חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבל את המבנה התלת מימדי של קומפלקס האקסוזום בשיטת הטיה חרוטית אקראית. זה מושג על ידי הנחת שכבה דקה של סרט פחמן על רשת הפחמן הקדושה כדי ליצור את מצע התמיכה לקומפלקס החלבון והכתם כשלב שני. הדגימה והכתם מוחלים על הרשת, הקוברת את הדגימה במלחי מתכות כבדות.

לאחר מכן מתבצעת מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לקבל זוגות הטיה של מיקרוגרפים של הדגימה. לבסוף, מתקבלות תוצאות המראות את המבנה התלת מימדי של קומפלקס האקסוזום על סמך ניתוח תמונה בשיטת הטיה חרוטית אקראית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלפעמים הכנה טובה של דגימה לשיטת הטיה חרוטית אקראית קשה כמו גם ההליך לעיבוד התמונה העוקב אחר View.

הדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת הציון והדגימה ללא המחשה של הערכת מדגם. העיקרון של שיטת ההטיה החרוטית האקראית דורש לקיחת זוג מיקרוגרפים מאותו אזור של דגימה בתוך מיקרוסקופ האלקטרונים. תמונה אחת מצולמת של הדגימה במצב לא מוטה, והתמונה השנייה מצולמת של הדגימה מוטה בזווית שבין 50 ל-70 מעלות באמצעות המחשב, זוג המיקרוגרפים הדיגיטליים מונחים זה לצד זה ותמונות מאותם חלקיקים נבחרות באיור זה.

תמונות אלה מסומנות במספרים בקואורדינטות תלת מימדיות. התמונות של חלקיקים לא מוטים ושותפיהם המוטים מתואמים זה לזה על ידי כיוון ציר ההטיה וזווית ההטיה. היישור של תמונות החלקיקים הלא מוטים מביא את התמונות של חלקיקים מוטים למיקומים המקבילים להם כ-aMule באמצעות תמונות מרובות של חלקיקים מוטים הממלאים את החלל האזימוטלי, ניתן לשחזר את המבנה התלת מימדי של המולקולה באמצעות אלגוריתם הקרנה לאחור כדי לייצר את הרשתות תחילה, להכין פתרון VAR בצורת 0.5% על ידי הוספת 0.45 גרם של שרף פורמלי פולי ויניל, ו-90 מיליליטר כלורופורם לכוס זכוכית של 100 מיליליטר.

במכסה אדים, מכסים את הכוס בנייר אלומיניום וממיסים את הצורה var שרף. עם שמונה של מוט ערבוב קטן וערבוב מגנטי, לוקח לשרף כ-15 דקות להתמוסס. בינתיים, החלקות זכוכית מיקרוסקופיות נקיות מראש במתנול ועם מגבוני קים.

לאחר הצורה שרף var מומס במלואו. בכלורופורם, הוסף מיליליטר אחד של 50% גליצרול על פני התמיסה. התאמת נפח הגליצרול הנוסף משפיעה על צפיפות החורים בפחמן הקדוש.

הטה את קצה האולטרסאונד לתמיסה. בעומק של כסנטימטר אחד, השתמש בעוצמה מקסימלית כדי לסוניקציה למשך דקה אחת, מה שייצור תחליב של טיפות גליצרול בצורה של התמיסה שלנו. סוניקציה ארוכה יותר תגרום לגודל קטן יותר של חורים בפחמן הקדוש.

התמיסה הופכת לחלבית לאחר שלב זה. מיד לאחר טבילת הסוניקציה, הזכוכית הנקייה מחליקה אנכית לתוך האמולסיה. למשך שנייה אחת, הוציאו אותם ומחקו את תחתית השקופיות בעזרת נייר פילטר ליצירת סרט פלסטיק דק על פני השקופיות.

לאחר שהכלורופורם מתאדה, בדוק את צפיפות וגודל החורים בסרט תחת מיקרוסקופ אור. מצב ההכנה המתואר כאן אמור לייצר 10 עד 20 חורים בכל ריבוע של רשת של 400 רשת בקוטר שבין שלושה לארבעה מיקרומטרים. לאחר ששקופיות הזכוכית יבשות, חותכים את קצה סרט הפלסטיק על משטח השקופית.

צף את הסרט על פני המים המזוקקים על ידי טבילה אנכית של המגלשה במים. ניתן לצפות בסרט הדק על פני המים בזווית הצצה כנגד השתקפות האור. הנח 400 רשתות נחושת רשת על הסרט, אחת אחת כשהמשטח החלק של הרשת פונה כלפי מטה.

