Name: ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: חקור את תהליך המיטופאגיה בתאי בטא אנושיים באמצעות שיטת סמיכות הקירבה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח כמותי של מורכבים חלבוניים בדגימות ביולוגיות מוגבלות ומסייע במחקר הסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בתמיכת JDRF (CDA-2016-189 וסרה-2018-539), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK-108921), משפחת Brehm, ומשפחת אנטוני. פרס לפיתוח קריירה JDRF ל-S.A.S. נתמך בחלקו על ידי האקדמיה לסוכרת דנית, אשר נתמכת על ידי קרן נובו Nordisk.

השימוש של האדם תורם דה מזוהה הלבלב האנושי הוא באמצעות הלוח סקירה מוסדית (IRB) פטור ובהתאם למדיניות האוניברסיטה של מישיגן IRB. איונים הלבלב האנושי סופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון/NIDDK של משולב הפצת האיים (IIDP).
1. הכנה לדוגמא של האדם איון
<ol><li>
דיסוציאציה של תא בודד
	<ol>
<li>התרבות בדגימות איון האנושי (4000 – 6000 איון שווי/10 mL מדיה) עבור לפחות 1 יום ב 37 ° c ב הלבלב איון מדיה (PIM (S)) מדיה בתוספת גלוטמין 1 מ"מ (PIM (G)), 100 יחידות/mL antimycotic-אנטיביוטי, 1 מ"מ נתרן פירובט ו 10% העובר עוברי סרום (FBS) או סרום AB אנושי.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ אור לנתיחה בהגדלה של 3x כדי לספור איונים אנושיים בודדים מהתרבות. לאסוף 40 איונים לכל טיפול/מצב של עניין (כגון רעילות msm ליפו, לתוך 1.5 מ ל צינורות במדיה איון.</li>
		<li>האיים צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב 10 ° c כדי משקעים.</li>
		<li>לשטוף דגימות, על ידי היפוך קצר של צינורות בטמפרטורת החדר, פעמיים עם 1 mL פוספט באגירה מלוחים (PBS) המכיל 50 μM PR619 (מעכב דאויקוויאיאז; כדי לשמר אוביקוויטים התלויים אינטראקציות חלבון), עם צנטריפוגה בין כל לשטוף ב 400 x g עבור 1 דקות ב-10 ° c.</li>
		<li>הנתק איים לתוך תאים בודדים עם 125 μL של 0.25% טריפסין המכיל 50 μM PR619 על ידי הדגירה הקדם-שחומם (37 ° c) עבור 3 דקות עם כדורי איון. בעדינות לפזר איונים במהלך הזמן הזה עם ליטוף עדין תקופתי באמצעות 200 μL פיפטה.</li>
		<li>כיבוי טריפסין עם 1 mL מחומם (37 ° צ') PIM (S) מדיה המכילה 50 μM PR619, ואז תאים משקעים על ידי תפרידו ב 400 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות, פעמיים, עם PBS + 50 ΜM PR619.</li>
		<li>בסופו של דבר, השעיית תאים מחדש ב-150 μL PBS המכיל 50 μM PR619.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדבקות וקיבוע תאים בודדים
	<ol>
<li>לאחר השעיה מחדש, לסובב את הפתרון התא על מזוגג, טעונה, שקופיות מיקרוסקופ באמצעות ציטוצנטריפוגה ב 28 x g עבור 10 דקות.</li>
		<li>לאחר cytocentrifugation, לתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי (לראות את הטבלה של חומרים) כדי למזער את אמצעי האחסון נוגדן/משחק לפתרון הדרוש. תקן תאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.</li>
		<li>לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע כתמים/מפלה מיד, או בתוך 24 h. במקרה הצורך, יש לאחסן דגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לצביעת לא יותר מ-48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>
חסימת
	<ol>
<li>שטוף את התאים פעמיים ב-1x PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>תא לחסום פתרון, כדי למנוע כתמים ברקע, עם 10% החמור סרום ב-PBS המכיל 0.3% ניקוי (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת
	<ol>
<li>מודלת תאים עם העכבר הראשי או נוגדנים הארנב נגד USP8 (1:250) ו NRDP1 (1:250) בהתאמה (לראות את הטבלה של חומרים) מדולל מלוחים באגירה פוספט עם אבקת (pbt, ראה לוח חומרים), ב 4 ° c לילה, כדי ל זיהוי מתחם מיטלהגיה איתות באמצעות PLA.</li>
		<li>שיתוף בתאי התאים עם סמן ספציפי עבור זיהוי תא ביתא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע לאות PLA. במקרה זה התאים האלה לדגירה עם PDX1 נגד עז (1:500) ב PBT. מודטה את כל הנוגדנים העיקריים לילה ב 4 ° c, באמצעות הסרט פלסטיק על גבי הפתרון כדי למנוע אידוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. שיטת היטל קירבה
<ol><li>בדיקה וכתמים של משחק הנגד
	<ol>
<li>להכין את הפתרון בדיקה PLA על פי הוראות היצרן, כלומר, לעשות 20 μL של פתרון בדיקה לכל מדגם על ידי הכנת ריכוז סופי של 1:5 פתרון של שניהם נגד העכבר ואנטי ארנב פתרון בדיקה PBT, ו דגירה עבור 20 דקות בחדר טמפרטורה.</li>
