Name: אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: למד לבודד מיקרוגלייה עיקרית ממוח עכברים בטוהר גבוה באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות וסינון מגנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר מהיר של תפקידי תאי החיסון במערכת העצבים ללא זמן תרבית ממושך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2707149/">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report).</a> Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).</li>
<li>Saliba, E., Henrot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators+and+Neonatal+Brain+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Neonate%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage.</a> Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).</li>
<li>Uwe-Karsten, H., Helmut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387(2007).</li>
<li>Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+M2+microglia%3A+the+good%2C+the+bad%2C+and+the+inflamed%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed.</a> Journal of neuroinflammation. 11, 98(2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Guohua, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophage+polarization+dynamics+in+white+matter+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864(2013).</li>
<li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debris+clearance+by+microglia%3A+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2009).</li>
<li>Veronique, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1211(2013).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophage+polarization+dynamics+reveal+novel+mechanism+of+injury+expansion+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 43 (11), 3063(2012).</li>
<li>Kigerl, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+effects+causing+either+neurotoxicity+or+regeneration+in+the+injured+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435(2009).</li>
<li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+%CE%B17+nicotinic+acetylcholine+receptors+drive+a+phospholipase+C%2FIP3+pathway+and+modulate+the+cell+activation+toward+a+neuroprotective+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role.</a> Journal of neuroscience research. 83, (2006).</li>
<li>Bedi, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+multipotent+adult+progenitor+cell+therapy+attenuates+activated+microglial%2Fmacrophage+response+and+improves+spatial+learning+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury.</a> Stem cells translational medicine. 2, (2013).</li>
<li>Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+triterpenoid+CDDO-methyl+ester+modulates+microglial+activities%2C+inhibits+TNF+production%2C+and+provides+dopaminergic+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection.</a> Journal of neuroinflammation. 5, 14(2008).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3418565/">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Applications+of+Magnetic+Cell+Sorting+to+Analyze+Cell-Type+Specific+Gene+and+Protein+Expression+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System.</a> PLOS ONE. 11 (2), e0150290(2016).</li>
<li>Leaw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+rescue+cell+death+via+immunomodulation+of+microglia+in+a+mouse+model+of+perinatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury.</a> Stem cell research & therapy. 8 (1), 46(2017).</li>
<li>Moujalled, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutations+causing+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+altered+expression+of+RNA-binding+protein+hnRNP+K+and+affect+the+Nrf2+antioxidant+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway.</a> Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרוגלייה יש את היכולת להיות גם פרו - דלקתי, ששונו על-ידי סביבת גירויים. מחקרים קודמים הראו שמודולציה של הפעלת מיקרוגלייה יכול להתייעץ neuroprotection. היכולת שלהם לספק הגנה את הנוירונים ותיקון פציעה מחייבת מחקר נוסף כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של תאים מורכבים אלה. לכן, בידוד של טוהר גבוהה מיקרוגלייה העיקרי הוא שיטת חשוב ושימושי. זוהי שיטה מהירה יחסית להשגת מיקרוגלייה הראשי מאוד טהור מוכן ניסויים במבחנה בתוך 2 ימי.
ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של ראשי מיקרוגלייה מ...

נזק רכשה במהלך תקופת הלידה דלקת, מחוסר חמצן-ischaemia, דימום יכול להיות מערך של sequelae לטווח ארוך. הפתופיזיולוגיה המורכבת של פגיעה מוחית הלידה הוא משוער לערב דלקת ו איסכמיה עם מוות עצביים עצב שהתפתח1. התגובה החיסונית מולדת ממלא תפקיד חשוב בהמפל של האירועים שהובילו פגיעה2.
