הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין
29 ביוני 2018
Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.
שיטה זו יכולה לעזור למדענים למקסם את השימוש הפרודוקטיבי באיי הלבלב כדי להעריך תוצאות מרובות על כל דגימה בארכיטקטורת הרקמות המקורית שלה. היתרון העיקרי של שיטת הטבעה חדשה זו הוא שהאיים מפוזרים באופן שווה על פני שטח מוגדר היטב, מה שמציב איים רבים במישור החתך המייעל את התפוקה הניסיונית מחומר זה בשפע נמוך. מי שידגים את ההליך יהיה דוקטור יאהוי קונג, עמית מחקר במעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בקצה פיפטה p200 בעל קשירה נמוכה וברשת מכוילת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור ידנית 250 איים שווי ערך. העברתם לכל צינור מיקרופוגה בעל כריכה נמוכה של 1.5 מיליליטר. תן לאיים להתיישב בתחתית צינור המיקרופוגה.
לאחר מכן, השתמש בפיפטה עם קצה p200 טרי כדי להסיר בזהירות את רוב הסופרנטנט. הקפד לא להסיר איים. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה בצנטריפוגה עם דלי מתנדנד עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה ואז עצור את הסיבוב.
הסר את ה-supernatant. חזור על כל תהליך הכביסה הזה של PBS בסך הכל שני מחזורי כביסה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פורמלין 10% או 4% פרפורמלדהיד טרי.
תן לדגימה להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה עם קצה p200 כדי להסיר את הקיבוע. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה עד שהמהירות מגיעה לכוח הכבידה של 200 פעמים ואז עצור את הסיבוב.
הסר את ה-supernatant ולאחר מכן חזור על כל תהליך הכביסה של PBS פעם נוספת בסך הכל שני מחזורי כביסה. הכן את הג'ל הרצוי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הניחו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה הללו בגוש חום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הג'ל.
השתמש בקצה מיקרופיפטה חתוך כדי להעביר 10 מיקרוליטר של חרוזים כחולים אגרוז לדגימה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של PBS לחרוזים, ואז צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 800 למשך דקה אחת. הסר את ה-PBS וחזור על שטיפה זו פעם נוספת.
לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את החרוזים בכמות מתאימה של PBS. צנטריפוגה את הצינורות המכילים את האיים עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה ואז עוצרים את הסיבוב. הסר את רוב הסופרנטנט.
בעזרת מספריים חתכו את הקצה של קצה מיקרופיפטה אחד של 10 מיקרוליטר עבור כל דגימה. הוסף 10 מיקרוליטר חרוזים לכל צינור אי באמצעות קצה חתוך נקי לכל דגימה. ואז צנטריפוגה עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה.
לאחר מכן, השתמש בקצה לא חתוך של 200 מיקרוליטר ואחריו קצה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר כמה שיותר PBS. סמן את שקופיות המיקרוסקופ לזיהוי דגימה והנח אותן על הספסל ליד גוש החום עם הג'ל המחומם. בעזרת מספריים, חותכים את הקצוות מכמה קצות מיקרופיפטה בעלי קשירה נמוכה לכל דגימה.
בעזרת מיקרופיפטה המצוידת בקצה חתוך, הוסף ג'ל חם לצינור המכיל איים וחרוזים. מערבבים מיד תוך הימנעות מיצירת בועות כלשהן. מרחו תערובת זו על שקופית היוצרת דיסק ליד קצה השקופית תוך השארת מקום לטבעת הג'ל החיצונית.
לאחר מכן, הקש על השקופית בעדינות כמה פעמים כדי ליישב את האיים והחרוזים. הוסף 20 מיקרוליטר ג'ל חם לצינור הדגימה וערבב את הג'ל החדש עם כל האיים והחרוזים שנותרו. מרחו תערובת זו על אותה שקופית המקיפה את הדיסק המקורי.
חזור על הפעולה לפי הצורך באמצעות טיפים חדשים שנחתכו מראש עבור כל יישום עד שהדיסק יגיע לגודל ולעובי הרצויים. הקפד להכין כל דיסק בנפרד ולעקוב אחר סדר הדגימה אם אתה מניח מספר דיסקים בכל צד. לאחר מכן, הניחו את המגלשות על משטח ישר של קרח רטוב וכסו אותן.
נותנים לשקופיות לנוח 10 דקות או עד שהג'ל מתמצק. לאחר מכן, הסר את השקופיות והקפד לייבש את החלק האחורי של כל אחת מהן. סמן קלטת עיבוד והטמעת רקמות ביופסיה עבור כל דגימה.