		<li>לאחר הדגירה לילה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.</li>
		<li>ממש לפני דגירה עם פתרון בדיקה, להוסיף אנטי עז Cy5 משני בריכוז הסופי של 1:600 לפתרון בדיקה (לזיהוי של אנדוגניים PDX1). הוסף 20 μL פתרון בדיקה לכל תנאי תא, לכסות בעדינות עם הסרט פלסטיק ו דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>צדו
	<ol>
<li>לשטוף את התאים פעמיים, בטמפרטורת החדר, עם מאגר A (לראות את הטבלה של חומרים עבור המתכון) עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.</li>
		<li>הכינו פתרון לחלקים (חלק מריאגנטים האיתור, ראו טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן. בשביל זה, לדלל את המניה (5x) 1:5 ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים מטופלים. מיד לפני הדגירה להוסיף 0.025 U/mL ligase. הוסף 20 פתרון הנוגע לתאי μL לתאים. כיסוי עם הסרט פלסטיק ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>גברה
	<ol>
<li>שטוף את התאים פעמיים בטמפרטורת החדר עם מאגר A עבור 2 דקות כל אחד.</li>
		<li>להפוך פתרון הגברה (חלק של ריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן. לדלל מאגר הגברה (5x) 1:5 ב DEPC מטופלים מים ולשמור בחושך עד השימוש. הוסף דילול 1:80 של פולימראז (חלק מהריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) לפתרון מיד לפני הוספת הפתרון לתאים.</li>
		<li>הוסף 20 μL של פתרון הגברה לתאים. כיסוי עם סרט פלסטיק ומקום בחושך ב 37 ° c עבור בין 1 h 40 דקות עד 2 h עבור אות מקסימלית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה להדמיה
	<ol>
<li>לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר B (לראות את הטבלה של חומרים למתכון) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, על הנדנדה.</li>
		<li>לבסוף, לשטוף את התאים פעם אחת 0.01 x מאגר B, עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.</li>
		<li>מעלה דגימות על ידי הוספת טיפה של מדיה הרכבה המכיל 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ובזהירות הצבת שמיכות מעל דגימות באמצעות להב אזמל ללחוץ על כל בועות שנוצרו. חותם שמיכות באמצעות לק ברור ציפורניים סביב הקצוות.</li>
		<li>דגימות תמונה על מיקרוסקופ מסוגל ללכוד מטוסי מיקוד מרובים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד לייזר, או מיקרוסקופ הפוכה הפוך עם יכולות פירוק, נטילת לפחות 9 מטוס מוקד שונים תמונות.<ol>
<li>לכידת תמונות בהגדלה של 100x, עם גובה של כ-0.45 מ"מ מחסנית z. לכידת PLA ב 550 הריגוש nm, 570 פליטת nm; נגד כתמים ב 650 הריגוש nm, 670 פליטת nm; ו DAPI ב 405 הריגוש nm, 450 פליטת nm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי להבטיח אותות הרקע של התמונה הפלואורסצנטית ואת האור התועה הם ממוזערים עבור ניתוח במורד הזרם של אירועי PLA (במיוחד על מיקרוסקופים שטח), עיבוד תמונות באמצעות אלגוריתם דו-מימדי (השכן הקרוב) דרך מ תוכנה סטנדרטית לעיבוד תמונה של בחירה. הערה: לשימוש האולימפוס CellSens, ניקון להשתמש באלמנטים שקלים, לייקה להשתמש לאס X, Zeiss-זן, התמרה, MATLAB, הויגנס תוכנה, כמו גם תוספים מספר זמין דרך תמונה-J. לצורך ניתוח, יש לנתח את המספר הכולל של אינטראקציות בכל ערימות ה-z באמצעות תוכנת Image-J, ולהבטיח שרק תאים חיוביים של Pdx-1 ינותחו (סעיף 3.5).</li>
	</ol></li>
	<li>קוונפיקציה של אינטראקציות PLA
	<ol>
<li>פתח את יישום התוכנה חינם Image-J ופתח את תמונת ה-PLA. התחל מהתמונה החדה הראשונה בפוקוס PLA.</li>
		<li>לחצו על הכרטיסייה ' תמונה ' ובחרו ' התאם ', ולאחר מכן לסף ( איור 1a). כוונן את הסף כדי להסיר את כל אות ה-PLA שאינו ספציפי, רשום את התאמת הסף ונסה לשמור על עקביות במהלך הניתוח.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה תהליך ובחר בינארי ולאחר מכן הפוך לבינארי ( איור 1b). השתמש בתמונה הבינארית כדי למדוד חלקיקים, על-ידי לחיצה על הכרטיסייה "ניתוח" והקשה על החלקיקים (איור 1c). </li>
