Name: הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למדו שיטת הטבעה חדשנית לאיי הלבלב בשלמותם לחתכי פרפין, המאפשרת הערכה יעילה של תוצאות מרובות תוך שמירה על הארכיטקטורה התלת-ממדית הטבעית. השיטה מייעלת ניצול חומר נדיר ומשפרת משמעותית את תפוקת הניסויים במחקר הסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו להכיר בהכרת תודה הקבוצה ביולוגיה תאי בטא-תעודה מזויפת של אונ' סוכרת מרכז של מצוינות עבור עצות מועילות ודיונים. האדם לנגרהנס נמסרו על ידי NIDDK במימון משולב איון הפצה התוכנית (IIDP)-עיר של תקווה. עבודה זו מומן על ידי NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (חודשים), 2UC4DK098085 (IIDP), על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת תמלא #1-15-BS-003 (LCA) בשיתוף עם הסדר של ירבוז.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי במסצ'וסטס הספר מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה. איון האנושי מחקרים נקבעו על ידי מועצת המנהלים לסקור מוסדיים במסצ'וסטס אינן מצריכות סקירה IRB או פטור משום שהם אינם כרוכים השימוש של בני אדם.
1. איון בידוד ותרבות
<ol><li>לבודד איונים, נפרדות ובלחות אקסוקרינית ו ductal רקמות בשיטת הבחירה שלך. הערה: שיטה זו היה ממוטב באמצעות איים מבודדים collagenase ductal insufflation ו Ficoll ההפרדה12 (מכרסם) או משלוח שלאחר איונים מתוכנית משולב איון הפצה (IIDP13; האדם). איים מוגנים עם micropipette P200.</li>
	<li>כדי למטב את איון מורפולוגיה, לאפשר איונים להתאושש בין לילה ב 10 מ"ל איון מוחלט בינוני (RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L) בתוך תא humidified המכילה 5% CO2 ב 37 º C. למרות שלב זה לא נדרש להשיג חלקים, איים שלמים יותר לאחר תקופת התאוששות (ראה איור 2).</li>
</ol>2. איון קיבוע
<ol><li>באמצעות טיפ P200 נמוך מחייב, לבחור. לאישתך כ 250 איון מקבילות (IEQ)13 באמצעות רשת מכוילת תחת stereomicroscope לתוך צינור microfuge 1.5 mL מחייב נמוכה. טיפים וצינורות נמוך מחייב להפחית את אובדן איון.</li>
	<li>לאפשר איונים להתיישב לתחתית הצינור microfuge. הסר את תגובת שיקוע ברוב עם טיפ pipet P200, מטפל יש להסיר כל איונים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור ומפרידה דלי מתנדנדים עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של פתרון פורמלין 10% או 4% טריות paraformaldehyde. לתקן בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. התוצאות נבדק בשיטה זו, שיטות קיבוע אלה היו להבחין מגניחותיה. קיבוע קצר יותר ייתכן גם שתהיה אפשרות; מומלץ למטב את הקיבעון משך התוצאה הרצויה.</li>
	<li>הסר את לשבועיים עם טיפ P200.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.</li>
	<li>המשך מיד לשלב הבא.</li>
</ol>3. הכנת דיסק איון (איור 1)
<ol><li>השימוש הראשון, להמיס את הג'ל (למשל, Histogel) ב 70 ° C ולעשות aliquots ב 1.5 mL microfuge צינורות לאחסון לטווח ארוך. נפח aliquot אינה קריטית, שכן aliquots יכול להיות שימוש חוזר.</li>
