גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק גישה דו-שלבית לחקר השלבים המוקדמים והמאוחרים של אורגנוגנזה על ידי שילוב מניפולציה חוץ גופית של רקמות עובריות עם טכניקות השתלת ביציות באמצעות מודל העופות. בשיטה זו מבודדים את הטריטוריה העוברית המהווה את בסיס האיברים הפוטנציאליים וגדלים במערכת אורגנוטיפית למשך 48 שעות. על ידי חיקוי התפתחות תקינה, גישה חוץ גופית זו מאפשרת גישה נוחה לטריטוריות עובריות ללא צורך בסמנים מולקולריים ספציפיים ומאפשרת מניפולציה ניסויית של שלבי התפתחות מוקדמים ביצירת איברים המסתמכים על שינויים מרחביים דינמיים ביותר ואינטראקציות רקמות מורכבות.

לאחר מכן מושתלות רקמות מתורבתות על הממברנה הכוריואלנטואית של עובר תרנגולת. הממברנה הכוריואלנטואית מתנהגת כספקית כלי דם של חומרים מזינים ומאפשרת חילופי גזים לרקמות המושתלות ומאפשרת את התפתחותה בביצה. שלב זה מתאים במיוחד לחקר שלבים מאוחרים של אורגנוגנזה שכן ניתן להשיג איברים שנוצרו במלואם לאחר 10 ימים של התפתחות ביצית.

בנוסף, ניתן לתת חומרים פרמקולוגיים לאורך התפתחות ביצית במבחנה ובביציות, מה שמאפשר אפנון של מסלולי איתות באופן ספציפי לשלב ההתפתחותי. בסופו של דבר ניתן לאסוף את הרקמות המתפתחות בכל חלון זמן כדי להעריך את התקדמות האורגנוגנזה ולנתח אותן לביטוי גנים ותכונות מורפולוגיות. על ידי מעקב אחר היווצרות איברים מחוץ לעובר העופות, שיטה זו יכולה לעזור להבהיר שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון זיהוי האותות המעורבים בשלבים שונים של היווצרות איברים.

הליך ניסיוני זה יודגם על ידי חקר האורגנוגנזה של בלוטת התימוס ובלוטות יותרת התריס. אצל ציפורים, האפיתל של איברים אלה נובע מפרימורדיום משותף אנדודרמלי של כיסי הלוע השלישי והרביעי ומופיעים כתחומים נפרדים סביב היום העוברי הרביעי בשליו וארבע/חמישה בתרנגולת. ככל שההתפתחות מתקדמת, היסודות של האיבר הופכים לאינדיבידואליים ונפרדים מהלוע.

מאוחר יותר בהתפתחות, האפיתל התימי מיושב על ידי תאי אב המטופויאטיים. השיטה המוצגת כאן מתחילה בבידוד הטריטוריה העוברית של השליו המכילה את הטריטוריה המשוערת של איברים אלה, כלומר אזור הלוע המכיל את הקשתות השלישית והרביעית ביום העוברי השלישי. ביצי שליו מופרות הודגרו כאשר תא האוויר פונה כלפי מעלה במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס באינקובטור לח.

כדי להתחיל, הסר את ביצי השליו מהחממה. בצע הליכי מניפולציה של ביציות בתנאים סטריליים באמצעות מכסה זרימה למינרי אופקי ומכשירים וחומרים מעוקרים. מכינים קערת פיירקס גדולה מלאה ב- PBS קר.

בעזרת מספריים מעוקלים פתחו את ביצת השליו על ידי הקשה על הקליפה וחיתוך פתח עגול בצד הנגדי של תא האוויר. שופכים בזהירות את העובר לתבשיל. החזיקו את העובר בתוך מלקחיים דקים ובעזרת המספריים המעוקלים חתכו את קרום הוויטלין המקיף את העול.

חותכים מסביב וחיצונית להיקף הכלים העובריים הנוספים בתנועה מתמשכת. מעבירים את העובר לקערה קטנה עם PBS קר. לאחר מכן השתמש ברחפן כדי להעביר את העובר לצלחת פטרי פיירקס עם בסיס שחור המכיל PBS קר.

תחת מיקרוסקופ סטריאו, החזק את העובר לתחתית הצלחת בעזרת סיכות חרקים דקות. מניחים ארבע סיכות היוצרות צורה מרובעת באזור העוברי הנוסף. בעזרת מלקחיים הסר את הממברנות העובריות הנוספות של האזור הצפלי והניח שם סיכה חמישית.

