שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג אינטגרציה יציבה של גן מעניין בגנום האנושי של תאים ראשוניים על ידי מערכת היפהפייה הנרדמת המווסתת שעתוק ארוזה לשילוב וקטורים לנטי-ויראליים פגומים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריפוי הגנטי כגון שילוב הגן המעניין בתאים ראשוניים באמצעות מערכת היפהפייה הנרדמת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שמערכת היפהפייה הנרדמת ההיפראקטיבית הניתנת להשראה מספקת ביעילות תאים ראשוניים עמידים למספר שיטות טרנספקציה.

מי שתדגים את ההליך תהיה דניאלה בנתי, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי. לפני יום ההתמרה, הקרטינוציטים הראשוניים האנושיים גדלים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לנתק קרטינוציטים תת-קונפלוגנטיים בתרבית, הסר את המדיום, שטוף את התאים עם 1X PBS והוסף תמיסת עבודה של טריפסין מחוממת מראש של מיליליטר לכל באר.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחממת תרבית התאים. השעו מחדש את תאי הבאר ביסודיות והעבירו את תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה המכיל שני מיליליטר של מדיום המכיל סרום. שוטפים את הבאר פעם אחת עם שלושה מיליליטר של 1X PBS ומוסיפים את התמיסה השטופה לצינור הצנטריפוגה עם מתלה התאים.

צנטריפוגה בחום של 580 פעמים גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. שוטפים את התאים עם חמישה מיליליטר של 1X PBS, צנטריפוגה ב 580 פעמים גרם למשך חמש דקות, וזורקים את הסופרנטנט. בצינור פוליפרופילן של 15 מיליליטר, יש לדלל 1.6 פעמים 10 עד הקרטינוציטים החמישיים במיליליטר אחד של מדיום CFAD.

הכן דילול אחד לכל מצב. שלושת הווקטורים של Integration Defective Lentiviral או IDLV הוכנו קודם לכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. IDLVTKSB נושא את הטרנספוזיציות ההיפראקטיביות SB100X המווסתות על ידי TET.

קודי IDLVrtTA עבור המאפנן ו-IDLVT2 נושא את הגן המעניין. GFP בדוגמה זו מוקף בחזרות הפוכות של טרנספוזון. לדלל את הווקטורים הלנטי-ויראלים במיליליטר אחד של מדיום CFAD בנוכחות 20 מיקרוליטר פוליברן כפי שמצוין בטבלה זו.

אחד, שניים ושלושה הם פקדים שליליים ללא וקטורים. ארבע וחמש מכילות IDLVTKSB ו-IDLVrtTA. שש, שבע, שמונה ותשע מכילים את כל שלושת הווקטורים הלנטי-ויראליים.

התמר תאים בתרחיף על ידי הוספת כל דילול וקטורי לנטיוויראלי לתרחיף הקרטינוציטים המתאים. הסר את המדיום מתאי הזנה 3T3-J2 המוקרנים באופן קטלני שנסוגו לפני יום וצפה עליהם את הקרטינוציטים המומרים. לאחר התמרת באר, המשך עם הבא.

דוגרים בחום של 25 מעלות למשך 30 דקות. לאחר מכן העבירו את התאים ל -37 מעלות למשך שש שעות. לאחר שש שעות, הוסף מיליליטר אחד של מדיום CFAD לכל באר.

הוסף מיקרוטולר אחד של דוקסיציקלין לבארות חמש, שמונה ותשע. החזרת תאים ל- 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבד את התאים בכל באר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לצורך ניתוח ציטופלואורימטרי, יש להבחין בין הקרטינוציטים הראשוניים המומרים שנותקו ביום השלישי וביום השישי משכבת ההזנה 3T3-J2 על ידי תיוג התאים בנוגדנים נוגדניים מצומדים APC חד-שבטיים של עכבר. הכן ארבעה מיליליטר של מאגר מכתים עבור כל דגימה על ידי שילוב של 5% FBS, 500 מילימולר EDTA ו-1X PBS. שטפו את התאים המנותקים עם מיליליטר אחד של מאגר מכתים.