	<li>לחמם את הג'ל (כ-100 µL עבור דגימה) ב 70 מעלות צלזיוס על ידי הצבת microfuge שפופרת המכילה את aliquot ג'ל בתוך גוש חום מוגדר כ- 70 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העברת agarose כחול חרוזים (10 µL עבור כל דגימה) לתוך צינור נקי microfuge 1.5 mL. Resuspend ביסודיות את החרוזים לפני pipetting. הערה: חרוזים כחול מעורבבים עם איונים כדי לסייע בזיהוי חזותי של החומר מוטמע לחצן agarose ואת הרחוב פרפין. מספר חרוזים כחול המשמש אינה קריטית לתוצאות, אך להימנע חרוזים מוגזמת (> 5 x מספר איים קטנים) כדי לאפשר הפצה אופטימלית של איים קטנים בסעיפים.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים הכחולים עם 1 מ"ל PBS, פעמיים. עבור כל כביסה, לסובב את החרוזים 1 דקות ב- g 800 x. לאחר לשטוף את השני, resuspend את החרוזים ב (n+2) x 10 הציבורית µL, כאשר n הוא המספר של צינורות מדגם; לדוגמה, עבור 2 צינורות מדגם, האחסון PBS כדי להוסיף החרוזים יהיה 40 µL.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור microfuge המכיל איים קטנים (קצר spin כדי 200 גרם x) ולהסיר את רוב תגובת שיקוע. לחתוך את הקצה של טיפ micropipette 10 µL בעזרת מספריים או סכין ולהוסיף 10 µL של חרוזים כל שפופרת איון, באמצעות טיפ נקי עבור כל דגימה. לא מערבבים (כדי להימנע מאובדן איים קטנים).</li>
	<li>צנטריפוגה איים קטנים, חרוזים (קצר spin כדי 200 גרם x). להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר עם טיפ micropipette נימולים 10 µL.</li>
	<li>תווית של שקופיות מיקרוסקופ לזיהוי הדגימה. 2-3 דוגמאות ניתן להכין בכל שקופית. מקם את השקופית על הספסל ליד הרחוב חום עם ג'ל ומחוממת. חותכים הטיפים של שלוש עד חמש 20 טיפים micropipette µL קשירה נמוכה עבור דגימה עם גילוח או מספריים. לטעון micropipettes P20 שני עם טיפים לחתוך כדי לאפשר מהירה מתמיכת אחד לשני.</li>
	<li>באמצעות את micropipette הראשונה, להוסיף µL 15-20 של ג'ל חם הצינור microfuge איים קטנים/חרוזים; מיד לערבב, הימנעות בועות; חלות נוזל התערובת אגר/איים קטנים/חרוזים השקופית לטופס < דיסק בקוטר 1 ס מ. מקם את הדיסק סמוך לקצה השקופית, משאיר מקום הטבעת החיצונית ג'ל (השלב הבא). הקש על השקופית בעדינות מספר פעמים כדי ליישב את איים קטנים, חרוזים.</li>
	<li>באמצעות micropipette של השני, להוסיף 20 µL של ג'ל חם הצינור הדגימה. באמצעות את micropipette הראשונה, לערבב ג'ל חדש עם כל שאר איונים/חרוזים, מחדש ההתחממות בבלוק חום אם הוא מתחיל לגבש, לאחר מכן להחיל תערובת זו אל השקופית, המקיפים את הדיסק המקורי. חזור על הצורך, באמצעות טיפים נוספים חתוכות מראש, עד הדיסק הוא הגודל הרצוי ואת עובי. הערה: טיפול הדיסק וג'ל קל אם הטבעת מבחוץ היא מעט עבה יותר. בדרך כלל, 3 x 20 µL של ג'ל מספיקה. שלב זה ממזער אובדן איים על ידי צינור שוטף ומוסיפה מסכן איון agarose החיצוני של הדיסק כדי להקל על הטיפול דיסק.</li>
	<li>להכין כל דיסק בנפרד ולשמור בזהירות אחר סדר דגימה אם הצבת מרובות דיסקים בכל שקופית.</li>
	<li>במקום השקופיות על משטח שטוח של קרח רטוב, עם כיסוי, במשך 10 דקות או עד עפור הג'ל. . זה קשה יותר להחליק את הדיסק את הזכוכית אם זה מתייבש.</li>
	<li>תווית ביופסיה עיבוד/הטבעה רקמות קלטות עם עיפרון, אחד לכל דגימה. יבש האחורי של השקופית כדי להימנע להרטיב את נייר כחול.</li>
	<li>משתמש הקצה הקהה של סכין גילוח, דחף בעדינות את הדיסק לכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, לאט לדחוף את הדיסק מתוך השקופית מיקרוסקופ על הנייר טישו כחול. הנח את התקליטור, צידה השטוח, ישירות על הנייר.</li>
	<li>שמירה על הדיסק שטוח, מקפלים את הנייר סביב התקליטור כדי למנוע תנועה, הכנס את הדיסק נייר מקופל בקלטת, ולסגור את הקלטת. אם הדיסק לא לגלוש נקיה הזכוכית, להוסיף ג'ל נוסף ו/או להחזיר את השקופית לקרח במשך עוד כמה דקות.</li>