		<li>לצורך ניתוח ודא שההגדרות הן כדלקמן: Size = 0 – אינסוף, מעגליות = 0 – 1.0, הצג = קווי מתאר, תיבות סימון עבור תוצאות תצוגה ותוצאות ברורות (איור 1d). לחץ על אישור. רשום לפניך את מספר החלקיקים שנותחו בדוגמה של גיליון אלקטרוני ומיקום מחסנית z.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.5.2 – ה3.5.4 עד לבדיקה של כל ה-z-מיקוד של המדגם. סכם את מספר החלקיקים הכולל עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת מספר כולל של אינטראקציות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+Form+a+Ubiquitin-Dependent+Tripartite+Complex+That+Regulates+beta-Cell+Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+Maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+Susceptibility+Genes+Pdx1+and+Clec16a+Function+in+a+Pathway+Regulating+Mitophagy+in+beta-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells.</a> Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).</li>
<li>Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+Finger+Ubiquitin-Protein+Isopeptide+Ligase+Nrdp1%2FFLRF+Regulates+Parkin+Stability+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).</li>
<li>Durcan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP8+regulates+mitophagy+by+removing+K6-linked+ubiquitin+conjugates+from+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin.</a> The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).</li>
<li>Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+In+situ+Assay+is+a+Powerful+Tool+to+Monitor+Specific+ATG+Protein+Interactions+following+Autophagy+Induction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).</li>
<li>Silva Xavier, D. a, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Human+Pancreatic+Islet+Architecture+and+Composition+by+Laser+Scanning+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feat+of+metabolic+proportions%3A+Pdx1+orchestrates+islet+development+and+function+in+the+maintenance+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).</li>
<li>Poitout, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucolipotoxicity+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).</li>
<li>Pearson, G., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-dependent+mitophagy+complex+maintains+mitochondrial+function+and+insulin+secretion+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells.</a> Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li>
<li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+alpha%2C+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li>
<li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type%E2%80%93specific+expression+changes+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of β cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+major+pancreatic+cell+types+and+long-term+culture-initiating+cells+using+novel+human+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers.</a> Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).</li>
<li>Jayaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+detection+of+viable+human+pancreatic+beta+cells+by+flow+cytometry+using+fluorophores+that+selectively+detect+labile+zinc%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+protein+thiols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols.</a> Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).</li>
<li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+%C3%9F-Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li>
<li>Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+iron+triggers+PINK1%2FParkin-independent+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li>
<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+Zone%3A+Mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. , (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מתארים גישה פשוטה ויעילה לשימוש NRDP1: USP8 PLA ברקמות/תאים של עניין היווצרות מכמת של מכלולי mitophagy במעלה. בעבר אישרו את היווצרות של מורכבות CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy בתאי ביתא הלבלב על ידי כמה מתודולוגיות, כולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים, תא ללא אינטראקציה לימודי, וחוץ גופית, כמו גם תא מבוסס והפגינו כיצד מורכב זה כוננים מורכבים השטף מיטואני מוסדר1,15. לימודי ה-PLA שאנו מדווחים ומתארים כאן מאפשרים תצוגה מהירה, כמותית, ומיוחדת לתא של מסלול mit...

