Name: יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: חקור הפעלת תאי T באמצעות פפטיד-MHC פוטואקטיביבילי לשליטה מרחבית-זמנית מדויקת. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנוני העברת אותות מקומיים ותגובות תאיות מקוטבות במערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים חברי המעבדה Huse עבור ייעוץ וסיוע. נתמך על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות (R01-AI087644 ל מ. ה) ו- P30-CA008748 אל מרכז הסרטן סלואן-קטרינג הזיכרון.

1. הכנה של משטחי זכוכית מופחתים
<ol><li>המעיל. ובכן שמונה תאיים coverglass עם biotinylated פולי-L-ליזין (ביו-PLL) מדולל שבערך במים מזוקקים, יונים (ddH2O). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף עם H2O.</li>
	<li>היא יבשה 2 h-RT.</li>
	<li>בלוק ביו-PLL מצופה משטחים עם מאגר חסימה (באגירה HEPES תמיסת מלח [10 מ מ HEPES pH 7.4, 150 מ מ NaCl], עם 2% BSA) במשך 30 דקות ב- RT.<ol>
<li>להמיס 5 מ"ג פולי-L-ליזין מנות ב- 1 מ ל 10 מ מ נאפו4, pH 8.5.</li>
		<li>להוסיף μmol 125 (0.55 מ ג) של NHS-ביוטין (מתוך מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד) ולבדוק את רמת החומציות של התגובה. אם ה-pH מתחת 8.5, להוסיף 2 μL של 4 N NaOH לגדל אותו בין pH 8.5 ו- 9.5.</li>
		<li>מערבולת למשך 30 דקות.</li>
		<li>להרוות את תגובת עם 50 μL 100 מ מ גליצין מומס 20 מ מ טריס pH 8.0.</li>
		<li>ספין בעוצמה מלאה למשך 10 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. הערה: ביו-PLL איכות הוא בדרך כלל לעומת ההכנות הקודם על ידי ציפוי טורי דילולים כפולה של החומר על צלחת אליסה 96-ובכן וכימות ביוטין תוכן לאחר דגירה עם phosphatase אלקליין בשילוב streptavidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את חסימת מאגר. אל תאפשר בארות להתייבש. להוסיף streptavidin (100 µg/mL במאגר חסימה). תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לרחוץ ב- HBS. מילוי, היפוך קאמרית שקופית בארות 4 - 5 פעמים, הסרת HBS מן הבארות. אל תאפשר בארות להתייבש.</li>
	<li>הוסף biotinylated pMHC ליגנדים של אדהזיה מולקולות על פני השטח. הערה: MCC וביצית יכולה להיות photocaged על-ידי הוספת אורתופדיה-nitrobenzyl המבוסס על קבוצות מגן (למשל, nitrophenylethyl (NPE) או nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) על קבוצת אמינו חדוה lysines מפתח (K12 ב- MCC, K7 בתוך ביצית). ניתן להשיג Photocaged MCC וביצית של ספקים מסחריים. לאחר שיחזור במאגר מימית, הם הם refolded לתוך ביטוי bacterially-Ek ו- H2-Kb באמצעות גישות הוקמה11,12.</li>
	<li>אימות של פפטיד MCC או ביצית photoactivatable<ol>
<li>Decage פפטידים NVOC המוגנים על-ידי UV בין עם מנורת UV כף יד (ראה טבלה של חומרים) במשך 20 דקות ב- RT.</li>
		<li>הדופק 1.0 x 105 נגמ שים עם 1 מיקרומטר של פפטיד nonstimulatory (שליטה שלילי, למשל Hb), unirradiated photoactivatable פפטיד, photoactivatable לקרינה פפטיד, ופפטיד אגוניסט (בקרה חיובית, למשל, MCC) עבור h 1 כדי לילה ב 37 º C.</li>
		<li>כדי לעורר תאי T לבטא את ג 5 C7/2B4/AND TCR, להשתמש CH12 או CH27 B תאים. לעורר תאים OT1 T, השתמש RMA-s או EL4 thymoma תאים.</li>
		<li>מערבבים את נגמ שים פעמו עם מספר שווה של תאי T ב 96-ובכן סביב לוחות בווליום הסופי של 200 µL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.</li>