	<li>להטביע את הקלטת ב- PBS ב גביע. תהליך פרפין הטבעה באותו היום על מורפולוגיה של האופטימלית.</li>
</ol>4. פרפין הטבעה
הערה: תהליך הג'ל איון דיסקים פרפין בלוקים באמצעות סדרות התייבשות מקוצרת כפי שמתואר להלן. טכניקה זו אופטימלי באמצעות מעבד אוטומטית, אך עיבוד ידני צריך לייצר תוצאות דומות.
<ol><li>לטבול קלטות 85% אתנול במשך 15 דקות.</li>
	<li>לטבול קלטות אתנול 95% במשך 15 דקות.</li>
	<li>לטבול קלטות 100% אתנול במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.</li>
	<li>לטבול קלטות של קסילן במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.</li>
	<li>לטבול קלטות של פרפין מותכת במשך 10 דקות.</li>
	<li>העברת קלטות פרפין מותכת טריים למשך 10-30 דקות.</li>
	<li>בזהירות פתח את הקלטת, עטיפה בעיתון כחול. הסר את התקליטור ג'ל, שמירה על מסלול של משטח שטוח שהופעל על הנייר. להטביע את הדיסק בתבנית קטנה, עם משטח שטוח (המכילות איון) למטה, במקביל למשטח חיתוך. עבור התקע, בזהירות להסיר אותו בקלטת, להטביע אותו תבנית קטנה עם קצה והצביע לעבר משטח חיתוך.</li>
</ol>5. פרפין חלוקתה ולא מכתים
<ol><li>תווית שקופיות ברצף אם מקטעים טורי נדרשות.</li>
	<li>יש 5 מיקרומטר פרפין מקטעים קיצוץ של histotechnologist מנוסה. כדי למקסם את התשואה, שמור כל המקטעים המכילים חומר. באופן כללי, איסוף מקטעים 20 מאפשר לכידה של רוב החומר.</li>
	<li>חנות מקטעים בטמפרטורת החדר. סעיפים נתונות שגרתית היסטולוגית כתמים (למשל, H & E) ו immunofluorescence (למשל, אינסולין, גלוקגון, דאפי). למטב את הקיבעון של אנטיגנים אחרים, אם יש צורך בכך.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li>
<li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+demand+regulates+%CE%B2+cell+number+via+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li>
<li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Induces+Mouse+%CE%B2-Cell+Proliferation+via+IRS2%2C+MTOR%2C+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li>
<li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%3A+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li>
<li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cell+block+processing%3A+The+Cell-Gel+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li>
<li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+infusion+in+mice%3A+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li>
<li>Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://iidp.coh.org/">http://iidp.coh.org/</a> (2018).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.

ששונה ג'ל-דיסק מבוסס ההטבעה שיטה זו מספקת פשוטה, זולה, דרך יעילה ליצירת תשואה גבוהה של איים קטנים לכל סעיף. בניית הדיסק ג'ל על משטח זכוכית שטוחה מקלה על איונים מתפשטת בריפודי כתופיים מעל אזור מוגדר היטב. להפיץ את איים בדיסק שטוח מציעה את היתרון של הצבת איים רבים במישור של מקטע, אופטימיזציה של התשואה ומאפשר איונים פחות לשמש. ניתן להתאים את עובי דיסק כדי לענות על הצרכים של החוקרים. מאז ניתן להשיג מספר מקטעים, טורי חלקים איים באותו יכול להיות מנותח, הגדלת מספר תוצאות נפרדות שניתן למדידה על הדגימה ניסיוני באותו. למרות המותאם...