מיקרוגלייה, תושב תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), הם המגיבים הראשונים פציעה3. מיקרוגלייה הם סוגי תאים פלסטיק עם היכולת להיות תלויי מגן או רעיל, על הסביבה4. הם מעורבים כימוטקסיס, phagocytosis, מצגת אנטיגן וייצור של ציטוקינים ו4,של מינים חמצן תגובתי5. מיקרוגלייה senescent כל הזמן סקר את הסביבה, מופעלים על ידי הנוכחות של חומר זר או מזיקים4. הפעלת מוביל לתגובה הפרו דלקתיים, קריטי ב CNS הגנה4. מיקרוגלייה פנוטיפ "פרו-דלקתיים" אלה M1 מעורבים בעיקר אנטיגן מצגת ומוות של פתוגנים4. למרות תפקיד מכריע התגובה דלקתית neuroprotection, דלקת בלתי מבוקרת או ממושך יכול להיות מזיקים להוביל נזקים עצביים4. עם זאת, כאשר הם נחשפים לגירויים סביבתיים מסוימים, מיקרוגלייה יכול התערוכה של פנוטיפ אנטי דלקתיות. מיקרוגלייה M2 pro-תיקוני אלה יש תפקיד קריטי פצע ריפוי ותיקון6, שחרור מגוון של ציטוקינים ותיקון עוד מגשרים מסיסים downregulate דלקת, להגדיל phagocytosis ולקדם4, 7. התפקידים של מיקרוגלייה הינם מגוונים וכוללים בידול אוליגודנדרוציטים נהיגה במהלך re-myelination8, הגנה על נוירונים במהלך דלדול חמצן, גלוקוז מודלים קו9 וקידום תוצר neurite ב פגיעה בחוט השדרה מודלים10.
המחקר של אלה גלייה מייצג היבט חשוב להבנה, מניפולציה התגובה neuroinflammation. הפרוטוקול המתואר מאפשר חקירה מתמשכת לתוך הפוטנציאל הטיפולי של אפנון מיקרוגלייה בהפרעות neuroinflammatory.
מודולציה של הפעלת microglial לקראת תפקיד neuroprotective נצפתה במגוון של מצבים11,12,13. לכן, שיפור ההבנה הנוכחית נוספת ללמוד אפנון של הפעלת microglial הוא קריטי, הדרישה לשימוש של מודלים שונים כולל חוץ גופית בתוך ויוו. מחקרים במבחנה מייצגים כלי חשוב בשל שלהם גדול יותר, נמוך יותר עלות ויעילות היכולת לחקור אוכלוסיה תא מבודד.
ישנם מגוון של פרוטוקולים המתוארים בספרות על בידודו של מיקרוגלייה מן המוח מאתר, האתגר לייצר ביעילות מדגם תשואה גבוהה עם יכולת הקיום טוב, טוהר גבוהה. השיטות הנפוצות של בידוד של ראשי מיקרוגלייה הן על ידי הפרדה מגנטית ורעדתי ממושך של תרבויות גליה מעורבת. מניסיון אישי, התברר שהיה שם מידה רבה של פסולת הסלולר אשר נחסמת העמודה מגנטי. כך, הפרוטוקול הבא היה מנוצל, אשר משלבת צעד צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הראשוני ולאחריו הפרדה מגנטית CD11b. הפרוטוקול המתואר להלן מוטבה כדי לייצר מדגם הטהור מאד בכמות מספקת. . זה יתרון בשל טוהר גבוהה שלה ואת תקופת זמן קצר – אחד יכול לבצע מבחני תוך יומיים ללא צורך תרבות במשך 2-3 שבועות. באופן פוטנציאלי יכול להיות מותאם פרוטוקול זה בידודו של ראשי האסטרוציטים מאתר.