כעת העובר ממוקם נכון והשלפוחית האוטית, צינור הלב וקשתות הלוע הראשונה, השנייה והשלישית נראות. התחל לנתח את אזור העניין שהוא אזור קשת הלוע השלישי והרביעי באמצעות מספריים לעיניים של וקר. בצע חתך לאורך ובמקביל לציר העובר בין אזור הסומיטים והצינור העצבי וקשתות הלוע.

לאחר מכן הסר את צינור הלב הממוקם בגחון על ידי חיתוך. שמור את המספריים באותו מיקום, סובב את צלחת הפטרי כדי למקם מחדש את העובר בהתאם לכיוון החיתוך. לסיום, חתכו בין קשת הלוע השנייה והשלישית ומתחת לקשת הלוע הרביעית.

שאפו את הרקמות המבודדות והעבירו אותן לצלחת זכוכית מלאה ב-PBS קר באמצעות פיפטת פלסטיק סטרילית. שמור אותו על קרח במהלך הכנת הבדיקה במבחנה. ממלאים באר אחת מצלחת שש בארות עם 5 מ"ל מדיום תרבית ומניחים על הבאר תוספת קרום פוליקרבונט.

מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, העבירו את האקספלנט על ידי החלקה עדינה בעזרת מרית ומלקחיים מצלחת הזכוכית למשטח הממברנה. לחלופין, ניתן לגדל צמחים במסנני ממברנה צפים. להליך זה הכינו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר עם 5 מ"ל מדיום תרבות.

השתמש במלקחיים כדי לצוף את מסנן הממברנה תוך שמירה על משטח יבש במגע עם אוויר. כמו קודם, העבירו את האקספלנט מכלי הזכוכית למשטח הממברנה על ידי החלקה עדינה. יש למקם את האקספלנטים כשהצד הגחוני כלפי מעלה והצד הגבי במגע עם הממברנה.

הוסף עד שמונה צמחים לכל מסנן ממברנה. מניחים בזהירות את צלחת שש הבארות ואת צלחת הפטרי המכילה את הצמחים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני. לאחר תקופת דגירה של 48 שעות, הוציאו את הצלחת וצלחת הפטרי מהחממה.

כדי לאסוף את האקספלנטים המתורבתים מצלחת שש הבארות הוסף PBS בטמפרטורת החדר לתוספת הממברנה. נתק את הצמחים המתורבתים מהממברנה על ידי שטיפה נמרצת באמצעות פיפטה מפלסטיק סטרילית. בעזרת מרית ומלקחיים העבירו את הצמחים המתורבתים לצלחת זכוכית מלאה ב-PBS בטמפרטורת החדר.

באופן דומה אוספים את האקספלנטים המתורבתים ממסנן הממברנה הצף. במקרה זה, העבירו את פילטר הממברנה בעזרת מלקחיים לצלחת פטרי חדשה מלאה ב- PBS בטמפרטורת החדר. נתק את האקספלנטים ממסנן הממברנה על ידי פיפטינג נמרץ.

שחרר את מסנן הממברנה נטול השתלים לאחר אישור שלא נשארים מחוברים אליו. בעזרת מרית ומלקחיים העבירו בזהירות את הצמחים ל-1 מ"ל של ריאגנט בידוד RNA כולל לביצוע מחקרי ביטוי גנים. לחלופין ניתן לגדל צמחים מתורבתים בביצית כדי להתחרות ביצירת איברים.

ראשית הכינו את הממברנה הכוריואלנטואית. לשם כך מוציאים מהחממה את ביצי התרנגולת עם שמונה ימי התפתחות. הביצים הודגרו כשתא האוויר פונה כלפי מעלה באינקובטור לח ב-38 מעלות צלזיוס.

מכסים את הקצה הבוטה של הביצה בסרט פלסטיק שקוף כדי למנוע נפילת חתיכות קליפה לתא האוויר. הקש על הקליפה וחתוך פתח עגול בביצה בעזרת מספריים מעוקלים. תא האוויר אמור להיות גלוי.

הסר לאט את הקרום הלבן של תא האוויר בעזרת מלקחיים. לאחר מכן הממברנה הכוריואלנטואית נראית ונגישה להשתלת רקמה חוץ רחמית. אין להשתמש ב-PBS כדי להרטיב את הממברנה הכוריואלנטואית לפני או אחרי ההשתלה מכיוון ש-PBS מקדם החלקה ומיקום לא נכון של האקספלנטים.