הלבלב לנגרהנס, המקור הבלעדי של מחזורי אינסולין, הם רקמה קריטי לחוקרים הלומדים סוכרת. מכל יצור נתונה, איים קטנים יש גודל המשתנה תדירות סוג התא, אדריכלות1,2,3. האסטרטגיה קונבנציונאלי ללמוד ויוו מבנה והרכב האנדוקרינית תא לנגרהנס הוא על ידי חלוקתה4,של רקמת הלבלב5. מאז איונים מהווים רק חלק קטן הכולל תכנים סלולריים הלבלב, במחקרים מולקולריים מבוצעות על איים מבודדים. Ex-vivo איון תרבות ניסויים בדיקות בתגובה חומרים מזינים, ג'ין אפנון (תרביות תאים, התמרה חושית), או טיפולים ניסיוניים לספק חשוב תובנות מנגנוני הכוח ויסות הישרדות cell האנדוקרינית, התפשטות, ופועלים 5 , 6.
Ex-vivo איון ניסויים לעיתים קרובות הם ניתחו שימוש במחקרים מולקולריים של איים שלם או מחקרים היסטולוגית או מולקולרית של תאי איון התפזרו גדלו ב חד שכבתי5,6. אנליזה מולקולרית של איים קטנים כל מציג אזהרה חמורה של סוגי תאים intermixing, אשר עשויה לייצר תוצאות שווא-שלילי או חיובי-false כאשר אומדן לכל סוג של תא בודד. תא פיזור על coverslips עבור פוסט-תרבות מיקרוסקופיה מאפשר מדידה תוצאה ייחודיים לסוג התא, אך משבש איון אדריכלות, אשר עשוי לשנות את התגובה להתערבות, מונע זיהוי של תוצאות הקשורות אדריכלות. בנוסף, בדרך כלל רק תוצאה אחת ניתן למדוד; לדוגמה, כדי למדוד את התפשטות תאי בטא ומוות תאי בטא תחת באותם התנאים, שני ניסויים נפרדים צריך להתבצע. גישות אלה הם גם עיוור הבין-איון השתנות, שטח של עניין גובר בתחום. מיון תאי איון מאת cytometry זרימה במחקרים מולקולריים ייחודיים לסוג התא, או מחקרים RNA בתא יחיד הינם אלגנטיים אך יקר, זמן רב, מוגבלת על ידי רקמת שפע, ולחסל-אדריכלות, לא מתאימה כדי תא שגרתית תרבות ניתוחים 5 , 7. הדמיה קונאפוקלית של איים immunostained כולה-הר מספק נתונים שלם-אדריכלות באיכות גבוהה, אבל עמל רב, והנתונים שהתקבלו כל מדגם מוגבל לתוצאות לזיהוי יחיד immunostaining8.
היכולת לייצר באיכות גבוהה פרפין מקטעים של פוסט-תרבות איונים כל כתובת זו הרבה חששות אלה. עלות גבוהה, נמוך-שפע איון רקמות דגמים גנטיים ייחודיים או תורמי איברים אנושיים, או איים מצב פוסט vivo בתוך או במבחנה ניסיוני מניפולציה, יקרות. קבלת מספר מקטעים פרפין מ איונים באותו תאפשר ניתוחים ייחודיים לסוג התא, שלם-ארכיטקטורה מרובים מאותו הניסוי.