<table><tbody><tr><td>DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X)</td> <td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI דרגה II מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>פפאין מלטקס פפאיה, תמיסה חוצצת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125-100mg</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (1X)</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10X)</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD11b ערכת בחירה חיובית</td><td>StemCell Technologies</td><td>18770</td><td>גרסת</td></tr> <tr><td>מגנט EasySepמגנט EasySep</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>20144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered Salt</td><td>Salt Gibco</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%) (10X)</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16 / CD32 (עכבר BD Fc Block &trade;)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל מבחנה PP עם בהירות גבוהה עם תחתית עגולה, עם מכסה הצמד,</td><td>352063</td><td></td><td>קורנינג</td> סטרילי</tr><tr><td>175 ס"מ ו-2; בקבוק תרבית תאי צוואר זוויתי עם מכסה אוורור</td><td>קורנינג</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מבית Escherichia coli O127:B8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5024</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מיקרו-פלטות מטופלות TC בגודל 96 בארות, שקופות, פוליסטירן, קורנינג תחתון עגול</td><td></td><td>CLS3799</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (אבקה, 95%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>טריטון-X</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-IBA1</td><td>Wako</td><td>01919741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>FACS נוגדנים</חזק</td><td>><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td></td></tr><tr><td>V450,חולדה,נגד עכבר,CD45,30-F11,RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-CY5.5 CD11b&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>ZombieNIR</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific P35361</td><td></td></tr><tr><td>Annexin.V_FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-060</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת יודיד פרופודיום</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב במוח, הם המגיבים הראשונים כדי דלקת או פגיעה במערכת העצבים המרכזית. מחקר שנערך לאחרונה גילה מיקרוגלייה דינאמיות, מסוגל בהנחה פנוטיפים הן הפרו דלקתיים ואנטי דלקתיות. M1 (פרו-דלקתיים) והן M2 (pro-תיקוני) פנוטיפים לשחק תפקיד חשוב neuroinflammatory מצבים כגון פגיעה מוחית הלידה, נספח שונות פונקציות בתגובה לגירויים סביבתיים מסוימים. מודולציה של הפעלת microglial נרשמה להיוועץ neuroprotection ובכך רומז מיקרוגלייה ייתכן הפוטנציאל הטיפולי של פגיעה מוחית. עם זאת, מחקר נוסף נדרש כדי להבין טוב יותר את התפקיד של מיקרוגלייה במחלה, פרוטוקול זה מאפשר את זה. הפרוטוקול המתואר להלן משלב תהליך צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות להפחתת פסולת הסלולר, עם הפרדה מגנטית, הפקת מדגם מאוד טהור של תאים microglial העיקרי שיכול לשמש לניסויים בתוך חוץ גופית , בלי הצורך 2-3 שבועות culturing. בנוסף, השלבים אפיון תשואות פונקציונלי נתונים אודות מיקרוגלייה, מחקרים לשיפור ההבנה שלנו של קיטוב וסיוע הטרמה של תאים אלה, אשר יש השלכות חזק בתחום של רפואה רגנרטיבית.

באמצעות השיטות המתוארות כאן, אוכלוסיות טהור של מיקרוגלייה ניתן לבודד והוא יכול להיות מוכן אפיון באמצעות במבחנה וניתוח FACS. כדי להתחיל עם, עד 18 בעלי חיים יכולים לשמש לכל cull, עם התשואה הצפויה של-450,000-600,000 microglial תאים. זה חיוני לאשר תחילה את הטוהר של תאים מבודדים, לעשות ניתוח FACS בוצע על ידי צביעת עבור שני הסמנים CD45 ו- CD11b. זיהוי של מיקרוגלייה יכול להוכיח בעייתי, כמו סמנים רבים לידי מיקרוגלייה מתבטאים גם על ידי מקרופאגים, ושימוש של שני סמנים אלה מאפשר כימות מדויק ...