תאים ביתא הלבלב לייצר את האינסולין הנדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז נורמלי, וכישלון שלהם תוצאות בפיתוח של כל צורות הסוכרת. תאי בטא שומרים על קיבולת מיטוכונדריאלי חזקה כדי ליצור את האנרגיה הדרושה לחילוף החומרים של גלוקוז עם שחרור אינסולין. לאחרונה, זה התברר כי התחזוקה של מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי היא בעלת חשיבות מרכזית עבור הפונקציה האופטימלית של תא ביתא1,2,3. על מנת לקיים מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי, תאי בטא להסתמך על מנגנוני בקרת איכות כדי להסיר תפקוד, פגום, או הזדקנות המיטוa4. אנחנו ואחרים הוכיחו בעבר כי תאים ביתא להסתמך על צורה מיוחדת של מחזור מיטוכונדריאלי, הנקרא הוראות מיטוכונדריאלי (או mitophagy), כדי לשמור על איכות מיטוכונדריאלי בקרת מכרסמים והאדם האנושי1, 2,5. למרבה הצער, עם זאת, לא היתה שיטה פשוטה כדי לזהות mitophagy, או באופן מידי הביע רכיבים mitophagy, בתאי בטא הלבלב האנושי.
לאחרונה הראינו כי במעלה הזרם של mitophagy בתאי ביתא מסתמך על היווצרות של מתחם חלבון הכולל את E3 ליגסים CLEC16A ו NRDP1 והוא USP81. NRDP1 ו USP8 הוכחו באופן עצמאי להשפיע mitophagy באמצעות פעולה על מפתח מיאופלגיה מיזם parkin6,7. NRDP1 מטרות PARKIN עבור אוביקווינציה והשפלה כדי לכבות את mitophagy6, ו USP8 במיוחד באופן בלתי מקושר K6-parkin לקדם את הטרנסלוקציה שלה כדי המיטומטר7. שיטת החיבור הצמוד (PLA) הטכנולוגיה היתה מקדמה לאחרונה בתחום של אינטראקציה חלבון ביולוגיה8, המאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות חלבונים אנדוגניים באתרו תאים בודדים, והוא אינו מוגבל על ידי חומר לדוגמה נדירים. מתודולוגיה זו מפתה במיוחד לביולוגיה של האדם/תא ביתא, בשל הספניות של זמינות המדגם, ביחד לצורך הבנת מתחמי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בתוך סוגי תאים הטרוגנית.