קיימות טכניקות ליצירת כדורי איון על חלוקתה מושלמים. Agarose הממוטבים היסטולוגיה היא ג'ל מימית נקודת התכה נמוכה נרחב המשמש לעיבוד היסטולוגית ו cytological דגימות כולל דגימות רקמה קטן או מפוצלים שקשה תהליך9. אחד איון הטמעת הגישה היא להשעות את איים קטנים ב- agarose בשפופרת microcentrifuge, צנטריפוגה הצניפה החומר, לאחזר את התקע אגר, ולאחר מכן לעבד, להטביע על חלוקתה10,11. חילוץ המדגם הקרושה מהחלק התחתון של הצינור הוא זמן רב וקשה, שמוביל מפעם לפעם פיצול של המדגם, הסיכון לפציעה. איים מרוכזים בקצה של התקע, שמוביל איון לקוי הפצה בסעיפים המתקבל בשיטה זו. בתחתית התקע עגול מסבך הטבעה כזאת אזור איון-עניים שיוצבו על חלוקתה. בסך הכל, שיטה זו מובילה תשואה נמוכה והפצה איון גושית בסעיפים וכתוצאה מכך.
שיטה חדשה זו היא גישה מפושטת ומשופרות עבור הכנת איון מקטעים. איים מרוכזים אמצעי אחסון קטן, ואז להניח אותה על פני חלקה של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור דיסק קטן, עם איים מטוס יחיד. הדיסק Histogel-איון לאחר מכן מעובד עבור פרפין הטבעה התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות פרוטוקול. הגישה הקודמת, אשר מרכזת את איונים בחלק התחתון של צינור microfuge, מבוצעת גם לשם השוואה. טכניקה חדשה זו משפרת את התשואה של איים קטנים לכל סעיף, ההתפלגות של איים קטנים בכל מקטע, ולוקח פחות זמן כדי להעביר בלוקים איון קלטות. טכניקה זו שימושית לביולוגים איון או מדענים אחרים הלומדים חתיכות קטנות של רקמות המעוניינים למקסם פורה לשימוש טישו נמוך-שפע על ידי מדידת תוצאות מרובות על דוגמה אחת בארכיטקטורה רקמה מקורי שלו.

<table><tbody><tr><td>צינור אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ranin Classic</td><td>Starter Kit ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>קצה כריכה נמוך (1000 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>קצה קשירה נמוך (200 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>קצה קשירה נמוך (20 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>קצה כריכה נמוך (10 &mu; L)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% תמיסת פורמלין</td><td>סיגמא</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים כחולים אגרוז- אפי-ג'ל</td><td>ביו-ראד</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Life טכנולוגיות</td><td>14190-144</td><td></td> <td>של Dulbecco</td></tr><tr><td>קלטת עיבוד רקמות</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000 מעבד רקמות</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול 200 הוכחה</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>מקורמיק Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finesse ME+</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אינסולין</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן גלוקגון</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield עם DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 נוגדנים משניים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>אלכס פלואור 488 נוגדנים משניים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

ניסויים באמצעות איים מבודדים הלבלב חשובים למחקר בסוכרת, אך איונים הם יקרים השפע מוגבל. איונים מכילים אוכלוסיה לתא מעורב באדריכלות מובנית אשר משפיעה על תפקוד, איונים אנושי נרחב משתנה בקומפוזיציה סוג התא. שיטות נפוצות ללמוד איונים בתרבית כוללים מולקולרית מחקרים שבוצעו על כל איונים, מכלילה איון ובתחזוקה סוגי תאים ביחד, או מיקרוסקופ או במחקרים מולקולריים בתאי איון התפזרו, שיבוש איון אדריכלות. ללימודים ויוו איון, הלבלב פרפין-מוטבע חלוקתה היא טכניקה חזקה כדי להעריך את תוצאות ספציפיות תא בסביבת הלבלב מקורית. לימוד פוסט-תרבות איים על ידי חלוקתה פרפין, הייתי מציע מספר יתרונות: זיהוי של תוצאות מרובים על אותו איים קטנים (שעשויות להיות אפילו אותו ליתר דיוק איונים, באמצעות סעיפים טורי), מדידות ייחודיים לסוג התא, יליד לשמירה על איון תא התא, התא-תשתית אינטראקציות במהלך החשיפה ניסיוני והן לצורך ניתוח. עם זאת, קיימות טכניקות הטבעה מבודדים איונים פוסט-תרבות הן לא יעיל, זמן רב, נוטה אובדן של חומר, בדרך כלל לייצר סעיפים במספרים איון לא מספיק כדי להיות שימושי עבור לכימות תוצאות. הפתולוגיה הקלינית מעבדה התא בלוק הכנה מתקני הינם נגישים ולא מעשי עבור מעבדות מחקר בסיסי. פיתחנו שיטת ספסל-העליון משופרת, ההופך את יוצרת מקטעים עם תשואה חזקים והפצה של איים קטנים. איונים קבוע resuspended ב agarose היסטולוגית חמים ג'ל, pipetted לתוך דיסק שטוח על משטח זכוכית רגילה, כך איים מפוזרים במטוס. לאחר התייבשות רגילה, הטבעה, ניתן לחתוך (10 +) 4-5 מיקרומטר מקטעים מרובים מהגוש איון אותו. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניתוחים היסטולוגית ו immunofluorescent על עכבר, חולדה, איונים אנושי. זו גישה אפקטיבית, זולה, לחיסכון בזמן כדי להעריך מן איונים בתרבית תאים ייחודיים לסוג, שלם-אדריכלות התוצאות.

