אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

שיטה זו מותאמת בהצלחה לסיווג חולות סרטן השד לקבוצות טיפוליות ידועות ולא ידועות. הרגישות הגבוהה של בדיקה זו מזהה דגימות הטרוגניות שניתן לחקור עוד באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר. היתרון העיקרי של בדיקת המולטיפלקס המבוססת על RNA הוא יכולת השחזור של תוצאות באמצעות חומר ארכיוני משובץ פרפין קבוע בהמטוקסילין ופורמלין מוכתם באוזין המאפשר יציאות ברזולוציה גבוהה ואימות סמנים ביולוגיים.

הכן את הרקמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל את הדיסקציה, הגדר את גבולות ההחלקה וכיול את תנועת ה-stage של המיקרוסקופ. כעת סרוק את שקופיות הממברנה המוכתמת באמצעות המטרה 4X.

בחר והקיף את אזורי היעד למיקרו-דיסקציה בשקופית הממברנה. עקוב אחר השטח הכולל. דרושים לפחות 42 מילימטרים רבועים לניתוח RNA הולם במורד הזרם.

לאחר מכן התחל את חיתוך הלייזר בפרמטרים שהוגדרו. לאחר מכן, השתמש במנגנון הרמת המכסה כדי לאחזר את החלק המנותח והנח את הקטע על מכסה המפזר של צינור מסומן המחובר לנספח מכני. אם החלק המנותח אינו מאוחזר על המכסה, חזור על החיתוך של אזור היעד.

דיוק המיקרודיסקציה הוא שלב קריטי ויש לוודא תמיד שהאזור המיקרו-מנותח הקיים על הכובע עולה בקנה אחד עם התמונה המסומנת והסרוקה. אספו כמה קטעי רקמה שתרצו, כל אחד בצינור נפרד, ולאחר מכן המשיכו בניקוי דגימות הרקמה. עבור הליזה, יש למרוח 2.4 מיקרוליטר של תמיסה הומוגניזציה לפני מילימטר מרובע של שטח הרקמה בכל דגימה, ולאחר מכן מערבולת את הדגימות למשך 10 שניות במהירות המרבית.

לאחר מכן, סובב את הדגימות למשך חמש שניות במשקל של 2, 500 גרם. לאחר מכן העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מיליליטר במידת הצורך, והניחו בבלוק חימום רועד בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. לנער אותם ב-600 סל"ד למשך 12 עד 18 שעות.

ואז צנטריפוגה את הליזטים בחום של 21, 000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אסוף בזהירות את הסופרנטנט השקוף לתוך שפופרת חדשה עם תווית. הימנע מהעברת שברי רקמות.

ניתן לאחסן את הסופרנטנטים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת כל הריאגנטים לבדיקה מבוססת הכלאה, טען עד 90 בארות של צלחת הפרדה מגנטית של 96 בארות עם רקמה הומוגנית של 25 מיקרוליטר. טען 25 מיקרוליטר של דגימות בקרה לשלוש בארות ייעודיות וטען תמיסת הומוגניזציה של 25 מיקרוליטר לשלוש בארות כחסר.

לאחר מכן אטמו את לוחית ההפרדה המגנטית באמצעות אטם לחץ פלסטיק שקוף והניחו את הצלחת בחממה של 54 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 22 שעות עם ניעור. למחרת, הרכיבו וננעלו את הצלחת על מכונת כביסה מגנטית כף יד, ולאחר מכן הסירו את אטם הלחץ והמתינו דקה אחת עד שהחרוזים המגנטיים יתייצבו. עכשיו בצע שטיפה.

מסננים את הצלחת מעל כיור ומשתמשים בנייר טישו כדי לייבש אותה בעדינות, ואז טענו את כל הבארות ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X והמתינו 15 שניות. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי להשלים את שלב הכביסה. לאחר הסרת הכביסה האחרונה, טען מחדש את הבארות ב -50 מיקרוליטר של המגיב המקדים, ואז אטום את הצלחת עם אוטם צלחת אלומיניום ונער את הצלחת ב 800 סל"ד למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן המשיכו לנער את הצלחת בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר השלמת זה, בצע שלב כביסה נוסף. לאחר מכן, טען מחדש את הבארות ב -50 מיקרוליטר של מגיב המגבר, אטום את הצלחת בחותם צלחת אלומיניום, וחזור על דגירה של דקה אחת בטמפרטורת החדר ואחריה שעה ב -50 מעלות צלזיוס, ואחריה שלב כביסה נוסף.

כעת מערבל את בדיקת התווית למשך 10 שניות במהירות מקסימלית ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של בדיקת תווית לכל באר. לאחר מכן אטמו מחדש את הצלחת וחזרו על הדגירה המטלטלת כמו קודם, ואחריה שלב כביסה נוסף. לאחר מכן העמיסו את הבארות ב-50 מיקרוליטר של פיקורית'ין סטרפטווידין מעורבב טרי, ולאחר מכן בצעו דגירה מטלטלת בטמפרטורת החדר ב-600 סל"ד, ולאחר מכן שלב שטיפה באמצעות מאגר שטיפה של סטרפטווידין.

