יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש בפפטיד MHC הניתן להפעלה כדי לגרום לאיתות מקוטב בלימפוציטים מסוג T. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהעברת אותות של תאי חיסון כגון כיצד לימפוציטים מעבירים אותות מקומיים מהירים ולאחר מכן מרכיבים תגובות תאיות מקוטבות לאותות אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה שליטה זמנית מרחבית באיתות תאי T.

הוא עושה זאת על ידי קביעת הזמן והמיקום המדויקים של הפעלת קולטן תאי T. מי שתדגים את ההליך תהיה אליסה סאנצ'ז, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל בהוספת פולי-L-ליזין ביוטיניל, או ביו-PLL, מדולל אחד עד 500 במים מזוקקים דה-יונים לזכוכית כיסוי עם שמונה בארות.

דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף במים מזוקקים נטולי יונים ולאחר מכן לייבש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. חסום משטחים מצופים ביו-PLL עם מאגר חוסם המורכב מתמיסת מלח חוצצת HEPES עם 2% BSA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם מהמשטחים המצופים ביו-PLL מבלי לאפשר לבארות להתייבש. לאחר מכן מוסיפים סטרפטווידין ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה יש לשטוף את המשטחים המצופים ב- HBS.

מלא והפוך את בארות המגלשה בתא ארבע עד חמש פעמים, והסר HBS מהבארות. אל תאפשר לבארות להתייבש. הוסף את הליגנדים הספציפיים של פפטיד פוטו-אקטיבי הניתנים לפוטו-אקטיביזציה ומולקולות הידבקות עבור תאי T חיוביים CD4 או תאים חיוביים CD8 למשטחים המצופים ביו-PLL.

יש להגן מפני אור ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף כמו קודם ולהשאיר ב-HBS עד שמוכן לזריעה. לבסוף, הוסף 200,000 תאי T חיוביים CD4 או CD8 חיוביים המבטאים את ה-TCR המתאים לבארות הנכונות ואפשר לתאים להיצמד ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

ברגע שהתאים נצמדו לפני השטח והתפשטו עליהם, הם מוכנים לפוטו-אקטיבציה ולהדמיה. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת הפוכה המצויד בעדשת אובייקטיבית 150X תואמת UV לרכישת תמונה. עקוב אחר בדיקות הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים באמצעות לייזרי עירור של 488 ננומטר ו-561 ננומטר, בהתאמה.

לאחר הרכבת שקופית החדר המכילה את תאי ה-T, כוונן את הגדרות המיקרוסקופ כדי להשיג תאורת TIRF או אפיפלואורסצנטית, לפי הצורך. במצב Live, בחר שדה תאים המבטא את הבדיקות הפלואורסצנטיות המעניינות. קבע אזורים בקנה מידה מיקרוני לפוטו-אקטיבציה מתחת לתאים בודדים באמצעות בקרת תוכנה.

לאחר מכן, התחל את הרכישה. בדרך כלל, נדרשות 80 נקודות זמן עם מרווח של חמש שניות בין כל אחת מהן. זה משאיר זמן לחשיפות עוקבות של 488 ננומטר ו-563 ננומטר במקרה של ניסויים בצבע כפול.

לאחר מכן, לאחר רכישת 10 נקודות זמן, הפעל את האזורים שנבחרו על ידי פתיחת תריס הסרעפת הדיגיטלי למשך שנייה עד 1.5 שניות. לאחר השלמת חלוף הזמן, בחר שדה תאים חדש וחזור על התהליך. התחל בקביעת עוצמת הקרינה של אזור רקע מחוץ לתא שישמש לתיקון רקע.

צייר אזור מרובע בגודל מיקרון מחוץ לתא וצור מסיכה. כדי לקבוע את עוצמת הקרינה, לחץ על ניתוח, סטטיסטיקת מסכה. בחרו 'עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת' וייצאו את הערכים.

קבע את עוצמת הקרינה בתוך האזור הפוטו-אקטיבי עבור כל נקודת זמן. בחרו 'מסיכה' כדי לסמן את האזור שהופעל באור. כדי לקבוע את עוצמת הקרינה, לחץ על ניתוח, סטטיסטיקת מסכה.

בחר עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת וייצא את הערכים. השג את קואורדינטות X ו- Y של מרכז האזור המופעל על ידי בחירה באפשרות מסיכה כדי להדגיש את האזור שהופעל באור. לאחר הדגשת אזור הפוטו-אקטיביזציה, בחר ניתוח, סטטיסטיקת מסיכה, מרכז אזור וייצא את הערכים.

קבע את קואורדינטות ה-X וה-Y של הגשושית הפלואורסצנטית המעניינת. בחר מעקב חלקיקים ידני ולחץ על הגשושית הפלואורסצנטית המעניינת לאורך זמן. לאחר מעקב אחר כל נקודות הזמן, בחר ניתוח, סטטיסטיקת מסיכה, מרכז אזור וייצא את הערכים.

תאי T חוברו לזכוכית כיסוי תאית המכילה MCC-IEFK הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית. C1-GFP, בדיקה עבור השליח השני של השומנים DAG, צולמה באמצעות מיקרוסקופ TIRF ו-RFP-טובולין במצב אפיפלואורסצנטי. פוטו-אקטיבציה מקומית של פני השטח מתחת לתא T גורמת להצטברות של DAG באזור המוקרן.

לאחר מכן תוך שניות הכיוון מחדש של הצנטרוזום לאותו אזור. ניתן לכמת הצטברות C1-GFP על ידי חישוב עוצמת הקרינה המנורמלת לאחר תיקון רקע במרכז האזור הפוטו-אקטיבי לאורך זמן. ניתן לכמת כיוון מחדש של צנטרוזום בתגובה לפוטו-אקטיבציה על ידי חישוב המרחק בין הצנטרוזום למרכז האזור הפוטו-אקטיבי כפונקציה של זמן.

לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מיממה אם היא מבוצעת כראוי. בדרך כלל אנו מייצרים 15 עד 20 סרטוני דולג זמן לניתוח בזמן זה. גישה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את הקינטיקה והקיטוב המדויקים של הפעלת איתות בתאי T.

הוא הותאם גם לחקר איתות מעכב בתאי הרג טבעיים. כתוצאה מכך, יש לנו כעת הבנה טובה יותר של האופן שבו אינטראקציות תקשורתיות בין תאי חיסון מורכבות ומתמוססות.