ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

פרוטוקול זה מאפשר לנו לפקח על קומפלקסים מיטופליים אנדוגניים ברקמות אנושיות כגון תאי בטא, להקל על מחקר מיטופלי ברקמות מרכזיות הרלוונטיות לתרגום. אחד היתרונות של טכניקה זו היא היכולת שלה לדמיין קומפלקסים מיטופליים חשובים ב vivo ברקמות עם זמינות נדירה או במספרים מדגם קטן. לאחר בידוד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, תרבות ארבע עד שש פעמים 10 כדי שווה ערך האי האנושי השלישי ב 10 מיליליטר של איון הלבלב מלא בינוני לפחות יום אחד ב 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, השתמש במיקרוסקופ אור ניתוח בהגדלה של פי שלושה כדי לספור איונים אנושיים בודדים בתרבות. בחר 40 איונים לכל טיפול או מצב של עניין לתוך 1.5 צינורות מיליליטר של מדיום איון. מסיסים את איי הצנטריפוגה ומבזבזים מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS בתוספת 50 PR619 מיקרומולרי.

להפוך את הצינור ולאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שטיפה שנייה PBS טרי בתוספת מעכב deubiquitinase. לאחר הצנטריפוגה השנייה, לנתק את האיים לתאים בודדים עם 125 microliters של 0.25% טריפסין בתוספת מעכב במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם צינורות עדינים תקופתיים. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס חימם איון הלבלב בינוני בתוספת PR619.

לאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות PBS טרי בתוספת מעכב לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על האיים המנותקים ב-150 מיקרוליטרים של PBS טרי בתוספת מעכב. עבור דבקות וקבוע של איונים בודדים, cytospin פתרון התא על שקופיות מיקרוסקופ טעון חלבי מתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי.

לאחר מכן תקן את התאים המוקומים עם 4% paraformaldehyde ו- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות האיון, שטפו את התאים בשתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר, ואחריהן חסימת כריכה לא ספציפית עם סרום חמור 10% ו-PBS ועוד 0.3% חומר ניקוי למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, coincubate התאים עם נוגדן העכבר העיקרי נגד פפטידאז ספציפי ubiquitin 8, נוגדן ארנב ראשי נגד פגיעה קולטן neuregulin חלבון-1, וסמן ספציפי לזיהוי תא בטא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע את אות אסאי קשירה הקרבה לילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שתי שטיפות חמש דקות ב PBS על נדנדה. הוסיפו נוגדן משני נגד עיזים Cy5 לתסכות רצועות קירבה טריות. לאחר הכביסה השנייה, סמן כל דגימת איון עם 20 מיקרוליטרים של פתרון בדיקה ושחזר את השקופיות עם סרט פלסטיק עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שתי שטיפות חמש דקות חיץ A על נדנדה ואחריו דגירה עם 20 microliters של פתרון קשירה מוכן טרי בתוספת 0.25 יחידות למיקרוליטר של רצועות לכל שקופית עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הרצועה, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ A במשך שתי דקות לכל לשטוף. מכסים כל דגימה עם 20 מיקרוליטר של פתרונות הגברה בתוספת פולימראז עבור דגירה של 100 עד 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

כדי להכין את התאים להדמיה, לשטוף את הדגימות פעמיים במאגר טרי A במשך 10 דקות לשטוף על נדנדה ואחריו לשטוף אחד ב 0.1x חיץ B במשך שתי דקות על הנדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, הר את השקופיות עם טיפה של מדיום הרכבה המכיל DAPI ובזהירות למקם כיסוי על כל מדגם באמצעות אזמל כדי ללחוץ על כל בועות. ואז לאטום את כיסויים עם לק ברור סביב הקצוות.

כדי לדמיין את הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ המסוגל ללכוד מישורי מוקד מרובים ובחר את ההגדלה פי 100. הגדר את גובה מחסנית Z לפרמטרים של כ- 0.45 מיקרומטר ואת הפרמטרים המתאימים של אותות כתם, ניתוב נגדי ותאים חיים. השג לפחות תשע תמונות שונות של מישור מוקד.

כדי להבטיח שאותות הרקע של תמונת הפלואורסצנטיות והאור התועה ימוזערו, עבד את התמונות תוך שימוש באלגוריתם השכן הדו-ממדי הקרוב ביותר באמצעות תוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לבחירה. כדי לכמת את אינטראקציות ההסטה של רצועות הקירבה, פתח את ImageJ ופתח את תמונת ההסטה של הקשירה הקרבה. החל מהתמונה הראשונה במוקד, לחצו על 'תמונה' ובחרו 'התאם' ו'סף'.

התאם את הסף כדי להסיר את כל אות ההקשה על רצועות קירבה שאינן ספציפיות וציין את התאמת הסף כדי לנסות לשמור על האות עקבי לאורך כל הניתוח. לחץ על תהליך ובחר בינארי והפוך לערך בינארי. ודא שהגודל מוגדר כאפס עד אינסוף, המעגליות מוגדרת כאפס לאפס, הצג מוגדר כקווי מתאר וסמן את התיבות הצג תוצאות ונקה תוצאות.

שים לב למספר החלקיקים שנותחו בגיליון אלקטרוני המציין את מיקום המדגם ואת מיקום מחסנית Z. לאחר מכן לחץ על נתח וניתוח חלקיקים כדי למדוד את החלקיקים. כאשר כל ערימות Z בפוקוס עבור המדגם נותחו, שלח את המספר הכולל של חלקיקים עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת את המספר הכולל של אינטראקציות.

הנוגדנים המשמשים בבדיקת הקרבה הם ספציפיים לליגנדים ולא מדגימים חפיפה כלשהי. כפי שנצפה, פרוטוקול הפיזור יעיל מאוד בהשגת תאים בודדים בשדה המיקרוסקופ של התצוגה לניתוח במורד הזרם וכתמים של תאי בטא נשמרים לאחר פגיעה ברצועה הקרבה באזורים האנושיים העיקריים. באמצעות טכניקות הוכח, ניתן לקבוע כי האינטראקציה של חלבון השפלה קולטן neuregulin-1 ו peptidase ספציפי בכל מקום 8 הוא ירד בעקבות חשיפה של 48 שעות פלמיטט, הדגשת ההיתכנות של היתכנות זו להערכת גורמי מיטופי אנדוגני מפתח בעקבות גירויים דיאבטוגניים.

הפיזור היעיל והעדין של איונים אנושיים חיוני להבטחת כימות אוכלוסיות התאים הנכונות במורד הזרם. PLA מאפשרת הערכה של מתחמי מיטופלגיה חשובים בדגימות איון אנושיות המאפשרות ניתוח של דגימות מיטופליות ודגימות של מטופלים אנושיים חשובים ביולוגית שמניע את תחום מחקר הסוכרת קדימה.