אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
February 16th, 2018
פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה ממכרסמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואינפורמציה כגון זיהוי התכונות האימונומודולטוריות של תאי גזע במיקרוגליה או ביצוע בדיקות סינון תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בידוד של אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה ללא צורך בזמן ממושך בתרבית.
כדי להתחיל בהליך זה, הכנס את קצות המספריים דרך הפתח בתעלת עמוד השדרה ובצע חתכים רוחביים לתעלת האוזן. לאחר מכן, החלק בעדינות את הרקמה לכיוון הבמה כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, בצע חתך לאורך התפר הסגיטלי לכיוון הברגמה.
לאחר מכן, הכנס את קצה המספריים לתוך הברגמה ובצע חתכים לרוחב. לאחר מכן, קלפו בעדינות את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. בעזרת מלקחיים מעוקלים מוציאים אותו ומעבירים למיכל סטרילי של חמישה מיליליטר.
שטפו אותו פעמיים עד שלוש עם חמישה מיליליטר של חומר כביסה קר כקרח בכל שטיפה כדי להסיר את הדם. במכסה מנוע למינארי לזרימת אוויר, הניחו את תכולת המיכל של חמישה מיליליטר בצלחת פטרי קטנה המונחת על קרח. בעזרת להב אזמל סטרילי או מספריים סטריליים, הסר את המוח הקטן ואת נורת הריח.
לאחר מכן, בצע חתך קו אמצע כדי להפריד בין שתי ההמיספרות. לאחר מכן, זהה את שכבת קרום המוח כשכבה דקה מאוד של תאים עם גוון אדום על פני המוח עם כלי דם גלויים. מקלפים בזהירות את שכבת קרום המוח בעזרת מלקחיים עדינים תוך הקפדה לא לפגוע בקליפת המוח.
אם שכבת קרום המוח נשברת, המשך לקלף את השברים הקרועים עד להסרה מלאה. לאחר מכן, העבירו את חצאי הכדור לצלחת פטרי קטנה חדשה על קרח ומלאו אותה בחומרי כביסה. קוצצים את המוח לחתיכות קטנות בעזרת להב אזמל סטרילי.
לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר פפאין ו -150 מיקרוליטר DNase1 למדיה ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, יש לשלש את הרקמה באמצעות פיפטה P1000. אם חתיכות הרקמה גדולות מכדי להיכנס לפיפטה, שקול להשתמש במספריים סטריליות כדי להרחיב את קצה הפיפטה.
במהלך תהליך זה, הקפד לא להכניס בועות למדיה מכיוון שהדבר עלול להפחית את כדאיות התאים. במכסה מנוע זרימה למינרית, הכינו צינור חרוטי בנפח 50 מיליליטר עם מסננת תאים של 100 מיקרומטר. יוצקים את מדיום העיכול וחתיכות המוח על המסננת.
דחפו את חלקי המוח באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי של שלושה מיליליטר בתנועת שחיקה עד שלא נראית יותר רקמה. שטפו ברציפות את המסנן עם אמצעי הכביסה לאורך כל תהליך זה. זה ישטוף את כל התאים הכלואים במסננת.
לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב -500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכן את ה-Percoll האיזוטוני על ידי הוספת יחס של תשע לאחד של בינוני שיפוע צפיפות ל-HBSS סטרילי פי 10. הכן שיפועים כ-30% SIP ב-DMEM ו-70% SIP ב-1-X HBSS.
לדוגמא, להכנת 10 מיליליטר של 30% SIP, הוסף שלושה מיליליטר SIP לשבעה מיליליטר DMEM. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט מהצינור החרוטי ותלו מחדש את כדור התא עם שמונה מיליליטר של 30% SIP ב-DMEM. העבירו את הנפח המלא לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר.
