הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במורפולוגיה של שלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות ולבצע לוקליזציה ספציפית של חלבון בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתקופת מחקר השלפוחית החוץ-תאית, כגון סיווג האקסוזום וחלבונים ספציפיים הנמצאים בתוכו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להתבונן בחלק של חלבונים ספציפיים הממוקמים הן בתוך האקסוזום והן מחוצה לו.

המשמעות של טכניקה זו היא להבטיח אבחון של מספר מחלות, כולל סרטן וזיהומים חיידקיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האקסוזום, ניתן ליישם אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות, דגירה מיקרו-תאית ולוקליזציה ספציפית של חלבונים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל יצירת זיהום בזמן קשירה לא ספציפית של חלקיק אימונוגולד.

בעזרת טכניקות סטנדרטיות, הכינו אקסוזומים בתרבות. לאחר מכן אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנטנט התרבית של תאי HCT116 כדי לגלול את האקסוזומים מהתקשורת. לאחר הגלולה, הסר בזהירות את חומר התרבית.

כדי לתקן את גלולת האקסוזום המטוהרת, הוסף מיליליטר אחד של 2.5% גלוטראלדהיד בתמיסת קקודילאט סולדיום מולרית 0.1 ב-PH 7.0. דגרו על שלפוחיות שכבת השומנים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הקיבוע ושטוף את הכדורים במיליליטר אחד של תמיסת חיץ נתרן קקודילאט 0.1 מולרית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן יש לתקן את הדגימות במיליליטר אחד של 2% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הקיבוע ושטוף את כדור האקסוזום שלוש פעמים עם מאגר הנתרן קקודילאט 0.1 מולארי, והחלף את המאגר כל עשר דקות. לאחר מכן ייבשו את הדגימה על ידי ניעור במשך 10 דקות כל אחת בסדרה של ריכוזי אצטון מדורגים.

לאחר מכן, מערבבים תמיסה של שלושה חלקים אצטון וחלק אחד של תערובת הטבעה עם צמיגות נמוכה. החלף את האצטון בתערובת זו ודגר את הדגימה למשך 30 דקות. המשך להגדיל את היחס של מדיום ההטמעה של צמיגות נמוכה, תוך דגירה למשך 30 דקות בכל שלב.

לבסוף, דגרו את גלולת האקסוזום ב-100% מתערובת ההטמעה בצמיגות נמוכה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, הטמיעו את הדגימה בתערובת הטמעה טהורה עם צמיגות נמוכה באמצעות תבנית הטבעה ואפו אותה במשך 24 שעות בחום של 65 מעלות צלזיוס. בעזרת אולטרה-מיקרוטום, הכינו קטעים בעובי של 60 ננומטר.

מניחים את החלקים על רשת ניקל ומכתימים את חלקם פעמיים באורניל אצטט 2% למשך 20 דקות, ולאחר מכן ציטראט עופרת למשך 10 דקות. לאחר מכן, הנח את החלק המוכתם במיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצפה בדגימה באמצעות 80 קילו-וולט ופעל לפי ההגדרות האוטומטיות לזמן החשיפה. עם תמונה אקסוזומית בתצוגה, רכוש ושמור את התמונה באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.

כדי להתחיל, דגרו רשתות המכילות קטעים לא מוכתמים בעובי 60 ננומטר בטיפות של 50 מיקרוליטר של 0.02 גליצין מולארי למשך 10 דקות כדי להרוות את קבוצות האלדהיד החופשיות. לאחר מכן, שטפו את החלקים ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר השטיפה האחרונה, יש לדגור את החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר ב-PBS המכיל 1% BSA.

לאחר מכן, דגרו את הרשתות בטיפות של 50 עד 100 מיקרוליטר של נוגדן נגד KRS למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את הרשתות חמש פעמים למשך 10 דקות כל אחת בטיפת PBS המכילה 0.1% BSA. לאחר מכן, העבירו את הרשתות לטיפה של נוגדן משני מתאים ודגרו על החלקים למשך שעה בטמפרטורת החדר.

כעת, שטפו את הרשתות חמש פעמים למשך 10 דקות, כל אחת עם טיפה נפרדת של PBS המכילה 0.1% BSA. צבעו פעמיים את החלקים עם אורניל אצטט 2% למשך 20 דקות בחושך ואחריו ציטראט עופרת ריינולדס למשך 10 דקות. הנח את החלק המוכתם במיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצפה בדגימה באמצעות 80 קילו-וולט וצלם אותם כפי שהוצג קודם לכן.

