חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבל את המבנה התלת-ממדי של קומפלקס האקסוזום באמצעות שיטת הנטייה הקונית האקראית (random conical tilt). מטרה זו מושגת תחילה על ידי השקעת שכבה דקה של סרט פחמן על רשת פחמן מחוררת (holy carbon grid) כדי ליצור את תשתית התמיכה עבור קומפלקס החלבון, ובשלב שני באמצעות צביעה. הדגימה והצבע מומרים על הרשת, דבר הגורם להטמנת הדגימה במלחים של מתכות כבדות.

לאחר מכן מבוצעת מיקרוסקופיה אלקטרונית כדי לקבל זוגות מיקרוגרפים בזוויות נטייה של הדגימה. לבסוף, מתקבלים תוצאות המראות את המבנה התלת-ממדי של קומפלקס האקסוזום על בסיס ניתוח תמונה בשיטת ה-random conical tilt. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות, שכן לעיתים הכנת הדגימה לשיטת ה-random conical tilt היא מאתגרת, וכך גם הליך עיבוד התמונה שבאה בעקבותיה.

הדגמה של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי דירוג והכנת הדגימה קשים ללמידה ללא המחשה של הערכת הדגימה. העיקרון של שיטת ההטיה הקונוסית האקראית דורש צילום של זוג מיקרוגרפים מאותו אזור של דגימה בתוך מיקרוסקופ האלקטרונים. תמונה אחת מצולמת כאשר הדגימה במצב ללא הטיה, והתמונה השנייה מצולמת כאשר הדגימה מוטה בזווית שבין 50 ל-70 מעלות. באמצעות המחשב, זוג המיקרוגרפים המודגיתים מוצב זה לצד זה, ובבדיקה זו נבחרים תמונות מאותם חלקיקים.

תמונות אלו מסומנות במספרים בקואורדינטות תלת-ממדיות. התמונות של חלקיקים שאינם מוטים והשותפים המוטים שלהם מקושרים זה לזה על ידי כיוון ציר ההטיה וזווית ההטיה. יישור התמונות של החלקיקים שאינם מוטים מביא את התמונות של החלקיקים המוטים למיקומי ה-asMule המתאימים להם; באמצעות תמונות מרובות של חלקיקים מוטים הממלאים את המרחב האזימותי, ניתן לשחזר את המבנה התלת-ממדי של המולקולה באמצעות אלגוריתם של היטל אחורי (back projection). כדי להכין את הרשתות, הכין תחילה תמיסת 0.5% form VAR על ידי הוספת 0.45 גרם שרף poly vinyl formal ו-90 מיליליטר chloroform לכוס כימית מזכוכית בנפח 100 מיליליטר.

בתוך מנדף כימיים, כסו את הכוס עם נייר אלומיניום והמיסו את שרף ה-form var. בעזרת שרביט ערבוב מגנטי קטן ומערבל מגנטי, השָרף נמס תוך כ-15 דקות. בינתיים, נקו למסחיתי זכוכית למיקרוסקופיה שעברו ניקוי מוקדם באמצעות מתנול ומטשפוני Kim wipes.

לאחר ששרף ה-form var התמוסס לחלוטין בתוך כלורופורם, הוסיפו מיליליטר אחד של glycerol בריכוז 50% לפני השטח של התמיסה. התאמת נפח ה-glycerol המוסף משפיעה על צפיפות החורים ב-holy carbon.

הטמיעו את קצה המתמר האולטרסוני לתוך התמיסה. בעומק של כאינץ' אחד, השתמשו בהספק מרבי לביצוע סוניקציה למשך דקה אחת, דבר שיצור אמולסיה של טיפות גליצרול בתוך התמיסה שלנו. סוניקציה ממושכת יותר תגרום להיווצרות חורים קטנים יותר בפחמן הנקבי.

התמיסה הופכת לעכורה לאחר שלב זה. מיד לאחר הטבילה באולטרסאונד (sonication), הכניסו את השקופיות הזכוכית הנקיות בצורה אנכית לתוך האמולסיה. לאחר שנייה אחת, הוציאו אותן וייבשו את תחתית השקופיות באמצעות נייר סינון כדי ליצור שכבת פלסטיק דקה על פני השטח של השקופיות.

לאחר התאיידות הכלורופורם, בדוק את צפיפות וגודל החורים בסרט תחת מיקרוסקופ אור. תנאי ההכנה המתוארים כאן אמורים להניב 10 עד 20 חורים בכל ריבוע של רשת 400 mesh, עם קטרים שבין שלושה לארבעה מיקרומטרים. ברגע שתzמזלHחית השקופיות יתייבשו, גזור את קצוות סרט הפלסטיק על פני השטח של השקופית.

הצמדו את הסרט לפני השטח של מים מזוקקים על ידי טבילה אנכית של העגלה למים. ניתן להבחין בסרט הדק על פני המים בזווית חדה אל מול השתקפות האור. הניחו רשתות נחושת בדרגת 400 mesh על הסרט, אחת אחת, כאשר הצד החלק של הרשת פונה כלפי מטה.

