הנדסה משטח של לנגרהנס עם StarPEG Nanocoating Heparinized

שיטה זו יכולה לעזור לפתור אתגרים גדולים בהשתלת איי לבלב, כגון דחייה חיסונית, רה-וסקולריזציה של האי לאחר ההשתלה והישרדות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שגישה קלה לאימוץ זו מאפשרת הנדסת פני שטח של תאים חיים על ידי עיצוב מחדש של הנוף התאי של אי הלבלב, היא תשפר את תפקוד השתל, ההישרדות ובסופו של דבר את היעילות הטיפולית של השתלת איים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפולים מבוססי תאים מכיוון שהתוצאה הטיפולית של טיפולים מבוססי תאים מוגבלת גם על ידי שימור תאים נמוך והישרדות ירודה.

מדגים את ההליך הזה הוא ג'ינגיי יאנג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. ראשית, שקלו 6.9 גרם הפרין והמיסו אותו ב-2 מיליליטר מים נטולי יונים קרים כקרח בשפופרת אפנדורף. ממיסים 0.23 גרם NHS ב-0.5 מיליליטר מים נטולי יונים קרים כקרח בצינור אפנדורף.

לאחר מכן, ממיסים 0.77 גרם EDC ב-0.5 מיליליטר מים נטולי יונים קרים כקרח בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. מערבבים את תמיסות ה-NHS וה-EDC בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר השארת התמיסה המעורבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, צנטריפוגה אותה ב-12,000 סל"ד למשך 10 דקות כדי להסיר את עודפי ה-EDC וה-NHS.

לאחר מכן, הוסף לתמיסה 30 מיליליטר אתנול קר וצנטריפוגה ב -12, 000 סל"ד למשך 10 דקות. כעת, הוסף 1 מיליליטר של 10% starPEG MI עזר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסף 0.67 מיליליטר של תמיסת 10% Heparin NHS לאותו צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

מניחים את התמיסה המעורבת באינקובטור בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לקבלת תמיסה צמיגה שקופה. בחר ידנית 200 איי עכברים שחולצו בעבר תחת מיקרוסקופ דיסקציה והועבר לצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר PBS לאיים ולצנטריפוגה ב-1,200 סל"ד למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

מסירים את הסופרנטנט, מוסיפים 250 מיקרוליטר מתמיסת Heparin PEG ומניחים את התערובת על קרח למשך 10 דקות. פיפטה למעלה ולמטה כדי לאפשר לאיים להתערבב היטב עם תמיסת Heparin PEG. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב -1, 200 סל"ד למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והוסף 500 מיקרוליטר PBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר צנטריפוגה ב-1, 200 סל"ד למשך דקה אחת, הסר את הסופרנטנט ושמור את האיים לשימוש נוסף.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של סל"ד I 1640, בתוספת 10% FBS לאיים המצופים. והעבירו את האיים הללו לצלחת תרבית חיידקים סטרילית שאינה טעונה. לבסוף, התבונן במורפולוגיה ובאותות הפלואורסצנטיים של האיים המצופים FAM-Heparin-PEG תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

פסגות הפרין אופייניות, המתאימות לקבוצות HYDROXAL, נצפו בספקטרום FTIR של ציפוי ננומטרי Heparin-PEG. הירידה במשרעת של פסגות אלה מייצגת צימוד בין קבוצות אמיד הסיוע של כוכב-PEG MI לבין קבוצת הפחמן של הפרין. השיא המתאים לרטט מתיחת הפחמן של האמיד הופחת גם הוא, מה שמצביע על תגובה מספקת בין קבוצות הפרין קרבוקסילט עם הסוקסונאט הסוצינימידלי והאמין לסיוע של כוכב-PEG MI.

סריקת נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים מראה את המבנה הנקבובי המקושר מאוד של ציפוי הננו Heparin-PEG, מה שמרמז על כך שהוא יכול להתאים להישרדות התאים במהלך אספקה in vivo. שכבה דקה של ציפוי ננו, המוצגת על ידי פלואורסצנטיות ירוקה, הושקעה באופן שווה על פני האיים המצופים, מבלי לגרום לשינויים ניכרים בנפח או בגודל האי. אי עכבר מצופה Heparin-PEG הפגין כדאיות חזקה של האי בתרבית.

היווצרות כלי דם מתקדמת יותר באופן משמעותי ניכרה מתאי אנדותל של איים שעברו תרבית משותפת עם איים מצופים Heparin-PEG, המסומנים על ידי מבנים מוארכים דמויי כלי דם מיקרו ומבנים דמויי רשת. רמה נמוכה של הפרשת אינסולין נצפתה בכל קבוצות הטיפול כאשר האיים הוחדרו בתמיסת מלח פיזיולוגית, בתוספת רמה תת-מעוררת של גלוקוז. כאשר האיים היו מגורים עם רמה סופר-פיזיולוגית של גלוקוז, נצפתה עלייה בהפרשת האינסולין.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את הציפוי תוך דקה אם הוא מבוצע כראוי כדי לשמר את כדאיות האי.