ניצול הגישה PLA, אנחנו מסוגלים להתבונן מרכזי מפתח אנדוגניים מתחמי בתאי בטא הלבלב האנושי העיקרי וקווי התאים עצביים, ולהדגים את ההשפעות של סביבה diabetogenic על מסלול מיטואופג'י1. לסיכום, מטרת היסוד של פרוטוקול זה היא לנתח מתחמי חלבון mitophagy ספציפיים ברקמות חסר חומר שופע, או כאשר מחקרים קונבנציונאלי-חלבון האינטראקציה אינם אפשריים.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA 1X</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים אנטיביוטיות-אנטימיקוטיות</td><td></td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בלוק</td> לשימוש <td>ביתי</td><td></td><td>1X PBS, הוסף 10% סרום חמור ו-0.3% חומר ניקוי טריטון X-100.</td></tr><tr><td>חוצץ</td><td>A תוצרת בית</td><td></td><td>להכנת 1 ליטר: מערבבים 8.8 גרם NaCl, 1.2 גרם בסיס Tris, 500ul Tween-20, עם 750 מ"ל ddH20. pH עד 7.5 עם HCl, וממלאים עד 1 ליטר. מסננים ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס. מביאים ל-RT לפני השימוש הניסיוני</td></tr><tr><td>Buffer B</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>להכנת 1 ליטר: מערבבים 5.84 גרם NaCl, 4.24 גרם בסיס Tris, 26 גרם Tris-HCl עם 500 מ"ל ddH20. pH עד 7.5, וממלאים ל-1 ליטר. סנן תמיסת ואחסן 4C. הביאו ל-RT לפני השימוש הניסיוני</td></tr><tr><td>AffiniPure donkey מצומד נגד עזים</td><td>Jackson Labs</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים לזיהוי</td><td>Red Sigma- Aldrich</td><td>DU092008-100RXN</td><td>ערכה המכילה: מלאי תמיסת קשירה (5X), ליגאז, מלאי תמיסת הגברה (5X) ופולימראז.</td></tr><tr><td>DuoLink PLA בדיקה נגד עכבר MINUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092004-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink PLA בדיקה נגד ארנב PLUS</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>DU092002-100RXN</td><td></td></tr><tr><td>סרום</td><td></td><td></td><td></td>בקר עוברי</tr><tr><td>עיזים פוליקלונלי אנטי-PDX1 (שיבוט A17)</td> <td>סנטה קרוז</td><td>SC-14664</td><td>RRID: AB_2162373</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>קו תאי לבלב MIN6</td><td>מתנה מ- D. Stoffers</td><td></td><td>קו תאי אינסולינומה של עכבר, המשמש לבדיקות מבוססות תאים.</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד USP8 של עכבר (שיבוט US872)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB200527</td><td></td></tr><tr><td>Pap-pen</td><td>Research Products International</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>השתמש כדי לאטום נוגדנים ולבדוק תמיסות על התאים שלך כדי למנוע אידוי בעת שימוש בנפחי תמיסה קטנים.</td></tr><tr><td>PBT (תמיסת מלח חוצצת פוספט עם טריטון)</td> <td>תוצרת בית</td><td></td><td>להכנת 50 מ"ל: 43.5 מ"ל LddH2O, 5 מ"ל 10X PBS, 0.5 מ"ל 10X BSA (תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל 10% טריטון X-100 תמיסת ddH20)</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט, 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>PIM(ABS) סרום AB אנושי</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-ABS001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(G) (גלוטמין)</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-G001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PIM(S) מדיה</td><td>Prodo Labs</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>PR619</td><td>Apex Bio</td><td>A812</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade Reagent עם DAPI</td><td>Life Technologies (בדיקות מולקולריות)</td> <td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-FLRF / RNF41 (Nrdp1)</td> <td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-049A</td><td>RRID: AB_2181251</td></tr><tr><td>תאי SH-SY5Y</td><td>מתנה מקו</td><td>תאי נוירובלסטומה אנושית L. Satin, המשמש לבדיקות מבוססות תאים.</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>מים לעבודת RNA (DEPC מים)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP361-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy הוא מסלול חיוני בקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר חיוני עבור התא ביתא איון הלבלב ביואנרגיה כדי דלק מגורה ממריצים אינסולין שחרור. הערכה של mitophagy הוא מאתגר ולעתים קרובות דורש כתבים גנטיים או טכניקות משלימים מרובים לא מנוצל בקלות בדגימות רקמות, כגון איואי הלבלב האנושי העיקרי. כאן אנו להפגין גישה חזקה כדי להמחיש ומכמת היווצרות של מתחמי מפתח אנדוגניים מרכזיים באיים הלבלב האנושי העיקרי. ניצול הקירבה רגישות לסדר שיטת החיבור כדי לזהות אינטראקציה של הרגולטורים mitophagy NRDP1 ו USP8, אנחנו מסוגלים במיוחד לכמת היווצרות מתחמי mitophagy חיוניים באתרו. על-ידי צימוד גישה זו כדי להכתים את גורם התמלול PDX1, אנחנו יכולים לכמת את מתחמי mitophagy, ואת הגורמים שיכולים לפגוע mitophagy, במיוחד בתוך תאי בטא. המתודולוגיה שאנו מתארים מתגבר על הצורך בכמויות גדולות של תמציות הסלולר הנדרשות למחקרים של חלבון-חלבון אחרים, כגון immunoprecipitation (IP) או ספקטרומטר מסה, והוא אידיאלי לדגימות של איון אנושי יקרות בדרך כלל לא זמינים בכמויות מספיקות עבור גישות אלה. יתרה מזאת, מתודולוגיה זו בדקה את הצורך בטכניקות מיון זרימה כדי לטהר את תאי הבטא מאוכלוסיית איון הטרוגנית עבור יישומי החלבון במורד הזרם. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול רב ערך עבור ויזואליזציה של mitophagy תואם מאוד לשימוש באוכלוסיות תאים הטרוגנית ומוגבלת.