מפרטים טכניים מאויר של צעדים כדי להכין את הדיסק ג'ל מוצג באיור1. זה ג'ל דיסק בשיטה התוצאות בסעיפים פרפין המכילים מספר מספיק של איים מופץ במטוס בודד כדי לאפשר כימות משמעות של תוצאות. איור 2 מציג תמונות נמוך-הגדלה של הסעיפים שנוצר כדי להמחיש את מספר איונים שנתפסו לפי סעיף. באופן כללי, &gt; איונים 35 היו גלויים בכל מקטע 250 IEQ שימשו את ההליך, ו &gt; סעיפים 10 (4-5 מיקרומטר) המכיל איונים, התקבלו כל דגימה. הגדלת מספר איים קטנים המשמש...

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

שיטה זו יכולה לעזור למדענים למקסם את השימוש הפרודוקטיבי באיי הלבלב כדי להעריך תוצאות מרובות על כל דגימה בארכיטקטורת הרקמות המקורית שלה. היתרון העיקרי של שיטת הטבעה חדשה זו הוא שהאיים מפוזרים באופן שווה על פני שטח מוגדר היטב, מה שמציב איים רבים במישור החתך המייעל את התפוקה הניסיונית מחומר זה בשפע נמוך. מי שידגים את ההליך יהיה דוקטור יאהוי קונג, עמית מחקר במעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בקצה פיפטה p200 בעל קשירה נמוכה וברשת מכוילת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור ידנית 250 איים שווי ערך. העברתם לכל צינור מיקרופוגה בעל כריכה נמוכה של 1.5 מיליליטר. תן לאיים להתיישב בתחתית צינור המיקרופוגה.לאחר מכן, השתמש בפיפטה עם קצה p200 טרי כדי להסיר בזהירות את רוב הסופרנטנט. הקפד לא להסיר איים. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה בצנטריפוגה עם דלי מתנדנד עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה ואז עצור את הסיבוב.הסר את ה-supernatant. חזור על כל תהליך הכביסה הזה של PBS בסך הכל שני מחזורי כביסה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פורמלין 10% או 4% פרפורמלדהיד טרי.תן לדגימה להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה עם קצה p200 כדי להסיר את הקיבוע. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה עד שהמהירות מגיעה לכוח הכבידה של 200 פעמים ואז עצור את הסיבוב.הסר את ה-supernatant ולאחר מכן חזור על כל תהליך הכביסה של PBS פעם נוספת בסך הכל שני מחזורי כביסה. הכן את הג'ל הרצוי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הניחו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה הללו בגוש חום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הג'ל.השתמש בקצה מיקרופיפטה חתוך כדי להעביר 10 מיקרוליטר של חרוזים כחולים אגרוז לדגימה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של PBS לחרוזים, ואז צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 800 למשך דקה אחת. הסר את ה-PBS וחזור על שטיפה זו פעם נוספת.לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את החרוזים בכמות מתאימה של PBS. צנטריפוגה את הצינורות המכילים את האיים עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה ואז עוצרים את הסיבוב. הסר את רוב הסופרנטנט.