השתמש בקצה הקהה של סכין גילוח כדי לדחוף בעדינות את הדיסק מכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, דחוף לאט את הדיסק מהשקף והנח את הדיסק עם הצד השטוח כלפי מטה ישירות על הנייר. זה יכול להיות קשה לשמור על הדיסקים המובחנים שלמים בזמן ההחלקה משקופית הזכוכית לנייר.
אם מופיע קמט בדיסק, אפשר לו לחזור למצב המקורי, הוסף עוד ג'ל וג'ל מחדש את השקופית. קפל את הנייר סביב הדיסק כדי למנוע תנועה. העבירו את זה לקסטה ואז סגרו את הקסטה.
טבלו את הקסטה בכוס מלאה ב-PBS. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת הטמעה מבוססת דיסק ג'ל שונה כדי לייצר ביעילות תשואה גבוהה של איים לכל חתך. המורפולוגיה של איי המכרסמים שלמה יותר באופן ניכר לאחר התאוששות לאחר הבידוד במדיום האי המציג משטח מעוגל חלק וצורה כדורית קומפקטית.
העובדה שהמורפולוגיה של האיים האנושיים דומה, בין אם היא מוטמעת ביום ההגעה או לאחר התאוששות לאחר המשלוח בלילה, יכולה לנבוע מכך שהאיים מתאוששים מלחץ הבידוד לפני המשלוח. לשם השוואה, קטעי הפרפין המתקבלים בטכניקת המיקרו שפופרת הישנה, נראים כבעלי שטח חתך רקמה קטן יותר עם פחות איים בכל חתך ועם איים וחרוזים צפופים. כפי שמוצג כאן, טכניקה זו מסוגלת לייצר קטעי איים באיכות גבוהה לצביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית.
צביעת אינסולין וגלוקגון מראים את ההרכב המגוון וההטרוגניות של ארכיטקטורת האיים המדגימים הבדלים אדריכליים ידועים בין איי אדם, עכבר וחולדה. תמונות אלה מייצגות גם חלקים סדרתיים של אותם איים. הוכחה כי טכניקה זו מסוגלת להשיג חלקים מרובים מאותם איים.
לאחר שליטה, טכניקה זו חוסכת זמן בטכניקת המיקרו-צנטריפוגה. יצירת הדיסק על משטח ישר ולא בצינור מקלה על העברת הדיסק פיזית לקלטת לעיבוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה של האיים, ניתן ליישם אותה גם על גושי תאים אחרים או רקמות פריכות שקשה לחתוך אותן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בג'ל בנפח קטן כדי לרכז רקמה באזור קטן וליצור את הדיסק על משטח ישר. כמו כן, קריטי להשתמש בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בעלי קשירה נמוכה ובקצות פיפטות כדי לשפר את תפוקת הרקמות. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של האיים לחקור את הרכב סוג התא וההטרוגניות, אינטראקציה בין תאים וויסות גנים באיים מתורבתים שלמים בארכיטקטורה הטבעית שלהם.
היכולת ליצור 10 קטעים או יותר המכילים איים רבים מתנאי ניסוי יחיד מאפשרת כימות של תוצאות מרובות על אותו חומר, ומשפרת את יעילות הניסוי. יישום טכניקה זו על דגימות רקמה בשפע מוגבל עשוי להציע יתרונות גם לתחומים אחרים. ייתכן שיהיה צורך לשנות אלמנטים של הליך זה כדי לענות על צרכי המשתמש.
יש לייעל את עוצמת הקיבוע ואת החלוקה. ניתן ליצור דיסק עבה או גדול יותר בטכניקה זו. ייתכן שיהיה צורך למקם שלבי עיבוד פשוטים להטמעה ויש לייעל אותם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור בלוק תאי אגרוז באיכות גבוהה עבור קטעי פרפין של איי לבלב מתורבתים שלמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית להפקת חתכי פאראפין באיכות גבוהה של איים לבלביים שלמים שגודלו בתרבית, ובכך משפר את השימוש בהם במחקרים על סוכרת. הטכניקה מאפשרת הערכה יעילה של מספר תוצאים תוך שימור המבנה התלת-ממדי הטבעי של האיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר סוכרת
רקע
- מחקרים של איים לבלביים ex vivo הם חיוניים להבנת מחלת הסוכרת.
- שיטות מסורתיות לחקר איים הם לרוב לא יעילות ואינן מנוצלות מספיק.
- שמירה על הארכיטקטורה הטבעית של האי חיונית להערכה מדויקת.
- שיטה חדשה זו שואפת לשפר את התנובה ואת איכות התוצאות הניסוייות.
מטרת המחקר
- להציג שיטה פשוטה ויעילה לקיבוע של איים הלבלב.
- למקסם את התוצאות הניסוייות מחומר גלם של איים לבלביים בשכיחות נמוכה.