ערכנו ניסויים הראשונית קו הלבלב MIN6 ביתא תא ואת SH-SY5Y ונוירובלסטומה חוט התא SH-SY5Y, כדי למטב ולאשר הן ספציפיות של הנוגדנים ואת אינטראקציות החלבון דמיינו. MIN6 תאים היו מצופים שמיכות ב 30,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 48 h, SH-SY5Y תאים היו מצופים שמיכות ב 15,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 24 h. לאחר מכן הפרוטוקול PLA התחיל לעיל, החל משלב 1.2.3. כדי להבטיח את הספציפיות של אותות PLA, אנו הראשון ביצע גישה זו בנוכחות של (אני) אין נוגדן ראשי (איור 2A, <strong cla...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לפקח על קומפלקסים מיטופליים אנדוגניים ברקמות אנושיות כגון תאי בטא, להקל על מחקר מיטופלי ברקמות מרכזיות הרלוונטיות לתרגום. אחד היתרונות של טכניקה זו היא היכולת שלה לדמיין קומפלקסים מיטופליים חשובים ב vivo ברקמות עם זמינות נדירה או במספרים מדגם קטן. לאחר בידוד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, תרבות ארבע עד שש פעמים 10 כדי שווה ערך האי האנושי השלישי ב 10 מיליליטר של איון הלבלב מלא בינוני לפחות יום אחד ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, השתמש במיקרוסקופ אור ניתוח בהגדלה של פי שלושה כדי לספור איונים אנושיים בודדים בתרבות. בחר 40 איונים לכל טיפול או מצב של עניין לתוך 1.5 צינורות מיליליטר של מדיום איון. מסיסים את איי הצנטריפוגה ומבזבזים מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS בתוספת 50 PR619 מיקרומולרי.להפוך את הצינור ולאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שטיפה שנייה PBS טרי בתוספת מעכב deubiquitinase. לאחר הצנטריפוגה השנייה, לנתק את האיים לתאים בודדים עם 125 microliters של 0.25% טריפסין בתוספת מעכב במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם צינורות עדינים תקופתיים. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס חימם איון הלבלב בינוני בתוספת PR619.לאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות PBS טרי בתוספת מעכב לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על האיים המנותקים ב-150 מיקרוליטרים של PBS טרי בתוספת מעכב. עבור דבקות וקבוע של איונים בודדים, cytospin פתרון התא על שקופיות מיקרוסקופ טעון חלבי מתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי.לאחר מכן תקן את התאים המוקומים עם 4% paraformaldehyde ו- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות האיון, שטפו את התאים בשתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר, ואחריהן חסימת כריכה לא ספציפית עם סרום חמור 10% ו-PBS ועוד 0.3% חומר ניקוי למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, coincubate התאים עם נוגדן העכבר העיקרי נגד פפטידאז ספציפי ubiquitin 8, נוגדן ארנב ראשי נגד פגיעה קולטן neuregulin חלבון-1, וסמן ספציפי לזיהוי תא בטא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע את אות אסאי קשירה הקרבה לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שתי שטיפות חמש דקות ב PBS על נדנדה. הוסיפו נוגדן משני נגד עיזים Cy5 לתסכות רצועות קירבה טריות. לאחר הכביסה השנייה, סמן כל דגימת איון עם 20 מיקרוליטרים של פתרון בדיקה ושחזר את השקופיות עם סרט פלסטיק עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שתי שטיפות חמש דקות חיץ A על נדנדה ואחריו דגירה עם 20 microliters של פתרון קשירה מוכן טרי בתוספת 0.25 יחידות למיקרוליטר של רצועות לכל שקופית עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הרצועה, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ A במשך שתי דקות לכל לשטוף. מכסים כל דגימה עם 20 מיקרוליטר של פתרונות הגברה בתוספת פולימראז עבור דגירה של 100 עד 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.