על מנת לבצע צביעה שלילית, יש לתקן את האקסוזומים המטוהרים לאחר הבידוד עם מיליליטר אחד של 2% פרפורמלדהיד למשך חמש דקות. טפל ברשתות EM דקיקות, מצופות פורמבר/פחמן, 200 רשת, נחושת עם פריקת זוהר למשך דקה אחת, ולאחר מכן טען חמישה עד שבעה מיקרוליטר מתמיסת המתלה האקסוזומית על רשת ודגר אותה למשך דקה אחת. אם ריכוז האקסוזום גבוה מדי, יש לדלל את הריכוז לרמה מתאימה.

מכתים מיד את האקסוזומים בכ -20 טיפות של תמיסת אורניל אצטט מסוננת 1% על פני רשת ה- EM. הסר את תמיסת האורניל אצטט העודפת מהרשת על ידי מגע עם קצה הרשת עם נייר פילטר, ולאחר מכן שטוף במהירות את הרשת בטיפת מים. השתמש בזוג פינצטה כדי להניח את הרשת על השולחן ולכסות את הרשת חלקית בצלחת תרבות.

הניחו לרשת להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צלמו את הרשת או אחסנו אותה בקופסת רשת מיקרוסקופ אלקטרונים לתצפית עתידית. התחל בטיפול בפורמבר/סרט פחמן דק, 200 רשתות EM נחושת רשת עם פריקת זוהר למשך 30 שניות. לאחר מכן, טען חמישה עד שבעה מיקרוליטרים של האקסוזומים הקבועים בתמיסת 2% פרפורמלדהיד על הרשת ודגר אותם שם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שטפו את האקסוזומים עם 100 מיקרוליטר PBS, שלוש פעמים כל אחד למשך 10 דקות. טפל ברשתות המכילות אקסוזום עם 50 מיקרוליטר של תמיסת גליצין 0.5 מולרית למשך 10 דקות כדי להרוות את קבוצות האלדהיד החופשיות. לאחר מכן, העבירו את הרשתות לטיפה של PBS המכילה 1% BSA וחסמו למשך 30 דקות.

כעת דגרו על הרשתות עם 50 עד 100 מיקרוליטר של נוגדנים נגד PD-L1 למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הרשת בחמש טיפות נפרדות של PBS המכילות 0.1% BSA למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן העבירו את הרשת לטיפה של הנוגדן המשני למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את הרשת בחמש טיפות נפרדות של PBS המכילות 0.1% BSA למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטפו את הרשת בשתי טיפות נפרדות של מים מזוקקים.

בסיום, בצע צביעה שלילית עם 2% אורניל אצטט, כפי שהוצג קודם לכן, ודמיין את הדגימות, או אחסן אותן בקופסת רשת EM לתצפית עתידית. המורפולוגיה האקסוזומית שנצפתה כאן היא תוצר של צביעה שלילית. אקסוזומים אלה מראים מורפולוגיה טיפוסית בצורת, שהיא חפץ שיכול להתרחש במהלך תהליך הייבוש.

ניתן לקבל מידע נוסף באמצעות צביעת אימונוגולד שלמה, כגון מיקומם של חלבונים ספציפיים באקסוזום. כאן, החצים הלבנים מציינים את מיקומו של PD-L1. בתמונות חתוכות, השלפוחיות הראו מבנה לומן הידוע כמאפיין מבני של אקסוזומים.

גם אלה יכולים להיות צבועים באימונוגולד כדי לזהות חלבונים ספציפיים בכל האקסוזומים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את טכניקת הצביעה של אימונוגולד בתאים סיביים לאחר הכנה וחתך פשוטים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו צביעה חיסונית כפולה כדי לזהות בו זמנית את מיקומם של שני חלבונים שונים.

לאחר כל פיתוח, ניתן להשתמש בטכניקה זו בתחום השלפוחיות החוץ-תאיות כדי לחקור אבחנות מחלות בביופסיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות לוקליזציה ספציפית של חלבון בתוך האקסוזום. אל תשכח שהם עובדים עם תמיסות מקבעות, כגון כלורוהידרט, פרפורמלדהיד ואוסמיום טטרוקסיד יכולים להיות מסורבלים ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון מכסה אדים מאוורר וכפפות לטקס בעת ביצוע הליך זה.