		<li>לשחזר את supernatants מכל קידוח ולנתח il-2 מאת אליסה עם streptavidin-חזרת peroxidase זיהוי ערכי צבע מוחלטים. הערה: אישור על מצב caging של פפטידים כל באמצעות ספקטרומטר מסה ספקטרומטריית electrospray לפני refolding לתוך מתחמי MHC, מומלץ מאוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע קיפול וטיהור של MHC כדי למזער חשיפה לאור. למשל, גלישת קיפול תגובות בנייר אלומיניום, לבצע בדיקות סינון ג'ל עם מנורת UV מחוץ. הערה: זה כבר מצא את photoactivatable MCC-אני-Ek , ביצית - H2-Kb זירוז UV הפעלה עצמאית תא T-צפיפות גבוהה, ייתכן שעקב שכולאת פונקציונלי לא שלם. לפיכך, pMHC photoactivatable הוא מדולל מעודף x 10-30 nonstimulatory pMHC (למשל -Ek שמכיל פפטיד64-76 (Hb) של המוגלובין) במהלך השלב הנייח. זה מגביר את האות לרעש יחס של הניסוי הדמיה עוקבות.</li>
	<li>כדי photoactivate CD4+ T תאים, באופן קולקטיבי משתמשים בתערובת של biotinylated על בסיס חצי פנסיון-אני-Ek (3 µg/mL), biotinylated photoactivatable MCC-אני-Ek (0.1 µg/mL) ו- biotinylated נוגדנים נגד המעמד אני MHC H2-Kk (0.5 µg / mL)-נוגדן anti-H2-Kk מעודד ג 5 C7/2B4/AND T תאים, אשר אקספרס H2-Kk, למרוח על גבי משטח זכוכית שבלי לעבור הפעלה.</li>
	<li>עבור CD8+ T תאים, משתמשים בתערובת של biotinylated H2-Db הנושאת את פפטיד KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylated photoactivatable ביצית-H2-Kb (0.1 µg/mL), לבין קבוצת המחשבים חוץ-תאי של המולקולה אדהזיה ICAM-1 (2 µg/mL הופק על ידי חרקים תא תרבות13.) ה-ICAM-1 מעודד היווצרות קשר קרוב ומרבה את אינטגרין LFA1 על פני תא T.</li>
	<li>החלת כל חלבון תערובות במאגר חסימה, ואחריו הדגירה 1 h RT או לפחות 2 h-4 מעלות צלזיוס. הערה: צפיפות מולקולרית על משטחים מסוג זה להיות ~ 8000 לכל מיקרומטר2 כבר נקבע בעבר6. בהתחשב בכך photoactivatable pMHC מייצג ~1/30th של החלבון biotinylated על פני השטח, כשהצפיפות שלה יהיה ~ 267 מולקולות לכל מיקרומטר2, לפני decaging.</li>
	<li>לשטוף כמו שלב 1.6 ולהשאיר ב- HBS עד מוכן לשימוש.</li>
	<li>להוסיף 200,000 CD4+ או CD8+ T תאים המבטאים את TCR המתאים לבאר כל ולאפשר תאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ברגע תאים יש המצורפת, התפשט על פני השטח, הם מוכנים בשבילכם photoactivation והדמיה. הערה: התמרה חושית Retroviral אפקטור T תאים עם פלורסנט הדמיה הגששים מתואר בפרט elswhere6,7. סידן איתות שניתן גם ללמוד באמצעות תאי T untransduced טעון עם סידן רגיש לצבוע Fluo-46. לצבוע רציומטרי Fura-2 לא מומלץ כי זה דורש עירור בטווח UV, אשר גם גורם decaging של pMHC photoactivatable.</li>
</ol>2. ייבוא תמונות
<ol><li>השתמש במיקרוסקופ TIRF הפוכה לבוש עם עדשה המטרה UV תואם 150 X עבור רכישת התמונה. UV להאיר אזורים על-ידי המשתמש באמצעות מערכת דיגיטלית הסרעפת מחוברת מנורת כספית W 100 (HBO). ישיר UV אור המנורה הזו על המדגם באמצעות מראה מסירה ארוכה 400 nm.</li>
	<li>השתמש התמונה ניתוח תוכנה עבור photoactivation מקומי ורכישת זמן לשגות. בניסויים רוב, לפקח על הגששים בערוצים שני ירוק ואדום באמצעות 488 ננומטר, 561 nm עירור לייזרים, בהתאמה. אור לייזר מכוונת על המדגם באמצעות מראה כפולה-bandpass ודיקרואיק זוהר ששולחות גם בטווח UV (כדי לאפשר decaging). אנא עיין טבלה של חומרים איור 6 לקבלת מידע נוסף על תצורת מיקרוסקופ.</li>
	<li>לאחר טעינת השקופית תא המכיל תאי T, להתאים את ההגדרות כדי להשיג תאורה TIRF או epifluorescence, לפי הצורך. במצב live, בחר שדה של תאים הם המבטאים את probe(s) פלואורסצנט עניין. להקים בקנה מידה מיקרון אזורים עבור photoactivation מתחת תאים בודדים באמצעות תוכנת שליטה.</li>
	<li>מתחילים רכישת זמן לשגות. בדרך כלל, 80 timepoints נרכשים, עם מרווח של 5 s בין כל נקודת זמן. זה משאיר יותר ממספיק זמן רציפים 488 ננומטר, 563 חשיפות ננומטר, במקרה של ניסויים צבע כפול.</li>
	<li>לאחר 10 timepoints, photoactivate האזורים שנבחרו על-ידי פתיחת הסרעפת דיגיטלי תריס עבור s 1-1.5.</li>