כדי להכין את התאים להדמיה, לשטוף את הדגימות פעמיים במאגר טרי A במשך 10 דקות לשטוף על נדנדה ואחריו לשטוף אחד ב 0.1x חיץ B במשך שתי דקות על הנדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, הר את השקופיות עם טיפה של מדיום הרכבה המכיל DAPI ובזהירות למקם כיסוי על כל מדגם באמצעות אזמל כדי ללחוץ על כל בועות. ואז לאטום את כיסויים עם לק ברור סביב הקצוות.כדי לדמיין את הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ המסוגל ללכוד מישורי מוקד מרובים ובחר את ההגדלה פי 100. הגדר את גובה מחסנית Z לפרמטרים של כ- 0.45 מיקרומטר ואת הפרמטרים המתאימים של אותות כתם, ניתוב נגדי ותאים חיים. השג לפחות תשע תמונות שונות של מישור מוקד.כדי להבטיח שאותות הרקע של תמונת הפלואורסצנטיות והאור התועה ימוזערו, עבד את התמונות תוך שימוש באלגוריתם השכן הדו-ממדי הקרוב ביותר באמצעות תוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לבחירה. כדי לכמת את אינטראקציות ההסטה של רצועות הקירבה, פתח את ImageJ ופתח את תמונת ההסטה של הקשירה הקרבה. החל מהתמונה הראשונה במוקד, לחצו על 'תמונה' ובחרו 'התאם' ו'סף'.התאם את הסף כדי להסיר את כל אות ההקשה על רצועות קירבה שאינן ספציפיות וציין את התאמת הסף כדי לנסות לשמור על האות עקבי לאורך כל הניתוח. לחץ על תהליך ובחר בינארי והפוך לערך בינארי. ודא שהגודל מוגדר כאפס עד אינסוף, המעגליות מוגדרת כאפס לאפס, הצג מוגדר כקווי מתאר וסמן את התיבות הצג תוצאות ונקה תוצאות.שים לב למספר החלקיקים שנותחו בגיליון אלקטרוני המציין את מיקום המדגם ואת מיקום מחסנית Z. לאחר מכן לחץ על נתח וניתוח חלקיקים כדי למדוד את החלקיקים. כאשר כל ערימות Z בפוקוס עבור המדגם נותחו, שלח את המספר הכולל של חלקיקים עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת את המספר הכולל של אינטראקציות.הנוגדנים המשמשים בבדיקת הקרבה הם ספציפיים לליגנדים ולא מדגימים חפיפה כלשהי. כפי שנצפה, פרוטוקול הפיזור יעיל מאוד בהשגת תאים בודדים בשדה המיקרוסקופ של התצוגה לניתוח במורד הזרם וכתמים של תאי בטא נשמרים לאחר פגיעה ברצועה הקרבה באזורים האנושיים העיקריים. באמצעות טכניקות הוכח, ניתן לקבוע כי האינטראקציה של חלבון השפלה קולטן neuregulin-1 ו peptidase ספציפי בכל מקום 8 הוא ירד בעקבות חשיפה של 48 שעות פלמיטט, הדגשת ההיתכנות של היתכנות זו להערכת גורמי מיטופי אנדוגני מפתח בעקבות גירויים דיאבטוגניים.הפיזור היעיל והעדין של איונים אנושיים חיוני להבטחת כימות אוכלוסיות התאים הנכונות במורד הזרם. PLA מאפשרת הערכה של מתחמי מיטופלגיה חשובים בדגימות איון אנושיות המאפשרות ניתוח של דגימות מיטופליות ודגימות של מטופלים אנושיים חשובים ביולוגית שמניע את תחום מחקר הסוכרת קדימה.

visualization-endogenous-mitophagy-complexes-situ-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.

גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

טיפול באי לבלב מבודד ומדידת אפופטוזיס

חקור את תהליך המיטופאגיה בתאי בטא אנושיים באמצעות שיטת סמיכות הקירבה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח כמותי של מורכבים חלבוניים בדגימות ביולוגיות מוגבלות ומסייע במחקר הסוכרת.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

גלה סרטונים נוספים