בעזרת מספריים חתכו את הקצה של קצה מיקרופיפטה אחד של 10 מיקרוליטר עבור כל דגימה. הוסף 10 מיקרוליטר חרוזים לכל צינור אי באמצעות קצה חתוך נקי לכל דגימה. ואז צנטריפוגה עד שהמהירות מגיעה פי 200 מכוח הכבידה.לאחר מכן, השתמש בקצה לא חתוך של 200 מיקרוליטר ואחריו קצה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר כמה שיותר PBS. סמן את שקופיות המיקרוסקופ לזיהוי דגימה והנח אותן על הספסל ליד גוש החום עם הג'ל המחומם. בעזרת מספריים, חותכים את הקצוות מכמה קצות מיקרופיפטה בעלי קשירה נמוכה לכל דגימה.בעזרת מיקרופיפטה המצוידת בקצה חתוך, הוסף ג'ל חם לצינור המכיל איים וחרוזים. מערבבים מיד תוך הימנעות מיצירת בועות כלשהן. מרחו תערובת זו על שקופית היוצרת דיסק ליד קצה השקופית תוך השארת מקום לטבעת הג'ל החיצונית.לאחר מכן, הקש על השקופית בעדינות כמה פעמים כדי ליישב את האיים והחרוזים. הוסף 20 מיקרוליטר ג'ל חם לצינור הדגימה וערבב את הג'ל החדש עם כל האיים והחרוזים שנותרו. מרחו תערובת זו על אותה שקופית המקיפה את הדיסק המקורי.חזור על הפעולה לפי הצורך באמצעות טיפים חדשים שנחתכו מראש עבור כל יישום עד שהדיסק יגיע לגודל ולעובי הרצויים. הקפד להכין כל דיסק בנפרד ולעקוב אחר סדר הדגימה אם אתה מניח מספר דיסקים בכל צד. לאחר מכן, הניחו את המגלשות על משטח ישר של קרח רטוב וכסו אותן.נותנים לשקופיות לנוח 10 דקות או עד שהג'ל מתמצק. לאחר מכן, הסר את השקופיות והקפד לייבש את החלק האחורי של כל אחת מהן. סמן קלטת עיבוד והטמעת רקמות ביופסיה עבור כל דגימה.השתמש בקצה הקהה של סכין גילוח כדי לדחוף בעדינות את הדיסק מכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, דחוף לאט את הדיסק מהשקף והנח את הדיסק עם הצד השטוח כלפי מטה ישירות על הנייר. זה יכול להיות קשה לשמור על הדיסקים המובחנים שלמים בזמן ההחלקה משקופית הזכוכית לנייר.אם מופיע קמט בדיסק, אפשר לו לחזור למצב המקורי, הוסף עוד ג'ל וג'ל מחדש את השקופית. קפל את הנייר סביב הדיסק כדי למנוע תנועה. העבירו את זה לקסטה ואז סגרו את הקסטה.טבלו את הקסטה בכוס מלאה ב-PBS. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת הטמעה מבוססת דיסק ג'ל שונה כדי לייצר ביעילות תשואה גבוהה של איים לכל חתך. המורפולוגיה של איי המכרסמים שלמה יותר באופן ניכר לאחר התאוששות לאחר הבידוד במדיום האי המציג משטח מעוגל חלק וצורה כדורית קומפקטית.העובדה שהמורפולוגיה של האיים האנושיים דומה, בין אם היא מוטמעת ביום ההגעה או לאחר התאוששות לאחר המשלוח בלילה, יכולה לנבוע מכך שהאיים מתאוששים מלחץ הבידוד לפני המשלוח. לשם השוואה, קטעי הפרפין המתקבלים בטכניקת המיקרו שפופרת הישנה, נראים כבעלי שטח חתך רקמה קטן יותר עם פחות איים בכל חתך ועם איים וחרוזים צפופים. כפי שמוצג כאן, טכניקה זו מסוגלת לייצר קטעי איים באיכות גבוהה לצביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית.צביעת אינסולין וגלוקגון מראים את ההרכב המגוון וההטרוגניות של ארכיטקטורת האיים המדגימים הבדלים אדריכליים ידועים בין איי אדם, עכבר וחולדה. תמונות אלה מייצגות גם חלקים סדרתיים של אותם איים. הוכחה כי טכניקה זו מסוגלת להשיג חלקים מרובים מאותם איים.