	<li>בתום זמן לשגות, בחר שדה חדש של תאים וחזור על התהליך.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
הערה: photoactivation המותאמות לשפות אחרות של ליגנדים קיבוע יוצר אזור מופחתים מוגדרים היטב, נייח יכול לשמש לניתוח כמותי של איתות תגובות ואירועים שיפוץ cytoskeletal. ניתוח פרוטוקולים בדרך כלל כרוכים או לכימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך אזור לקרינה או באמצעות האזור לקרינה כמו נקודת קצה של מיקום מרחק מעבדתיים (למשל. להערכת קיטוב של centrosome אזור לקרינה). ניתוח פרוטוקולים שיפורטו להלן. תוכניות שונות של ניתוח תמונה אינטראקטיבית יכול לשמש כדי להפוך את העוצמה של מדידות מרחק, אשר לאחר מכן ניתן ליצור תבנית פלט עבור עיבוד נוסף וניתוח.
<ol><li>
עוצמת קרינה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) של אזור רקע מחוץ לתא (FIb). זה ישמש עבור רקע תיקון.<ol>
<li>לצייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא ולעשות מסכה. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים. הערה: פרטי פרוצדורלי (למשל 3.1.1.1) מתייחסים לתוכנה Slidebook (ראה טבלה של חומרים). יישום של פרוטוקול זה באמצעות חבילות תוכנה אחרות (למשל., פיג'י) יהיה שונה במקצת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לקבוע את האלחוטי בתוך אזור photoactivated עבור כל נקודת זמן.<ol>
<li>בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. כדי לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לחץ על נתח | מסיכה הסטטיסטיקה. בחר כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הפחת על רקע פי מתוך הערכים FI שנמדד באזור. לאחר מכן, לנרמל את המידות FI המתוקן על-ידי חלוקת מאת הממוצע, רקע מתוקנת האלחוטי של המסגרות 9 קודם לפני photoactivation. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). הערה: גרף ΔF/F כפונקציה של הזמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מרחק
	<ol>
<li>להשיג x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.<ol>
<li>כדי לקבוע את x ו- y קואורדינטות של מרכז האזור photoactivated, בחרו מסיכה כדי לסמן את אזור זה היה photoactivated. ברגע האזור של photoactivation מודגשת, בחר נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לקבוע x ו- y קואורדינטות עבור המכשיר פלואורסצנט עניין עבור כל נקודת זמן. זו מושגת בדרך כלל באמצעות חלקיקים ידני או אוטומטי מעקב.<ol>
<li>כדי לקבוע את x ו- y הקואורדינטות של המכשיר פלואורסצנט עניין, בחר ידני חלקיקים מעקב ולחץ על החללית פלואורסצנט עניין לאורך זמן. לאחר כל נקודות זמן כבר מסומנים, לבחור נתח | מסיכה סטטיסטיקה | מרכז של אזור ולייצא את הערכים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לחשב את המרחק בין החלבון הניאון עניין למרכז של האזור photoactivated עבור כל נקודת זמן באמצעות המשוואה: מרחק = כהן ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), שבו x2 ו- y הם2 הקואורדינטות של החלבון הניאון של ריבית ו- x1 ו- y1 הן הקואורדינטות של מרכז האזור photoactivated.</li>
		<li>גרף המרחק כפונקציה של הזמן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בשנים האחרונות התפתחה אור כלי מצוין עבור הפעלה מבוקרת spatiotemporally של תהליכים תאיים. מתודולוגיות שונות פותחו, כל אחד עם המשויך יתרונות וחסרונות. המערכת המתוארת כאן, אשר מבוססת על decaging של ליגנדים קיבוע, חוץ-תאית, מתאימה באופן אידיאלי עבור הניתוח של תגובות איתות מהירה, subcellular, מקוטב. גישה זו הוחל לבחון הוא היווצרות בתאי T כפי שתואר לעיל. בנוסף, ליגנדים בכלוב על רצפטורים אחרים יש מהונדס, ומאפשרת לנו ליישם את האסטרטגיה אותה כדי להעריך מעכבות איתות תאי הרג טבעיים, רוברטסונית הגרעין של הגורם שעתוק NF-κB בתגובה על ...