לאחר מכן, הניחו את תמיסת ה-SIP של 70% על ידי מילוי פיפטת העברה ב-70% SIP ודחפו בזהירות דרך פיפטת ההעברה לתחתית הצינור החרוטי. לאחר שהקצה קרוב לתחתית, דחף בעדינות את התוכן דרך פיפטת ההעברה. לאחר מכן, צנטריפוגה את שכבות ה-SIP כולל התאים ב-650 G עם אפס בלם ותאוצה ארבע למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
יש להניח את שכבת הפרקול של 70% בזהירות רבה. שיבוש בממשק זה יכול להשפיע קשות על לכידת המיקרוגליה בשכבת התא ולהפחית מאוד את התפוקות. לאחר מכן, שאפו ארבעה מיליליטר של המדיה עם פסולת סלולרית מהחלק העליון של הצינור כדי להקל על הסרת תאים חד-גרעיניים בשלב הבא.
לאחר מכן, הורד בזהירות את קצה הפיפטה לכיוון הממשק ובודד את התאים החד-גרעיניים מממשק תווך השיפוע בצפיפות 30/70. אסוף כשלושה מיליליטר מהממשק המעונן והעביר אותו לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את התערובת בתשעה מיליליטר של HBSS כדי לסייע בהסרת מדיום שיפוע הצפיפות.
צנטריפוגה, ממשק תווך שיפוע הצפיפות המדולל המכיל את התאים החד-גרעיניים ב-500 G למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו אותו מחדש עם מיליליטר אחד של מצע גידול. לאחר מכן, צבעו את התאים שהושעו מחדש בטריפן כחול ובצעו ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.
בשלב זה, צנטריפוגה את התאים החד-גרעיניים שנאספו ב-300 G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את מצע הגידול מכיוון שהדבר יפריע לבידוד המגנטי. באמצעות אותה ספירת תאים שהושגה קודם לכן, השעו מחדש פעם אחת 10 לשמונת התאים הגרעיניים למיליליטר ב-PBS המכילים 2% FBS ו-EDTA מילי-מולרי אחד בטווח נפח של 0.1 עד 2.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף את הנפח המלא של תאים גרעיניים ב-PBS לצינור פוליסטירן עגול טרי של חמישה מיליליטר.
לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב תיוג CD11b PE לכל מיליליטר אחד של דגימה. דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור. לאחר מכן, הוסף 70 מיקרוליטר קוקטייל בחירה לכל מיליליטר דגימה.
דגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות מוגן מפני אור. לאחר מכן, מערבבים את החלקיקים המגנטיים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה יותר מחמש פעמים. הוסף לדגימה 50 מיקרוליטר למיליליטר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות מוגן מפני אור.
אם הנפח הכולל של תערובת התאים הוא פחות מ-2.5 מיליליטר, מלאו עד לנפח זה PBS המכיל 2% FBS ו-EDTA מילי-מולרי אחד וערבבו על ידי פיפטינג עדין פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הכניסו את הצינור למגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בתנועה רציפה אחת, הפוך לחלוטין את המגנט המכיל את הצינור למשך שתיים עד שלוש שניות כדי לשפוך את הסופרנטנט.
החזר את המגנט למצב זקוף והסר את הצינור מהמגנט. לאחר מכן, שטפו את התאים הנותרים מהעמודה על ידי חזרה על ההליכים. השעו מחדש את התאים במצע גידול רצוי.
שטפו את הצד של כלי האיסוף כדי לאסוף תאים מצידי הצינור ולמקסם את התשואות. כפי שניתן לראות באיור זה, המיקרוגליה הראשונית המבודדת שומרת על גוף התא הכדורי שלה ועל המבנה המסועף המובהק שלה. להלן עלילות העובדות המייצגות של המיקרוגליה המבודדת.
הצביעה המשולבת של אנקסין V ופרופידיום יודיד מאפשרת סיווג של תאים אפופטוטיים, נמקיים או חיים לאחר גירוי עם LPS. מדיום מותנה hAEC הפחית משמעותית את אפופטוזיס המיקרוגליה ביחס לבקרות המרמזות על סוג של הגנה על סוג תאים זה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות אם היא מבוצעת כהלכה.
בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לנקוט משנה זהירות בשכבות הפרקול מכיוון שלשלב זה תהיה ההשפעה הגדולה ביותר על התשואות. בעקבות טכניקה זו, ניתן להשתמש בהליכים אחרים כגון בדיקת התפקוד הפגוציטי, או תרבית משותפת עם נוירונים, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי התכונות האימונומודולטוריות של סוג התא שבחרת במיקרוגליה ראשונית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום לגלות כיצד ניתן לווסת מיקרוגליה ראשונית בפגיעה מוחית סביב הלידה.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של פגיעה מוחית סביב הלידה מכיוון שהיא מאפשרת אפיון של סוג תא חיסוני ראשוני הידוע כמעורב במידע עצבי המוביל לתפקוד מוטורי וקוגניטיבי לקוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפרעות מוטוריות כגון שיתוק מוחין, ניתן ליישם אותה גם בהפרעות אחרות שבהן מיקרוגליה ממלאת תפקיד בפתוגנזה כמו מחלת אלצהיימר. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשרצינו טכניקה לאפיון מהיר של מיקרוגליה שעוקפת שינויים אפיגנטיים פוטנציאליים לאחר זמן ממושך בתרבית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה לאפיון במורד הזרם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד מיקרוגליה ראשונית ממוחות עכבר, אשר משפר את הבנתנו של מצבים נוירולוגיים. השיטה משלבת צנטריפוגת צפיפות מדורגת והפרדה מגנטית כדי להשיג דגימות מיקרוגליה בטוהר גבוה ביעילות. מתוארים גם שלבי מפתח לאופיון התא.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאים
- אימונולוגיה
רקע
- למיקרוגליה יש תפקידים קריטיים במערכת העצבים והבידוד שלהם חיוני לחקר תפקידיהם.
- פרוטוקול זה עוזר לענות על שאלות חשובות לגבי התנהגות המיקרוגליה והאינטראקציות שלהם עם סוגי תאים אחרים.
- מיקרוגליה בטוהר גבוה הם חיוניים לתוצאות ניסיוניות מדויקות במחקר נוירולוגי.
- הפרוטוקול ממזער את הצורך בזמני תרבות ממושכים, ומקל על השימוש המיידי בתאים מבודדים טריים.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול חזק לבידוד תאי מיקרוגליה טהורים ממוחות מכרסמים.
- לשפר את הבנת התפקיד של המיקרוגליה בדלקת עצבית והפרעות נוירולוגיות אחרות.
- לאפשר יישומים נוספים כגון בדיקת תרופות וחקר אימונומודולציה.
שיטות ששימשו
- בידוד רקמת מוח ex vivo ואחריו עיכול מכני ואנזימטי.
- המודל הביולוגי מורכב ממוחות עכבר לבידוד מיקרוגליה.
- השיטות כוללות צנטריפוגת צפיפות מדורגת והפרדה מגנטית.
- שלבי מפתח כוללים טיפול זהיר ברקמה ותנאי דגירה ספציפיים כדי להבטיח חיות תאים גבוהה.
- הושם דגש על טכניקות דיוק גבוה לבידוד ואפיון תאים לאורך הפרוטוקול.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב בהצלחה אוכלוסייה בטוהר גבוה של מיקרוגליה מוכנה לניתוח.
- ניתן להשתמש במיקרוגליה מבודדת עבור מספר בדיקות, המספקים תובנות לגבי מאפייניהם הפונקציונליים ותגובותיהם.
- השיטה מאפשרת גישה מהירה לתאים מבודדים טריים, חיונית לצרכים ניסיוניים מיידיים.
- חסינות הפרוטוקול הודגשה, ומבטיחה תוצאות חוזרות ואמינות ברחבי ניסויים שונים.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר לחוקרים לבודד בקלות תאי מיקרוגליה, ובכך מאפשר הבנה עמוקה יותר של תפקידם בבריאות ובמחלות.
- הטכניקות המתוארות קובעות בסיס לחקר נוסף של תהליכים דלקתיים נוירולוגיים וטיפולים קשורים.
- התובנות המתקבלות מהשיטה הזו יכולות לקדם את הידע לגבי תפקודי המיקרוגליה והשלכותיהם במחקר נוירולוגי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