הרימו את יריעת הפלסטיק עם הסריג באמצעות פיסת נייר. הפכו את הנייר והניחו לו להתייבש. בצלחת פטרי, השרו את הנייר במתנול כדי להסיר את הגליצרול שנותר בחורים והניחו לנייר להתייבש באוויר.

השתמש במאדה פחמן כדי לצפות את הסריגים בשכבת פחמן בעובי של כ-20 nanometers. השתמש בזמן האידוי כדי לשלוט בעובי הרצוי. ניתן לקבוע את העובי לפי גוון האפור של הפחמן בהשוואה לגוון האפור של שכבת פחמן בעובי ידוע.

השרו את רשתות הפחמן בעלות השכבות בכלורופורם בתוך צלחת פטרי מזכוכית למשך חצי שעה להסרת ה-form var; ייבוש הרשתות לאחר מכן יוביל ליצירת רשתות פחמן נקבוביות (holy carbon grids) בהכנה ביתית. לאחר מכן, מאדו את שכבת פחמן דקה בעובי של כ-5 nm על פני שטח של מיקה שנוקתה זה עתה. לאחר מכן, הניחו בזהירות את רשתות הפחמן הנקבוביות על פיסת נייר סינון תחת מים מזוקקים.

במכשיר מאולתר, צפו את הפחמן הדק מפני השטח של המיקה אל פני השטח של המים והשקיעו אותו לאט על רשתות הפחמן המחוררות. הרימו את נייר המסנן שעליו נמצאות הרשתות והניחו לו להתייבש. במנדף, התחילו בצביעה שלילית של קומפלקס האקסוזומים על ידי הכנת תמיסת uranyl formate טרייה בריכוז 2%.

כפי שמתואר בנוהל הכתוב, כסו את מבחנת התמיסה בחתיכת נייר אלומיניום. כדי למנוע חשיפה לאור, יש להשתמש בתמיסה באותו היום. בצעו פריקה של זוהר (glow discharge) על גבי רשת פחמן דקה באמצעות מכשיר לפריקת זוהר. לאחר מכן, הניחו חתיכה של Parafilm נקייה על השולחן, וטפטפו בעזרת פיפט שלוש טיפות של 50 µL מתמיסת צבע ה-uranyl formate על גבי ה-Parafilm. דללו את קומפלקס האקסוזום לריכוז של כ-50 nM באמצעות בופר דילול, וטפטפו בעזרת פיפט 4 µL מהחלבון המדולל על גבי רשת הפחמן שעברה פריקת זוהר.

השאירו את הדגימה על הרשת למשך דקה אחת, ולאחר מכן ספגו את התמיסה שנותרה בעזרת פיסת נייר סינון באמצעות פינצטה. הפכו את הרשת מיד אל תוך טיפת הצבע הראשונה ושטפו את הרשת על ידי הנעתה קדימה ואחורה מספר פעמים למשך כ-10 שניות. חזרו על תהליך זה עבור כל אחת משלוש טיפות הצבע; לאחר השטיפה האחרונה, השאירו את הצבע על הרשת למשך דקה אחת נוספת.

לאחר מכן, ספגו את הצבע בעזרת פיסת נייר סינון. השאירו שכבה דקה של תמיסת הצבע על פני השטח של הרשת והניחו לרשת להתייבש במכסה מנדף. הניחו את רשת הדגימה בתוך מחזיק הדגימות ולאחר מכן הכניסו את המחזיק לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים מסוג FEI TE nine 12.

בדקו את רשת הדגימה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את הריבועים הצבועים בצורה הטובה ביותר. ריבוע טוב נראה ככזה המכיל תריסר חורים בממדים של כ-1 עד 2 µm ואזורים צבועים כהים בתוכם. הפעילו את מצב המינון הנמוך (low dose mode) של ממשק המשתמש של FEI וכווןו את מיקוד החיפוש ואת מיקום החשיפה במצב המינון הנמוך.

הגדירו את החיפוש למצב שברים (fraction mode) עם אורך מצלמה של 1.5 meter. הגדירו את המיקוד להגדלה של 150 K ואת החשיפה להגדלה של 50 K עם זמן חשיפה נמדד של שנייה אחת. בדרך כלל, משתמשים במאפיין ניתן לזיהוי על הגריד הן במצב חיפוש והן במצב חשיפה כדי לבצע את היישור.

אתרו את החורים בעלי הצביעה הטובה במצב חיפוש ושמרו את המיקומים. צלמו תמונת CCD של הריבוע. הטו את הדגימה ל-55 מעלות וצלמו תמונה נוספת.

השוו בין שתי התמונות וזהו את החורים הזוגיים בשני המיקרוגרפים. החזירו את זווית הנטייה של הבמה לאפס מעלות. השתמשו בערכת המינון הנמוך (low dose kit) כדי לצלם כל חור שזוהה במצב החיפוש בהגדלה גבוהה עם דפוקוס (defocus) של כ-0.7- micrometers.