T לימפוציטים (T תאים) לשחק תפקיד מרכזי חסינות תאית על ידי זיהוי פפטידים antigenic מוצג בהקשר של תא השטח MHC. זיהוי אנטיגן, אשר מתווך על ידי TCR, מניע את הבידול של תמים T תאים ומעודדת המסירה של התגובות cytolytic וקומוניקטיבי אפקטור אוכלוסיות. TCR האירוסין גורם גם שינויים דרמטיים אדריכלות הסלולר. בתוך דקות, תאי T אני מטפל לצד של התא אנטיגן (APC), ויצרו ממשק מקוטב המכונה סינפסה אימונולוגי (IS)1,2. IS potentiates תא T אפקטור תגובות על-ידי הפעלת שחרור כיוונית של ציטוקינים או, במקרה של לימפוציטים T ציטוטוקסיות (Ctl), חלבונים lytic להרוס את APC.
TCR האירוסין מאת pMHC גורם זירחון מהירה של מולקולות מתאם הזרם מרובות, כולל מקשר עבור התאים ההפעלה של T (LAT), אשר בסופו של דבר מקדם שיפוץ חזקים של שלד התא סינפטית2. אקטין filamentous בקליפת המוח (F-אקטין) כוננים תא T מתפשטת על פני השטח APC, ואז פותר לתוך מבנה טבעתי מאופיין על ידי F-אקטין הצטברות IS הפריפריה, דלדול מהמרכז. F-אקטין טבעת היווצרות בחוזקה רתומה ולהתפכחות של מרכז הארגון microtubule (MTOC, הנקרא גם centrosome של תאי T) למיקום מתחת למרכז של ממשק שני האירועים מתרחשים בתוך דקות של זיהוי אנטיגן הראשונית ולהקים ההקשר אדריכלי אירועי הפעלה עוקבות, אפקטור מתרחשות תגובות.
ללמוד הוא היווצרות, מעבדות שונות פיתחו גישות אשר APC מוחלף על ידי משטח זכוכית מכיל ליגנדים TCR קיבוע או תומך ליפידית עצמו מכיל3,ליגנדים4. תאי T טופס הוא כמו הקשר על משטחים אלה יכולים לדימות גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRF) או מיקרוסקופיה קונפוקלית, הפעלת מחקרים ברזולוציה גבוהה של הפעלת תא T מוקדמת ויצירת IS.
למרות גישות אלה אפשרו להמחשת מעולה של IS שהרכבתם, הרבה איתות מצדו TCR:pMHC הבאים מתרחש תוך שניות, מקשים על המאמצים כדי לקבוע את רצף האירועים בעקבות הפעלת TCR במדויק . כדי לעקוף בעיה זו, בגישה photoactivation פותחה, שבו photoactivatable pMHC משמש כדי להשיג שליטה ייתכן TCR הפעלה5,6,7. במערכת זו, תאי T מחוברים משטחי זכוכית המכיל pMHC photoactivatable זה ללא-מופחתים TCR עד מוקרן באור אולטרה סגול (UV). הקרנת UV על אזור מיקרון בגודל של המשטח מתחת לתא T מסיר את photocage יצירת אזור מופחתים יכולים להיות מזוהים על-ידי תא T. והאירועים איתות ובניה cytoskeletal ואז מנוטרים באמצעות מקודדים גנטית כתבים פלורסנט. שתי גרסאות photoactivatable של פפטידים antigenic, עש ציטוכרום c88-103 (MCC) ו אובלבומין257-264 (פשוט), אשר מוצגות בהקשר של המחלקה II MHC-Ek , הכיתה אני MHC H2-Kb, בהתאמה, היה פיתח (איור 1). פעולה זו מאפשרת הניתוח של שני CD4+ T תאים ספציפיים עבור MCC-אני-Ek (לבטא את ג 5 C7, 2B4, או AND TCRs) ו CD8+ T תאים ספציפיים עבור ביצית-H2-Kb (לבטא את OT1 TCR).
בעשור האחרון, הגישה photoactivation ודימות TCR יש כבר מנוצל כדי לבסס את קינטיקה מדויק של TCR מוקדם איתות צעדים וגם כדי לזהות מסלולים מולקולריים המסדירים מקוטב cytoskeletal שיפוצים5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. לדוגמה, וזמינותו היה תפקיד חשוב בקביעת centrosome הזה ולהתפכחות לכיוון APC מתווך על ידי מעבר הדרגתי המותאמות לשפות אחרות של השומנים השני messenger diacylglycerol מרוכז בכל IS. הוא צפוי כי מתודולוגיה זו ימשיכו להיות יקר עבור יישומים הדורשים ניתוח דימות ברזולוציה גבוהה של תפקוד תא T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין הידרוברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2636</td><td>יצטרך לייצר ביוטינילציה פולי-L-ליזין</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-ביוטין</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>יצטרך להפוך את ביוטינילציה פולי-ליזין</td></tr><tr><td>סטרפטווידין</td><td>תרמופישר מדעי</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: ערכת תגובה סטנדרטית של חלבון ביוטין ליגאז</td><td>של BirA Avidity</td><td>BirA500</td><td>תשמש לביוטינילציה של חלבונים</td></tr><tr><td>ביוטינילטים Hb E-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>לקיפול חלבון, ראה התייחסות 6. לביוטינילציה, יש להשתמש בערכת BirA</td></tr><tr><td>NPE-MCC I-EK&nbsp; ניתן לרכוש </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) מ-Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha; נוגדן H2-Kk</td><td>נוגדן BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>ביוטינילציה NPE-OVA H2-KbAnaspec</td><td></td><td></td> <td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) ניתן לרכוש מ-Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td></td><td>ניתן לרכוש חלבון מסונתז מותאם אישית של Anaspec (KAVYDFATL) מ- Anaspec</td>Biotinylated ICAM1&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>לקיפול חלבון, ראה הפניה בפרוטוקול. לביוטינילציה, השתמש בערכת BirA</td></tr><tr><td>מנורת UV ידנית</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>מוחזקת < 1 ס"מ מהמדגם.&nbsp; 30 שניות של 365 אור מספיקות לזיהוי, 20 דקות לניקוי כמותי.</td></tr><tr><td>מערכת אולימפוס IX-81 OMAC TIRF.</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מידע נוסף על מערכת ההדמיה ניתן למצוא בכתובת איור 6</td></tr><tr><td>Mosaic דיאפרגמה דיגיטלית</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook תוכנה</td><td>חידושי</td><td></td><td></td> הדמיה חכמה</tr></tbody></table>

