשיכו את התגובה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 50 °C. לאחר מכן, סובבו את התאים למטה (spin down) ושחזרו אותם ב-1 mL של נתרן ציטרט. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה ושאבו את העילוי באמצעות ואקום.לאחר מכן, בתאורה עמומה, השהו מחדש את התאים ב-1 ml של סודיום ציטראט עם צבע גרעיני ירוק. כעת, דגרו את השמרים בחושך למשך שעה בטמפרטורת החדר. כדי להמשיך, ספרו את התאים באמצעות מיין תאים (cell sorter) תוך שימוש בנתוני פליטה של 530 nm.מיינו אותם לפי תכולת ה-DNA שלהם לשלבי מחזור התא: G1, S, G2 מוקדם ו-G2 מאוחר. אספו לפחות 1.6 מיליון תאים הפלואידיים מכל שלב. מיד לאחר מיון התאים, סובבו אותם בצנטריפוגה למשך 20 דקות. שאבו את העליון והקפיאו את המשקע בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לאחסון.מצאנו כי השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא פשוט סבב (centrifugation) של התאים מיד לאחר איסופם, לכל היותר שעה לאחר המיון. הפקת זו מבוססת על ערכה להפקת DNA גנומי משמרים. התחילו בהוספת 120 µL של בופר עיכול וחמישה µL של אנזים ליטי לשמרים.לאחר מכן, ערבבו את התאים לתוך תערובת התגובה באמצעות וורטקס והדגרימו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך 40 עד 60 דקות. כעת, הוסיפו 120 µL של בופר ליזיס וערבבו את התערובת בוורטקס במהירות גבוהה למשך 10 עד 20 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של כלורופורם וערבבו היטב את תכולת המבחנה למשך דקה אחת.בשלב הבא, סבבו את המבחנה במהירות מרבית למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) לעמודת קישור ה-DNA. סבבוב את הנוזל העליון דרך העמודה באמצעות מחזור סריפוגציה של דקה אחת במהירות מרבית.כדי לשטוף את ה-DNA מממברנת העמודה, העבירו את העמודה למבחנת איסוף חדשה והוסיפו 300 µL של תמיסת שטיפה ל-DNA. לאחר מכן, חזרו על הסנטריפוגציה במהירות מרבית למשך דקה אחת. חזרו על שלב שטיפה זה פעם אחת נוספת.כדי לאסוף את ה-DNA, העבירו את עמודת הספין למבחנה חדשה. הוסיפו 60 µl של מים והמתינו אחת עד שלוש דקות. לאחר מכן, סובבו את העמודה בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 10 שניות כדי לבודד את המים המכילים את ה-DNA שנשטף (eluted DNA).כעת הוסיפו בין 5 ל-195 µL של בופר לרגישות גבוהה עבור DNA דו-גדילי המכיל ריאגנט בריכוז של 1:200. לאחר מכן, מדדו את הפלואורסצנציה של הדגימה כדי לחשב את התנובה. הצפי הוא לאיסוף של בין 10 ל-50 ng של DNA.כעת השתמשו בסוניקציה כדי לפרק את ה-DNA למקטעים שגודלם בין 250 ל-350 זוגות בסיסים. לאחר מכן השתמשו בערכה סטנדרטית להכנת ספריית DNA ובצעו רצף גנומי באמצעות לפחות 10 מיליון קריאות single-end של 50 זוגות בסיסים. הפרוצדורה המתוארת שימשה לזיהוי אתרים בעלי שכפול מאוחר בשמרים בנביטה.תאים נורמליים הושוו לתאים שחסר בהם Sir2, חלבון דה-אצטילאז. הנתונים הגולמיים הכילו קפיצות גדולות שנבעו בעיקר מנוכחותם של אלמנטים מסוג TY. קפיצות אלו הוסרו על ידי הגבלת עומקי הקריאה למכפלה של 2.5 בחציון עומק הקריאה עבור כל דגימה.לאחר מכן, הנתונים לאחר הסרת ה-spikes הוחלקו באמצעות חלון הזזה של 20 kb. לבסוף, הנתונים ננרמלו ושורטטו כיחסים לרמות ב-G1. תא שאינו משוכפל כלל יופיע ב-0.5, ותא משוכפל לחלוטין יופיע ב-1. בנתונים אלו מכרומוזום שבעה, נמצאו ראיות לאזור שוכפל מאוחר ידוע במוטנט Sir2.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות את אותם אזורים בגנום שבהם השלמת השכפול של ה-DNA היא האחרונה, ולכן הם פגיעים במיוחד לשברים ב-DNA ולבעיות אחרות הקשורות לשכפול מאוחר.

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

אנו מתארים כאן גישה מהירה ופשוטה יחסית למיפוי תזמון שכפול יונקים ברחבי הגנום, מבידוד תאים ועד לניתוח בסיסי של תוצאות הריצוף. מפה גנומית של תוכנית שכפול מייצגת תסופק בהתאם לפרוטוקול.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן, אנו מתארים את ההליך לניתוח התקדמות השכפול באמצעות חזרות פתוגניות, נוטות למבנה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

למד טכניקת G2-seq לזיהוי אזורי שיכפול מאוחרים בגנום באמצעות מיון תאים לפי מחזור התא וריצוף עמוק. שיטה זו חושפת דינמיקת שיכפול DNA ומסייעת לחקר יציבות גנומית.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

גלה סרטונים נוספים