לאחר שליטה, טכניקה זו חוסכת זמן בטכניקת המיקרו-צנטריפוגה. יצירת הדיסק על משטח ישר ולא בצינור מקלה על העברת הדיסק פיזית לקלטת לעיבוד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה של האיים, ניתן ליישם אותה גם על גושי תאים אחרים או רקמות פריכות שקשה לחתוך אותן.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בג'ל בנפח קטן כדי לרכז רקמה באזור קטן וליצור את הדיסק על משטח ישר. כמו כן, קריטי להשתמש בצינורות מיקרו-צנטריפוגות בעלי קשירה נמוכה ובקצות פיפטות כדי לשפר את תפוקת הרקמות. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של האיים לחקור את הרכב סוג התא וההטרוגניות, אינטראקציה בין תאים וויסות גנים באיים מתורבתים שלמים בארכיטקטורה הטבעית שלהם.היכולת ליצור 10 קטעים או יותר המכילים איים רבים מתנאי ניסוי יחיד מאפשרת כימות של תוצאות מרובות על אותו חומר, ומשפרת את יעילות הניסוי. יישום טכניקה זו על דגימות רקמה בשפע מוגבל עשוי להציע יתרונות גם לתחומים אחרים. ייתכן שיהיה צורך לשנות אלמנטים של הליך זה כדי לענות על צרכי המשתמש.יש לייעל את עוצמת הקיבוע ואת החלוקה. ניתן ליצור דיסק עבה או גדול יותר בטכניקה זו. ייתכן שיהיה צורך למקם שלבי עיבוד פשוטים להטמעה ויש לייעל אותם.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור בלוק תאי אגרוז באיכות גבוהה עבור קטעי פרפין של איי לבלב מתורבתים שלמים.

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מדגים הליך לנתיחה לעיבוד הלבלב האנושי לתוך תבניות אחסון מרובים. אוריינטציה אנטומי נשמר לאורך כל האזורים הלבלב כדי לאפשר הגדרת הרכב איון הצפיפות באזור.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H &amp; E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H &amp; E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

כאן, אנו מציגים פסיבים פרוטוקול לסעיפים לבלב אנושי התמונה בתלת מימד (3D) באמצעות אופטימיזציה ניקוי שיטות. כתב יד זה מדגים אלו נהלי סליקה אופטי פסיבי ואחריו מספר immunofluorescence מכתים לזהות את המרכיבים העיקריים של אוטונומי, חושי רשתות עצביות innervating אנושי איונים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הרשת נוירו-סקסיסטית לבלב אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרוסות לבלב אנושיות מתורמי איברים שנפטרו כדי לחקור את תפקוד התאים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. גישה חדשנית זו מאפשרת לחקור איים נורמליים ופגועים מבנית ואת יחסי הגומלין המורכבים בין תאים אנדוקריניים ואקסוקריניים.

יצירת פרוסות רקמת לבלב אנושית לחקר פיזיולוגיה אנדוקרינית ואקסוקרינית של הלבלב

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו שיטת הטבעה חדשנית לאיי הלבלב בשלמותם לחתכי פרפין, המאפשרת הערכה יעילה של תוצאות מרובות תוך שמירה על הארכיטקטורה התלת-ממדית הטבעית. השיטה מייעלת ניצול חומר נדיר ומשפרת משמעותית את תפוקת הניסויים במחקר הסוכרת.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

גלה סרטונים נוספים