צנטריפוגה בחום של 580 פעמים גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. בצינור לרכישת ציטומטריית זרימה, השעו מחדש חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעה. הוסף שני מיקרוליטר נוגדן נגד הזנה בדילול של אחד עד 50 וערבב היטב.

דגירה על קרח בחושך למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות יש לשטוף עם שני מיליליטר מאגר מכתים. צנטריפוגה ב 580 פעמים גרם למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש 200 מיקרוליטר של מאגר מכתים. השתמש בציטומטר זרימה המוגדר עם לייזר כחול, לייזר אדום ומסננים לזיהוי פלואורסצנטיות GFP ו-APC כדי לרכוש אותות APC ו-GFP. חלק התאים החיובי ל-GFP של אוכלוסיית התאים השליליים של APC מצביע על קרטינוציטים מותמרים.

כדי לבצע PCR בזמן אמת, הגדר תגובות בשלוש פעמים בצלחת של 96 בארות בנפח תגובה סופי של 25 מיקרוליטר. כל תגובה מכילה מיקרוליטר אחד של cDNA, 12.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2X, 1.25 מיקרוליטר פריימרים בתערובת בדיקה 20X ו-10.25 מיקרוליטר מים סטריליים. הפעל PCR בזמן אמת על פי תוכנית PCR זו, מחזור אחד ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת והחזק בארבע מעלות צלזיוס.

לבסוף, נתח את נתוני ה-PCR בזמן אמת כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ניתוח ביטוי של תאי HeLa שהומרו עם מינונים הולכים וגדלים של טרנספוזיציות בווקטורי מודולטור פלוס או מינוס דוקסיציקלין הראה כי נדרשים מינונים גבוהים של שני ה-IDLVs כדי לגרום חזק לביטוי SB100X. ניתוח כמותי של ביטוי SB100X על תאי HeLa שהומרו עם וקטור טרנספוזיציות בנוכחות או היעדר וקטור המאפנן חשף הפעלה של פי שמונה על הרקע בנוכחות דוקסיציקלין.

ניתן להשתמש במערכת היפהפייה הנרדמת המווסתת שעתוק גם בתאים ראשוניים. ביטוי SB100X על קרטינוציטים שהומרו עם טרנספוזיציות ווקטורי מודולטור הראה הפעלה של פי 15 על מצב כבוי. ניסוי הטרנספוזיציה שבוצע בקרטינוציטים שהומרו עם שלושת וקטורי ה-IDLV פלוס או מינוס דוקסיציקלין הצביע על כך ש-12% מהתאים שטופלו בדוקסיציקלין שילבו ביציבות לפחות עותק אחד של GFP בגנום שלהם.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההתמרה החיונית בתאים ראשוניים תוך שמונה שעות, ניתוח ציטופלואורימטרי תוך שעתיים וניתוח ביטוי תוך שלוש שעות אם מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את שילוב מינון הווקטור המשמש להתמרת תאים ראשוניים ולהשיג את רמת הביטוי הגבוהה יותר של טרנספוזיציות היפהפייה הנרדמת הניתנות להשראה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון PCR כמותי ו-PCR בתיווך מקשר על מנת לענות על שאלות נוספות כגון מספר עותק טרנספוזון לתא ואינטגרציה לתיוק הגנום.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הריפוי הגנטי לחקור את היישום של מערכת היפהפייה הנרדמת בהנדסת תאים רלוונטיים קליניים. לאחר צפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר תחילה קרטינוציטים ראשוניים עם וקטורי IDLV. שנית, למדוד את הביטוי של טרנספוזיציות היפראקטיביות במצב דוקסיציקלין ולבסוף לעקוב אחר טרנספוזיציה על ידי ציטומטריית זרימה.

אל תשכח שעבודה עם וקטורים ויראליים יכולה להיות מסוכנת ביותר ולכן יש לקחת איתך תמיד אמצעי זהירות כגון BCL כדי להכיל את הרמה והאספקה החד פעמית בעת ביצוע הליכים אלה.