דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדל זיהום בנגיף הזיקה במוח האנושי המתפתח באמצעות אורגנואידים מוחיים שמקורם בתאי גזע. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה כגון, אילו תאים מסוגלים להידבק ואילו חלבונים מעורבים במסלול ההדבקה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מחקה זיהום אנושי מוקדם, ניתן להשתמש בה במבחני תפוקה גבוהה וניתן לשלב אותה עם טכניקות גנטיות ממוקדות כגון CRISPR.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנון ההדבקה בנגיף הזיקה. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון מסכי תרופות ופסאודוטיפ של וירוסים. באמצעות שיטות תחזוקה רגילות של תאי גזע, הביאו את התרביות למפגש של בין 50% ל-70%.

בדוק את התרביות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 10 עד פי 20 וודא שלמושבה יש מורפולוגיה בריאה ללא התמיינות ניתנת לזיהוי. הביאו את אמצעי התחזוקה של תאי גזע ללא קסנו ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים והפשירו שני מיליליטר של מגיב ניתוק אנזימטי ובקבוקון של 50 מיקרוליטר של מעכב הסלע בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו צלחת חיבור נמוכה במיוחד U תחתונה 96 בארות, פיפטה רב-ערוצית p200 ומאגר ריאגנטים של 25 מיליליטר.

לאחר מכן, יש להוציא 45 מיליליטר מהמדיה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. מוסיפים 45 מיקרוליטר של מעכב הסלע ומערבבים פנימה את המעכב היטב על ידי טריטרציה של התערובת, ולאחר מכן שתיים עד ארבע בגרסאות. שואבים בוואקום שתי בארות של צלחת שש בארות המכילות תאי גזע ומוסיפים במהירות מיליליטר אחד של מגיב ניתוק ללא אנזימים לכל באר, ולאחר מכן, דוגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות.

לאחר מכן, שאפו את הבארות המטופלות בוואקום והוסיפו מיליליטר אחד של מגיב ניתוק אנזימטי לכל באר. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוציאו את הצלחת מהחממה. הקש בעדינות על הצלחת כדי לפרק את כל התאים המצטברים.

לאחר מכן, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. אם אשכולות תאים גדולים עדיין נראים לעין, דגרו על הצלחת למשך שתי דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. חזור על השלב עד שהאשכולות כבר לא נראים בעין בלתי.

לאחר שהתאים מנותקים כראוי, הוסף מיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה של תאי גזע חופשיים לכל באר, כדי לנטרל את אנזימי הדיסוציאציה. משוך את תרחיף התאים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר וקח מנה קטנה לספירת תאים. בזמן הצנטריפוגה, ספרו את התאים וקבעו את נפח ההשעיה מחדש הדרוש להשגת 60,000 תאים לתרחיף מיליליטר.

הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-60,000 תאים למיליליטר במדיה המכילה את מעכב הסלע. בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, מערבבים את התאים בעדינות חמש עד 10 פעמים על מנת להבטיח תרחיף תאים אחיד. הוסף מיד את תרחיף התא למאגר הריאגנטים והשתמש בפיפטה p200 רב-ערוצית כדי להעביר 150 מיקרוליטר לכל באר של חיבור נמוך במיוחד אתה מתחת לצלחת 96 בארות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב-150 x G למשך דקה אחת ולאחר מכן הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. אל תפריע לצלחת למשך 48 שעות. החל מהיום השני, הכינו 17 מיליליטר של מדיה המכילה 17 מיקרוליטר של מעכב הסלע במלאי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

מחממים את התערובת ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים. קח את צלחת האורגנואיד מהחממה ובעזרת פיפטה p200 רב ערוצית, שאב לאט לאט 75 מיקרוליטר מדיום משולי הבארות בשורה הראשונה. לאחר מכן, הוצא אותו במהירות חזרה לבאר כדי להרים תאים רופפים ואורגנואידים.

חזור על תהליך פיזור זה עבור כל שורה. המתן 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לתחתית כל באר ולאחר מכן שאב לאט ובזהירות 75 מיקרוליטר מדיום מכל באר באמצעות פיפטה p200 רב-ערוצית והוציא אותו למאגר פסולת. לאחר מכן, העבירו את המדיה המכילה את מעכב הסלע למאגר ריאגנט, הזרימו 150 מיקרוליטר של מדיה לכל באר אורגנואיד ולאחר מכן דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס.