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה ממכרסמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואינפורמציה כגון זיהוי התכונות האימונומודולטוריות של תאי גזע במיקרוגליה או ביצוע בדיקות סינון תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בידוד של אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה ללא צורך בזמן ממושך בתרבית.כדי להתחיל בהליך זה, הכנס את קצות המספריים דרך הפתח בתעלת עמוד השדרה ובצע חתכים רוחביים לתעלת האוזן. לאחר מכן, החלק בעדינות את הרקמה לכיוון הבמה כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, בצע חתך לאורך התפר הסגיטלי לכיוון הברגמה.לאחר מכן, הכנס את קצה המספריים לתוך הברגמה ובצע חתכים לרוחב. לאחר מכן, קלפו בעדינות את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. בעזרת מלקחיים מעוקלים מוציאים אותו ומעבירים למיכל סטרילי של חמישה מיליליטר.שטפו אותו פעמיים עד שלוש עם חמישה מיליליטר של חומר כביסה קר כקרח בכל שטיפה כדי להסיר את הדם. במכסה מנוע למינארי לזרימת אוויר, הניחו את תכולת המיכל של חמישה מיליליטר בצלחת פטרי קטנה המונחת על קרח. בעזרת להב אזמל סטרילי או מספריים סטריליים, הסר את המוח הקטן ואת נורת הריח.לאחר מכן, בצע חתך קו אמצע כדי להפריד בין שתי ההמיספרות. לאחר מכן, זהה את שכבת קרום המוח כשכבה דקה מאוד של תאים עם גוון אדום על פני המוח עם כלי דם גלויים. מקלפים בזהירות את שכבת קרום המוח בעזרת מלקחיים עדינים תוך הקפדה לא לפגוע בקליפת המוח.אם שכבת קרום המוח נשברת, המשך לקלף את השברים הקרועים עד להסרה מלאה. לאחר מכן, העבירו את חצאי הכדור לצלחת פטרי קטנה חדשה על קרח ומלאו אותה בחומרי כביסה. קוצצים את המוח לחתיכות קטנות בעזרת להב אזמל סטרילי.לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר פפאין ו -150 מיקרוליטר DNase1 למדיה ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, יש לשלש את הרקמה באמצעות פיפטה P1000. אם חתיכות הרקמה גדולות מכדי להיכנס לפיפטה, שקול להשתמש במספריים סטריליות כדי להרחיב את קצה הפיפטה.במהלך תהליך זה, הקפד לא להכניס בועות למדיה מכיוון שהדבר עלול להפחית את כדאיות התאים. במכסה מנוע זרימה למינרית, הכינו צינור חרוטי בנפח 50 מיליליטר עם מסננת תאים של 100 מיקרומטר. יוצקים את מדיום העיכול וחתיכות המוח על המסננת.דחפו את חלקי המוח באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי של שלושה מיליליטר בתנועת שחיקה עד שלא נראית יותר רקמה. שטפו ברציפות את המסנן עם אמצעי הכביסה לאורך כל תהליך זה. זה ישטוף את כל התאים הכלואים במסננת.לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב -500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכן את ה-Percoll האיזוטוני על ידי הוספת יחס של תשע לאחד של בינוני שיפוע צפיפות ל-HBSS סטרילי פי 10. הכן שיפועים כ-30% SIP ב-DMEM ו-70% SIP ב-1-X HBSS.לדוגמא, להכנת 10 מיליליטר של 30% SIP, הוסף שלושה מיליליטר SIP לשבעה מיליליטר DMEM. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט מהצינור החרוטי ותלו מחדש את כדור התא עם שמונה מיליליטר של 30% SIP ב-DMEM. העבירו את הנפח המלא לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר.לאחר מכן, הניחו את תמיסת ה-SIP של 70% על ידי מילוי פיפטת העברה ב-70% SIP ודחפו בזהירות דרך פיפטת ההעברה לתחתית הצינור החרוטי. לאחר שהקצה קרוב לתחתית, דחף בעדינות את התוכן דרך פיפטת ההעברה. לאחר מכן, צנטריפוגה את שכבות ה-SIP כולל התאים ב-650 G עם אפס בלם ותאוצה ארבע למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.יש להניח את שכבת הפרקול של 70% בזהירות רבה. שיבוש בממשק זה יכול להשפיע קשות על לכידת המיקרוגליה בשכבת התא ולהפחית מאוד את התפוקות. לאחר מכן, שאפו ארבעה מיליליטר של המדיה עם פסולת סלולרית מהחלק העליון של הצינור כדי להקל על הסרת תאים חד-גרעיניים בשלב הבא.לאחר מכן, הורד בזהירות את קצה הפיפטה לכיוון הממשק ובודד את התאים החד-גרעיניים מממשק תווך השיפוע בצפיפות 30/70. אסוף כשלושה מיליליטר מהממשק המעונן והעביר אותו לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את התערובת בתשעה מיליליטר של HBSS כדי לסייע בהסרת מדיום שיפוע הצפיפות.