- לאפשר הערכה של מספר מדדים בכל דגימה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש בטיפ פה של פיפט p200 בעל קישוריות נמוכה (low-binding) לבחירת איים.
- ב soon-picking ידני של 250 שווי-איים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- העברת האיים לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה בעלות קישוריות נמוכה.
- מתן זמן לאיים לשקוע לצורך חיתוך אופטימלי.
תוצאים עיקריים
- שיטת ההטמעה החדשה מאפשרת פיזור אחיד של איים.
- איים רבים ממוקמים במישור החיתוך, מה שמעלה את התנובה.
- הפרוצדורה מודגמת על ידי ד"ר Yahui Kong.
- מתודולוגיה משופרת תומכת בתוצאות טובות יותר במחקר על סוכרת.
מסקנות
- שיטה זו משפרת משמעותית את חקר איים לבלביים.
- היא מספקת גישה יעילה יותר למחקר של איים לבלביים.
- מחקרים עתידיים יכולים להפיק תועלת מטכניקה משופרת זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לאתגר של זמינות מוגבלת של איים לבלב במחקרי סוכרת, על ידי מתן אפשרות לחיתוך בפרפין של איים מתורבתים בתפוקה גבוהה תוך שימור המבנה המקורי. היא תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי מתן אפשרות לניתוח ספציפי לסוגי תאים ומדידת תוצאות מרובות מאותה דגימה, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בתיקוף של מטרות בשלבים פרה-קליניים. הגישה מחזקת את הרצף התרגומי משלב הגילוי דרך השלבים הפרה-קליניים, על ידי שמירה על שלמות האיים במהלך חשיפה ניסויית וניתוח.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידות ספציפיות לסוג תא בתוך ארכיטקטורה של איים של לבלב שלמים.
- ערך תפעולי: מפחית את אובדן החומר ומגדיל את מספר החתכים השמישים לכל הכנת איים, ובכך משפר את היעילות בתהליכי עבודה עם דגימות בשכיחות נמוכה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: יצירת חתכים סטנדרטיים וניתנים לשחזור המתאימים לסריקה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית של השפעת תרכובות על תפקוד האיים.
- ערך תפעולי: תמיכה ביכולת הרחבה של הבדיקה על ידי הפקת 10+ חתכים לכל בלוק של איים, מה שמאפשר קריאות מקבילות מאותו חומר ביולוגי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על אינטראקציות טבעיות בין תאי איים לבין תאים ובין תאים לתשתית, ובכך תומך בהערכות תפקודיות הרלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר עקביות בין חתכים לצורך ניתוח אורכי של תגובות איים לתנאים ניסיוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח פנוטיפי מפורט לאחר חשיפה לתרכובות, תומכת בזיהוי מובילים (leads) באמצעות תוצאים השומרים על המבנה המרחבי, ומספקת בסיס להחלטות בנוגע לקידום פרה-קליני באמצעות פרופיל כמותי ורב-פרמטרי של איים לבלביים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי שימור ארכיטקטורת האיים במהלך מניפולציות ניסוייות ואנליזה.
- סריקה: משפר את המוכנות והשחזוריות של הבדיקה באמצעות פיזור אחיד של האיים ותנובה גבוהה של חתכים לכל דגימה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות חיתוך סדרתי לקבלת תוצאות מבניות ומולקולריות מתואמות.
- מחקר תרגומי: מקדם רציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להערכת תגובות של איים שלמים המשקפות התנהגות של רקמה טבעית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הטמעה ניתנת לשימוש חוזר, הישמימה גם לדגמי רקמות שבירות אחרות או כאלו בעלות תנובה נמוכה, מעבר לאיי הלבלב.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות נתונים ספציפיים לסוג תא השומרים על המבנה הארכיטקטוני.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) של חיתוך איים הלבלב בין צוותי מחקר ומעבדות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכת תוצאות רב-פרמטרית מדגימות ביולוגיות מוגבלות ובעלות ערך גבוה.
- השפעה על הפורטפוליו: משפר את תיעדוף הסיכונים באמצעות סמנים ביולוגיים (biomarkers) אמינים וקוונטיפיבליים של תפקוד ורעילות המבוססים על איים הלבלב.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של הטמעה היסטולוגית וחיתוך לצורך טיפול אופטימלי בג'ל ויצירת דיסקים.
- תלוי בגישה לציוד היסטולוגיה סטנדרטי הכולל בלוקים מחממים, צנטריפוגות, מיקרוטומים ותחנות צביעה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הג'ל וממדי הדיסקים כדי להבטיח עקביות בחיתוך.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לרקמות פריכות אחרות בעלות גודל, צפיפות או שבירות משתנים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לאופטימיזציה של עוצמת הקיבוע ועובי הדיסק כדי למנוע ארטיפקטים ולהבטיח את איכות החיתוך.