הרם את סרט הפלסטיק עם רשתות עליו בעזרת פיסת נייר. הפוך את הנייר ותן לו להתייבש. בצלחת פטרי, משרים את הנייר במתנול כדי להסיר את שאריות הגליצרול בחורים ולאפשר לנייר להתייבש באוויר.

השתמש במאייד פחמן כדי לצפות את הרשתות בשכבת פחמן לעובי של כ-20 ננומטר. שימוש בזמן האידוי כדי לשלוט בעובי הרצוי. ניתן לקבוע את העובי לפי הצבע האפור של הפחמן בהשוואה לצבע האפור של שכבת פחמן בעובי ידוע.

משרים את רשתות שכבות הפחמן עם כלורופורם בצלחת פטרי זכוכית למשך חצי שעה כדי להסיר את הצורה ולהסיר את הצורה, ולאחר מכן ייבוש הרשתות מביא לרשתות פחמן קדושות תוצרת בית. לאחר מכן, אידוי שכבה דקה של פחמן בעובי של כחמישה ננומטר על משטח נציץ טרי. לאחר מכן הניחו בזהירות את רשתות הפחמן הקדושות על פיסת נייר פילטר מתחת למים מזוקקים.

במנגנון תוצרת בית, הציפו את הפחמן הדק משטח הנציץ על פני המים והפקידו אותו לאט לאט על רשתות הפחמן הקדוש. הרם את נייר הסינון עם רשתות עליו ותן לו להתייבש. במכסה אדים, התחל לצבוע שלילית של קומפלקס האקסוזום על ידי הכנת תמיסה טרייה בפורמט משתנה של 2%.

כמתואר בנוהל הכתוב, יש לכסות את צינור התמיסה בחתיכת נייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור, יש להשתמש בתמיסה זהה. זוהר יום לפרוק פחמן דק אחד על גבי רשת פחמן מלאה באמצעות מנגנון פריקת זוהר. לאחר מכן, הניחו חתיכת בושם נקי על פיפטת הספסל שלוש טיפות של 50 מיקרוליטר של תמיסת כתם בפורמט משתנה על גבי הפרפיל, דללו את קומפלקס האקסוזום לריכוז של כ-50 ננו-מולרי באמצעות פיפטת חיץ דילול ארבעה מיקרוליטר של החלבון המדולל עד לרשת הזוהר

תן לדגימה להישאר על הרשת למשך דקה אחת, ולאחר מכן מחק את התמיסה הנותרת עם פיסת נייר סינון באמצעות פינצטה. הפוך את הרשת מיד על טיפת הכתם הראשונה ושטוף את הרשת על ידי הזזתה קדימה ואחורה מספר פעמים למשך כ-10 שניות. חזור על תהליך זה עבור כל אחת משלוש טיפות הכתם לאחר השטיפה האחרונה, תן לכתם להישאר על הרשת למשך דקה נוספת.

ואז מחק את הכתם עם פיסת נייר פילטר. שמור שכבה דקה של תמיסת כתמים על משטח הרשת ואפשר לרשת להתייבש במכסה אדים. הנח את רשת הדגימה במחזיק הדגימה ולאחר מכן הכנס את המחזיק למיקרוסקופ FEI TE תשע 12 אלקטרונים.

בדוק את רשת הדגימה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את הריבועים המוכתמים הטובים ביותר. נראה כי בריבוע טוב יש תריסר חורים במידות של כמיקרומטר עד שניים ואזורים מוכתמים כהים בתוכם. הפעל את מצב המינון הנמוך של ממשק המשתמש של FEI ויישר את מיקוד החיפוש ומיקום החשיפה במצב מינון נמוך.

הגדר את החיפוש למצב שבר עם אורך מצלמה של 1.5 מטר. הגדר את המיקוד להגדלה של 150 K והגדר את החשיפה להגדלה של 50 K עם זמן חשיפה נמדד של שנייה אחת. בדרך כלל, תכונה הניתנת לזיהוי ברשת הן במצב חיפוש והן במצב חשיפה משמשת לביצוע היישור.

מצא את החורים עם מכתים טובים במצב חיפוש ושמור את המיקומים. צלם תמונת CCD של הכיכר. הטה את הדגימה ל-55 מעלות וצלם תמונה נוספת.

השוו בין שתי התמונות וזהו את החורים הזוגיים בשני המיקרוגרפים. הטה את הבמה לאחור לאפס מעלות. השתמש בערכת המינון הנמוך כדי לצלם תמונות של כל חור שזוהה במצב החיפוש בהגדלה גבוהה עם חוסר מיקוד של מינוס 0.7 מיקרומטר.