יכולות בקרה של תא t הפעלה באמצעות אגוניסט photoactivatable

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

לימפוציטים מסוג T לעסוק מהירה, מקוטב איתות, המתרחשים בתוך דקות לאחר הפעלת TCR. זה גורם להיווצרות הסינפסה חיסוניות, צומת הסטראוטיפי תא-תא זה מווסת את תא T הפעלה ויעדים directionally אפקטור תגובות. ללמוד ביעילות של תהליכים אלה, נחוצה גישה הדמיה המותאם לתפיסת תגובות מהר, מקוטב. פרוטוקול זה מתאר מערכת כזו, אשר מבוססת על photoactivatable פפטיד-מייג'ר histocompatibility מורכבים (pMHC) זה שאינו מופחתים עד חשוף לאור אולטרה סגול. Decaging יישוב של ריאגנט הזה במהלך הניסויים videomicroscopy מאפשר שליטה ייתכן מדויקת של הפעלת TCR וניטור ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר עוקבות מאת גמורה (TIRF) הדמיה. גישה זו מתאימה גם אסטרטגיות ההפרעות גנטיות ולא תרופתי. דבר זה מאפשר ההרכבה של מסלולים מולקולריים מוגדרים היטב לקשר TCR איתות היווצרות המבנים cytoskeletal מקוטב העומדים בבסיס הסינפסה אימונולוגי.