חם 17 מיליליטר תרבית טרייה בינונית עד 37 מעלות צלזיוס, הפעם ללא כל מעכב סלע. באמצעות פיפטה רב-ערוצית p200 המוגדרת ל-100 מיקרוליטר, חזור על תהליך הפיזור שהוצג קודם לכן והמתן 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לתחתית הבארות שלהם. לאחר מכן, שאפו בזהירות 125 מיקרוליטר מדיום מכל באר והחליפו ב -150 מיקרוליטר מדיה מחוממת.

הנח את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס. מכינים את המדיום לפי המתכון המוצג כאן ואז מסננים סטריליים את התמיסה המעורבת בפילטר של 500 מיליליטר. מהיום הרביעי ועד לזיהום התאים בערך ביום ה-24, בצע תחזוקה שוטפת כל יומיים באמצעות מדיום אינדוקציה עצבית.

לאחר הסינון, יש לחמם 17 מיליליטר ממדיום האינדוקציה העצבית ל-37 מעלות צלזיוס ולאחסן את השאר בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה p200 רב-ערוצית, המוגדרת ל -100 מיקרוליטר, מפזרים את כל הבארות של צלחת האורגנואיד שהוצגה בעבר. המתן 15 שניות כדי לוודא שהאורגנואידים שקעו לקרקעית הבארות שלהם.

שאפו בזהירות 125 מיקרוליטר מדיום מכל באר והחליפו אותו ב-125 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבי טרי. חזור על הישג האינדוקציה הנרלית הזו כל יומיים עד שהאורגנואידים מוכנים להדבקה בנגיף הזיקה. הביאו את תמיסת המלח המאוזנת 1x של ארל, 1x PBS ומדיום אינדוקציה עצבית ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים.

לאחר מכן, יש לדלל את נגיף הזיקה בריכוז ידוע בתמיסת ארל 1x לריבוי היעד של הזיהום, שהוא בדרך כלל בין 0.1 ל-10. בעזרת פיפטה p200, הסר בזהירות את כל המדיום מכל אורגנואיד היטב. לאחר מכן, שטפו במהירות את האורגנואידים עם 200 מיקרוליטר PBS מחומם 1x.

כאשר מוציאים את המדיה מכל באר, חשוב לא לגעת באורגנואיד או לשאוב אותו לתוך הפיפטה. זה יכול לגרום לנזק בלתי הפיך לאורגנואיד. אם זה קורה, עדיף להשליך את האורגנואיד.

לאחר מכן, הסר בזהירות את כל הנוזלים שנותרו מכל באר אורגנואיד באמצעות פיפטה p200 תעלה אחת. לאחר מכן, הוסף במהירות 50 מיקרוליטר של תמיסת ארל 1x לזיהום מדומה או תמיסת נגיף זיקה לכל באר. ודא שכל אורגנואיד שקוע לחלוטין בסיום, הנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר השלמת חשיפה ויראלית, יש לשטוף כל באר של האורגנואידים עם 200 מיקרוליטר PBS. אפשר לאורגנואידים להתיישב למשך 15 שניות ולאחר מכן הסר את ה-PBS באמצעות פיפטה p200 ערוץ יחיד. לבסוף, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבי טרי לכל באר והנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור.

ניתן לשלב צביעה עם DAPI, פוספו-וימנטין, TBR2 ו-MAP2 כדי להראות את המבנים בקליפת המוח הנוצרים בתוך האורגנואידים. מבנים אלה כוללים את אזור החדר, האזור התת-חדרי, אזור הביניים וצלחת קליפת המוח בתוך כל שושנה. תרבית האורגנואידים ליום 108, מאפשרת להתבונן בשלבי ההתפתחות המאוחרים יותר.

בעוד שכבות קליפת המוח אינן בולטות כל כך בסוג זה של אורגנואיד, המעבר הטבעי לגליוגנזה מתרחש בדומה ל-in-vivo. שלושה ימים לאחר הדבקה בנגיף הזיקה, הבדל בגודל האורגנואידים נראה לעין. קנה המידה של הבדל זה תלוי בריבוי הנגיפי של הזיהום המופעל על האורגנואידים.

הבדל זה בגודל האורגנואידים יגדל במהלך השבוע הבא עד שהאורגנואידים הנגועים יתחילו להתפרק. לאחר שלושה ימים, תהיה גם עלייה בפסולת התאים בבארות הנגועות בהשוואה לבארות המדומה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד על נוהלי מעבדה בטוחים מכיוון שנעשה שימוש בחומרים זיהומיים ברי קיימא.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה או RNAC על מנת לענות על שאלות נוספות על הביולוגיה המעורבת בזיהום בנגיף הזיקה התפתחותי עצבי.