לאחר שצולמו תמונות של כל החורים, הטו את הבמה ל-55 מעלות באמצעות אותה הגדלה. קח מיקרוגרפים של הדגימה המוטה עם חוסר מיקוד של מינוס 1.2 מיקרומטר. זהה את זוג המיקרוגרפים המתאימים על סמך התבניות במיקרוגרפים בהגדלה נמוכה באמצעות הדפוס הלא סדיר של רשתות הפחמן הקדושות תוצרת בית.

כדי לעזור למתאם, בחר זוגות הטיה של מיקרוגרף עם חלקיקי פיזור אחידים וללא הילות סביב החלקיקים. יש להשליך את המיקרוגרפים עם הילות כתמים ברורות סביבם כדי לעבד את הנתונים. התחל עם הגדרת התוכנית בהליך.

עיבוד תמונה יודגם באמצעות תהליך דו-ממדי בחבילת Eman. כדי לשנות את פורמט התמונה, חבילת iMagic five תבצע את היישור הדו-ממדי ואת חבילת העכביש. כדי לבצע את השחזור והעידון התלת-ממדיים, המר את התמונה הדיגיטלית DM three Gatan לפורמט תמונת עכביש.

באמצעות הפקודה process 2D, בחר את זוגות החלקיקים. באמצעות תוכנת האינטרנט המופצת בחבילת תוכנית העכביש, התוכנית שומרת אוטומטית את הקואורדינטות של תיבת החלקיקים החוצה את כל החלקיקים שנבחרו באמצעות סקריפט העכביש. הסקריפט שומר את ערימות החלקיקים המוטות והלא מוטות.

המר את החלקיקים המוטים של האו"ם לפורמט IMAG five. באמצעות העברת פס התוכנית EM two EM, סנן והסוות את החלקיקים המוטים של האו"ם באמצעות פקודת ההכנה של InCorp ב-IMAG 5 ומרכז את החלקיקים המוסים באמצעות הפקודה המרכזית. ב-imag five, יישר וסווג את החלקיקים באופן איטרטיבי למחלקות הומוגניות באמצעות סקריפט אצווה המבצע אוטומטית חמש תוכניות IMAG.

לאחר מכן, השתמש בפקודה MSA names in class ב-IMAG five כדי ליצור טבלת חיפוש של מחלקה של החלקיקים, ליצור קובץ עלילה לתרגום וערכי סיבוב של יישור עבור כל חלקיק באמצעות פקודת הכותרת. ב-iMagic five, המר את החלקיקים המיושרים לפורמט עכביש באמצעות תוכנית EM two EM. לאחר מכן שנה את טבלת בדיקת המידע של השיעורים לקבצי מסמך עכביש.

ערכי התרגום והסיבוב של היישור עבור כל חלקיק מומרים גם למסנן פס מסמך מסמך עכביש, מסכה ומרכז את החלקיקים המוטים בדיוק כמו עבור החלקיקים הלא מוטים ב-IMAG חמש, יוצרים מערך נתונים חדש עבור חלקיקים מוטים למרכז. צור קבצי מסמכים זוויתיים ממסמכי היישור מרובי ההפניות שנוצרו מ-IMAG 5 וקבצי ה-DCB שנוצרו על ידי תוכנית האינטרנט. השתמש בסקריפט הקרנה לאחור בעכביש כדי לקבל מודל ראשוני אחד עבור כל ממוצע כיתה.

לבסוף, בצע חידוד הקרנה של הנפח הראשוני באמצעות סקריפט העכביש כנגד כל החלקיקים הלא מוטים כדי לקבל את הנפח הסופי באמצעות RCT. הושגו כ-50 שחזורים של האקסוזום. הנפחים נוצרים מחלקיקים מוטים המתאימים לכל חלקיק ב-50 המחלקות של חלקיקים לא מוטים.

באמצעות הקרנה אחורית המיושמת בחבילת העכביש, בוצע לאחר מכן חידוד התאמת ההקרנה באמצעות נפחים אלה כמודלים ראשוניים והנפח התלת-ממדי המוצג של האקסוזום נוצר ברזולוציה נוספת של כ-18 אנג, לאחר מכן נוכל להתכופף במודלים האטומיים של חלקים שונים של המתחם במפה התלת מימדית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-RCT כדי לקבל שחזורים תלת מימדיים מיצירת רשת נרטיבית טובה של דגימה למיקרוגרפים עמית לעמית, ולבסוף להשגת השחזור באמצעות טכניקות ניתוח תמונה. מלבד הפרוטוקול שתיארנו כאן, ישנן מספר שיטות לקבל את השחזורים הסופיים בניתוח תמונה.

השלב הקריטי ביותר לקבלת שחזור נכון אמין הוא עבודה עם דגימה מוכנה היטב.