צנטריפוגה, ממשק תווך שיפוע הצפיפות המדולל המכיל את התאים החד-גרעיניים ב-500 G למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו אותו מחדש עם מיליליטר אחד של מצע גידול. לאחר מכן, צבעו את התאים שהושעו מחדש בטריפן כחול ובצעו ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.בשלב זה, צנטריפוגה את התאים החד-גרעיניים שנאספו ב-300 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את מצע הגידול מכיוון שהדבר יפריע לבידוד המגנטי. באמצעות אותה ספירת תאים שהושגה קודם לכן, השעו מחדש פעם אחת 10 לשמונת התאים הגרעיניים למיליליטר ב-PBS המכילים 2% FBS ו-EDTA מילי-מולרי אחד בטווח נפח של 0.1 עד 2.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף את הנפח המלא של תאים גרעיניים ב-PBS לצינור פוליסטירן עגול טרי של חמישה מיליליטר.לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב תיוג CD11b PE לכל מיליליטר אחד של דגימה. דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור. לאחר מכן, הוסף 70 מיקרוליטר קוקטייל בחירה לכל מיליליטר דגימה.דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור. לאחר מכן, מערבבים את החלקיקים המגנטיים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה יותר מחמש פעמים. הוסף לדגימה 50 מיקרוליטר למיליליטר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות מוגן מפני אור.אם הנפח הכולל של תערובת התאים הוא פחות מ-2.5 מיליליטר, מלאו עד לנפח זה PBS המכיל 2% FBS ו-EDTA מילי-מולרי אחד וערבבו על ידי פיפטינג עדין פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הכניסו את הצינור למגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בתנועה רציפה אחת, הפוך לחלוטין את המגנט המכיל את הצינור למשך שתיים עד שלוש שניות כדי לשפוך את הסופרנטנט.החזר את המגנט למצב זקוף והסר את הצינור מהמגנט. לאחר מכן, שטפו את התאים הנותרים מהעמודה על ידי חזרה על ההליכים. השעו מחדש את התאים במצע גידול רצוי.שטפו את הצד של כלי האיסוף כדי לאסוף תאים מצידי הצינור ולמקסם את התשואות. כפי שניתן לראות באיור זה, המיקרוגליה הראשונית המבודדת שומרת על גוף התא הכדורי שלה ועל המבנה המסועף המובהק שלה. להלן עלילות העובדות המייצגות של המיקרוגליה המבודדת.הצביעה המשולבת של אנקסין V ופרופידיום יודיד מאפשרת סיווג של תאים אפופטוטיים, נמקיים או חיים לאחר גירוי עם LPS. מדיום מותנה hAEC הפחית משמעותית את אפופטוזיס המיקרוגליה ביחס לבקרות המרמזות על סוג של הגנה על סוג תאים זה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לנקוט משנה זהירות בשכבות הפרקול מכיוון שלשלב זה תהיה ההשפעה הגדולה ביותר על התשואות. בעקבות טכניקה זו, ניתן להשתמש בהליכים אחרים כגון בדיקת התפקוד הפגוציטי, או תרבית משותפת עם נוירונים, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התכונות האימונומודולטוריות של סוג התא שבחרת במיקרוגליה ראשונית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום לגלות כיצד ניתן לווסת מיקרוגליה ראשונית בפגיעה מוחית סביב הלידה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של פגיעה מוחית סביב הלידה מכיוון שהיא מאפשרת אפיון של סוג תא חיסוני ראשוני הידוע כמעורב במידע עצבי המוביל לתפקוד מוטורי וקוגניטיבי לקוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפרעות מוטוריות כגון שיתוק מוחין, ניתן ליישם אותה גם בהפרעות אחרות שבהן מיקרוגליה ממלאת תפקיד בפתוגנזה כמו מחלת אלצהיימר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשרצינו טכניקה לאפיון מהיר של מיקרוגליה שעוקפת שינויים אפיגנטיים פוטנציאליים לאחר זמן ממושך בתרבית.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה לאפיון במורד הזרם.

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

למד לבודד מיקרוגלייה עיקרית ממוח עכברים בטוהר גבוה באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות וסינון מגנטי. שיטה זו מאפשרת מחקר מהיר של תפקידי תאי החיסון במערכת העצבים ללא זמן תרבית ממושך.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

גלה סרטונים נוספים