הגישה photoactivation ודימות מאפשר התבוננות נתיישב כימות של תגובות איתות מהירה, מקוטב. כדי להדגים את היכולות שלה, לשכפל הנה ניסוי בחינת המתאם ייתכן בין צבירה דאג TCR-induced ולהתפכחות centrosome. ג 5 תקיעות התא C7 T היו transduced retrovirally עם שני הכתבים פלורסנט: ביוסנסור דאג המכיל קבוצות המחשבים C1 טנדם מכל חלבון קינאז C-θ באמצעות מקושר GFP (C1-GFP) ו- RFP-טובולין כדי לנטר את centrosome. תאי T צורפו אז אל תאיים coverglass המכיל photoactivatable MCC-אני-Ek. C1-GFP צולמה באמצ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש בפפטיד MHC הניתן להפעלה כדי לגרום לאיתות מקוטב בלימפוציטים מסוג T. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהעברת אותות של תאי חיסון כגון כיצד לימפוציטים מעבירים אותות מקומיים מהירים ולאחר מכן מרכיבים תגובות תאיות מקוטבות לאותות אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה שליטה זמנית מרחבית באיתות תאי T.הוא עושה זאת על ידי קביעת הזמן והמיקום המדויקים של הפעלת קולטן תאי T. מי שתדגים את ההליך תהיה אליסה סאנצ'ז, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל בהוספת פולי-L-ליזין ביוטיניל, או ביו-PLL, מדולל אחד עד 500 במים מזוקקים דה-יונים לזכוכית כיסוי עם שמונה בארות.דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף במים מזוקקים נטולי יונים ולאחר מכן לייבש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. חסום משטחים מצופים ביו-PLL עם מאגר חוסם המורכב מתמיסת מלח חוצצת HEPES עם 2% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם מהמשטחים המצופים ביו-PLL מבלי לאפשר לבארות להתייבש. לאחר מכן מוסיפים סטרפטווידין ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה יש לשטוף את המשטחים המצופים ב- HBS.מלא והפוך את בארות המגלשה בתא ארבע עד חמש פעמים, והסר HBS מהבארות. אל תאפשר לבארות להתייבש. הוסף את הליגנדים הספציפיים של פפטיד פוטו-אקטיבי הניתנים לפוטו-אקטיביזציה ומולקול

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

סרטון וידאו זה מדגים שיטה לפירוק קומפלקס היסטותאימות פפטיד מז'ור הניתן להפעלה באמצעות קרינת UV. תהליך הדעיכה חושף את רצף הפפטידים, ומאפשר הפעלה מדויקת של תאי T.

הערכה של הפעלה מבוקרת של תאי T עם פפטיד MHC הניתן להפעלה

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.

מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של רשת יחיד MHC מחלקה אני מתחמי לחקור מולקולרית באינטראקציה האנושית CD8 + T תאים הפעלה: דור של הנדסה אנטיגן הצגת תאים המבטאים שרשרת אחת בונה, תרבות של שיבוט אנושי של תא CD8 + T וניסויים תא T הפעלה.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מעורבות מח עצם מאתר כימרות עם ספונטנית למרכזי נבטי אוטואימונית, באיזה autoreactive לימפוציטים לשאת photoactivatable חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP-הרשות) כתב. פעולה זו מספקת את היכולת לקשר מיקום סלולארי ברקמות עם ניתוחים פונקציונליים המולקולריים במורד הזרם.

חוקרים למרכזי נבטי Autoreactive בודדים על-ידי Photoactivation במודל של Chimeric מעורבת של מחלת חיסון עצמי

פרוטוקול זה מתאר את היישום של תחום מתג אלוסטרי מהונדס המופעל על ידי אור כחול (LightR) עבור בקרה מרחבית-טמפורלית הפיכה של פעילות החלבון. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט לפיתוח ואפיון Src מווסת אור (LightR-Src). הוא מדגים את הרבגוניות של גישה זו בכל סוגי האנזימים.

בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לגידול תאי T ראשוניים, כולל בידדם, הפעלה, התרחבותם וטרנספקציה חולפת באמצעות אלקטרופורציה של mRNA. בנוסף, מוצע תהליך עבודה ופאנל נוגדנים לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ, סמני הפעלה, כדאיות וביטוי קולטני אנטיגן כימרי (CAR).

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

חקור הפעלת תאי T באמצעות פפטיד-MHC פוטואקטיביבילי לשליטה מרחבית-זמנית מדויקת. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנוני העברת אותות מקומיים ותגובות תאיות מקוטבות במערכת החיסון.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

גלה סרטונים נוספים