לאחר צילום של כל החורים, הט את הבמה ל-55 מעלות תוך שימוש באותה הגדלה. צלם מיקרוגרפים של הדגימה המוטה עם דפוקוס (defocus) של כ-1.2- מיקרומטר. זהה את זוג המיקרוגרפים התואם של ההטיה על סמך התבניות במיקרוגרפים בהגדלה נמוכה, תוך שימוש בתבנית הבלתי סדירה של רשתות הפחמן המנקובות (holy carbon grids) שהוכנו במעבדה.

כדי לסייע למתאם (correlation), בחרו זוגות של הטיית מיקרוגרף עם התפלגות חלקיקים אחידה וללא הילות סביב החלקיקים. יש להשמיט מהעיבוד של הנתונים מיקרוגרפים עם הילות צביעה בולטות סביבם. התחילו עם הגדרת התוכנה בסעיף הפרוצדורה.

עיבוד התמונה יודגם באמצעות תהליך 2D בחבילת Eman. כדי לשנות את פורמט התמונה, השתמש בחבילת iMagic five לביצוע היישור הדו-ממדי (2D alignment) ובחבילת spider. לצורך ביצוע השחזור התלת-ממדי (3D reconstruction) והזיכוך (refinement), המר את תמונת ה-DM three Gatan הדיגיטלית לפורמט תמונה של spider.

באמצעות הפקודה process 2D, בחרו את זוגות החלקיקים. באמצעות תוכנית האינטרנט המופצת בחבילת תוכנת spider, התוכנית שומרת באופן אוטומטי את קואורדינטות החלקיקים ומגזורת את כל החלקיקים שנבחרו באמצעות הסקריפט של spider. הסקריפט שומר את ערימות החלקיקים בהטיה ובללא הטיה.

המיר את החלקיקים הבלתי-מוטים (UN tilted) לפורמט IMAG five. באמצעות התוכנית EM two EM, בצע סינון של תדרים (band pass filter) ומסוך את החלקיקים הבלתי-מוטים באמצעות פקודת InCorp prep ב-IMAG five, ומרכז את החלקיקים שעברו סינון ומסוך באמצעות פקודת center. ב-IMAG five, בצע יישור וסיווג של החלקיקים באופן איטרטיבי למחלקות הומוגניות באמצעות סקריפט אצוות (batch script) המפעיל אוטומטית את תוכניות IMAG five.

בשלב הבא, השתמש בפקודת names in class של MSA ב-IMAG five כדי להפיק טבלת חיפוש של החלקיקים עבור המחלקה, והפק קובץ גרף עבור ערכי התרגום והסיבוב של היישור עבור כל חלקיק באמצעות פקודת header. ב-iMagic five, המר את החלקיקים המיושרים לפורמט spider באמצעות תוכנת EM two EM. לאחר מכן, המר את טבלת החיפוש של המחלקות לקובצי מסמכי spider.

ערכי התרגום והסיבוב של ההתאמה (alignment) עבור כל חלקיק מומרים גם הם לקובץ מסמך spider; בצעו סינון תדרים (band pass filter), מסיכה ומרכו את החלקיקים המוטים בדיוק כפי שנעשה עבור החלקיקים שאינם מוטים ב-IMAG five, והפיקו מערך נתונים חדש עבור חלקיקים מוטים ממורכזים. צרו קובצי מסמך זוויתיים מקובצי התאמת הרב-רפרנס (multi reference alignment) שהופקו מ-IMAG five ומקובצי ה-DCB שהופקו על ידי תוכנית האינטרנט. השתמשו בסקריפט back projection ב-spider כדי לקבל מודל ראשוני אחד עבור כל ממוצע מחלקה (class average).

לבסוף, בצעו עידון היטלים (projection refinement) של הנפח הראשוני באמצעות סקריפט spider כנגד כל החלקיקים ללא ההטיה כדי לקבל את הנפח הסופי באמצעות RCT. התקבלו כ-50 שחזורים של האקסוזום. הנפחים הופקו מחלקיקים מוטים התואמים לכל חלקיק ב-50 המחלקות של החלקיקים ללא ההטיה.

באמצעות הקרנה לאחור (back projection) שיושמה בחבילת ה-spider, בוצע עידון של התאמת ההקרנה. תוך שימוש בנפחים אלו כמודלים ראשוניים, נוצר הנפח התלת-ממדי המוצג של האקסוזום ברזולוציה של כ-18 Å; לאחר מכן, ניתן להשחיל למפה התלת-ממדית את המודלים האטומיים של חלקים שונים מהקומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש ב-RCT להשגת שחזורים תלת-ממדיים, החל מיצירת רשת דגימה איכותית של הדגימה, דרך מיקרוגרפיות, ועד לקבלת השחזור באמצעות טכניקות לניתוח תמונות. מלבד הפרוטוקול שתיארנו כאן, קיימות מספר שיטות נוספות להשגת השחזורים הסופיים בניתוח תמונות.

השלב הקריטי ביותר להשגת שחזור נכון ואמין הוא עבודה עם דגימה שהוכנה היטב.