לאחר השלמת שלב הכביסה, טען כל באר ב-100 מיקרוליטר של מאגר כביסה סטרפטווידין ואטום את הצלחת בחותם צלחת אלומיניום, ולאחר מכן נער את הצלחת ב-800 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. במהלך שלב הדגירה האחרון, הפעל את מנתח החרוזים המגנטיים וודא שהמכשיר מכויל ובוצעו פרוטוקולי אימות. בתוכנה, הוסף ניתוח חדש על-ידי בחירה באפשרות צור אצווה באמצעות פרוטוקול קיים מהכרטיסייה אצוות.

לאחר מכן, בפריסת הצלחת, ציין את הבארות כלא ידועות או ריקות וספק תווית עבור כל אחת מהן בלוח הדוגמה. כעת הסר את אטם האלומיניום מלוחית התגובה, הוצא את מגש טוען הצלחות וטען את הצלחת לתוך המנתח. לאחר מכן, לחץ על Retract ולאחר מכן הפעל אצווה כדי להפעיל את המנתח.

לאחר הקריאה, הוצא את הצלחת ונקה את מנתח החרוזים המגנטיים לפי המלצת היצרן. לניתוח, עבור אל הכרטיסיה תוצאות אצווה. בחר את קובץ הניתוח המתאים והשתמש באפשרות לייצא אותו כקובץ csv, ולאחר מכן צור ממוצעים וציונים גולמיים באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים.

ודא שהפקדים מציגים את האותות הצפויים. נרמל את הנתונים הגולמיים לדוגמה ונתח את התפלגות הנתונים באמצעות פלטפורמת מדעי נתונים או באמצעות אלגוריתמים מוגדרים לביצוע ניתוח רכיבים עיקרי. הביצועים של קורא חרוזי המולטיפלקס והבדיקה הם קריטיים והפעלת דילולים סדרתיים של דגימות בקרה מבוארות היטב לפני דגימות מטופלים יקרות ערך מבטיחה תוצאות נכונות.

עבור תכונות, בחר את תת-הקבוצה של נתוני גנים מנורמלים ומשתנה נומינלי כגון תת-סוג סרטן השד. החל אלגוריתם סיווג מאומן ומאומת כדי לאפיין דגימות לא ידועות. השיטה המתוארת יושמה למדידה בו-זמנית של 40 תעתיקים בחומר FFPE מוכתם ב-H&E, מנותח במיקרו-דיסציה.

באמצעות שיטה זו ניתן להראות אפיון מדויק של מצב הקולטן והביטוי הדיפרנציאלי של הסמן המזנכימלי FN1 בעת השוואת הגידול ורקמת הבקרה התואמת בתת-הסוגים השונים של הקולטנים החיוביים והשליליים. ניתן לאפיין הטרוגניות בתוך גידולים בשיטה זו. גידול חיובי ל-ER מציג ביטוי דיפרנציאלי מרחבי של FN1 באזורים המראים מורפולוגיה מובהקת של הגידול ופעילות מיטוטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד גנים מרובים ישירות מליזטים של רקמות לאחר הכלאה של RNA מטרה לחרוזים, הגברת אותות וכימות. רגישות לבדיקה מאפשרת שימוש בחומר מיקרו-מנותח בלייזר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכייל את הציוד לפני כל בדיקה ולקבוע את טווח הרגישות באמצעות חומר בקרת איכות לפני הפעלת דגימות מטופלים יקרות.

זרימת העבודה של הבדיקה ניתנת להתאמה בקלות למעבדות קליניות. ניתן לבצע פרופיל RNA של עד 90 דגימות תוך 12 שעות במשך יומיים. מדידת מצב הקולטן לסרטן השד במעבדה פתולוגית גוזלת זמן ודורשת פתולוגים מנוסים.

שימוש בבדיקה דיגיטלית זו המבוססת על חרוזי מולטיפלקס מכמת את ביטוי ה-RNA במדויק. ניתוח סמנים ביולוגיים חלקיים בביופסיות באבחנה ראשונית הוא הצגה של הגידול. שימוש במתודולוגיה זו עם פאנל סמנים ביולוגיים רחב יותר וגם שימוש בקטעים שלמים מזהה דגימות הטרוגניות.

פיתוח בדיקות באמצעות מתודולוגיה זו הוא רב תכליתי ודורש קלט נמוך של מדגם. המדגם כולל דגימות קליניות מבוארות החשובות לאימות סמנים ביולוגיים וגם ביופסיות נוזליות החשובות למעקב אחר מטופלים ואבחון מוקדם.