התחל בביצוע נגעים קטנים בכלי הדם הקטנים יותר של הממברנה. לצורך הליך זה, השתמש במיקרואזמל במחזיק. במקרה של דימום עודף מהפצע יש להסיר את הדם בנימים באמצעות קצה פיפטת פסטר.

העבירו את האקספלנט לאזור הפצוע של הממברנה בעזרת מרית ומלקחיים. חותכים פיסת נייר פילטר בגודל מעט גבוה יותר מהאקספלנט ומניחים אותה על גבי האקספלנט. נייר הסינון מסייע במעקב אחר מיקום האקספלנט לאחר התפתחותו בקרום הכוריואלנטואי.

במידת הצורך, נייר הסינון מאפשר גם אספקת תרופות יומית לאקספלנט במהלך התפתחות הביצית. אטמו את חלון הביצה עם סרט פלסטיק שקוף וזהו אותו בעזרת עיפרון פחם. סרט הפלסטיק מגן על העובר מפני התייבשות בתקופת הדגירה.

דגרו את הביצה המניפולטיבית באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס. לאחר 10 ימי דגירה, אספו את הביצה ומשכו בזהירות את סרט הפלסטיק. חותכים את הממברנה הכוריואלנטואית סביב אזור המסנן בעזרת מספריים מעוקלים ומעבירים את האקספלנט עם נייר פילטר לקערת פיירקס קטנה מלאה ב-PBS קר.

בעזרת מלקחיים העבירו את הצמח לצלחת של 100 מילימטר עם בסיס שחור מלא ב- PBS. הסר בעדינות את נייר הסינון ואת עודפי הממברנה באמצעות מספריים ומלקחיים לעיניים של וקר. בעזרת הרחפן העבירו את השתלים לתמיסה מקבעת והעריכו את היווצרות האיברים בקטעי פרפין על ידי היסטולוגיה אימונוכימיה קונבנציונלית.

כאן מתואר תכנון הניסוי ששימש לחקר השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס ובלוטת התריס. כדוגמה, ביטוי הגנים הידועים כמעורבים בהתפתחות אזור קשת הלוע הוערך במהלך ההתפתחות הנורמלית על ידי PCR כמותי בזמן אמת. תעתיקים של שלושת הגנים Tbx1, Six1 ו-Bmp4 זוהו ברקמות שבודדו לאחרונה ולאחר 48 שעות של תרבית.

כדי לחקור את התפקידים של מסלולי איתות Notch ו-Hedgehog, נוספו מעכבים פרמקולוגיים למדיום התרבית במהלך התפתחות במבחנה. רמות הביטוי של שלושת הגנים הופחתו משמעותית באזור קשת הלוע השלישי והרביעי שגדל במשך 48 שעות בנוכחות מעכב Notch בהשוואה לתנאים מבוקרים. לעומת זאת, רק תעתיקי Bmp4 הופחתו באופן משמעותי ברקמות מתורבתות, כאשר איתות הקיפוד נחסם.

כדי לחקור את השלבים המאוחרים של בלוטת התימוס והאורגנוגנזה של בלוטת התריס, הרקמות המתורבתות הושתלו על קרום כוריואלנטואי ואפשרו להכפיל את עצמן למשך עשרה ימים נוספים. ניתוח מורפולוגי של איברים בוצע על ידי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית. כמה תוצאות מייצגות הן הבאות:שתלים הראו תימוס כימרי שנוצר במלואו עם תאי אפיתל תימיים חיוביים ל-QCPN שמקורם בשליו ותאי לימפה ממקור תורם עוף.

בנוסף, אפיתל תימי ופארטיפואיד הראו מאפיינים מורפולוגיים תקינים לאחר זיהוי ציטוקרטין. אפיתל תימוס הציג ארכיטקטורה רשתית ואילו תאים פרנכימליים של בלוטת התריס היו בצורת כדור מסודרים באשכולות ומוקפים בנימים רבים. לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בגישה הדו-שלבית של התפתחות במבחנה ובהתפתחות ביצית באמצעות מודל העופות כדי לחקור את תפקידם של מסלולי האיתות המעורבים בשלבים השונים של היווצרות איברים.