מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג שיטת צביעת כסף אופטימלית לזיהוי מהיר, קל ובעלות נמוכה של סמני SSR בג'לים פוליאקרילאמיד שאינם דנטורים. הגנוטיפ המהיר של סמני SSR יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הגנטי והיישום כגון ניתוח מגוון גנטי ובחירה בעזרת סמנים בתוכניות רבייה מולקולרית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא קלה לביצוע, לוקחת פחות זמן ומשתמשת בפחות ריאגנטים כימיים מאשר פרוטוקולים אחרים לזיהוי סמני SSR.

שיטה זו מונעת את הקיבוע, העצירה ומספר שלבי כביסה המצויים בפרוטוקולים קונבנציונליים. ודורש רק את שני השלבים העיקריים של הפריה והתפתחות. ניתן להפיק תמונות ברורות באמצעות פרוטוקול זה ללא רעשי רקע לזיהוי חד משמעי של דפוסי פס SSR.

ניתן לסנן כ-800 דגימות DNA ביום באמצעות טכניקה זו והיא שימשה בהצלחה במחקר טבק וכרוב סיני פורח. לאחר הכנת מוצרי PCR ותמיסות ג'ל לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש בחומר ניקוי במי ברז כדי לשטוף סט אחד של צלחות זכוכית ומרווחים ולאחר מכן שטיפה מלאה במים מזוקקים. הנח את הצלחות במתלה לייבוש צלחת לייבוש באוויר.

מפזרים מיליליטר אחד של תמיסת Bind-silane על המשטח הפנימי של צלחת זכוכית מלבנית ומייבשים אותה במשך חמש דקות. לאחר מכן פזרו מיליליטר אחד של Repel-silane על המשטח הפנימי של צלחת זכוכית מחורצת בעזרת ספוגית, והשתמשו בנייר טישו כדי לנגב עודפי תמיסה לפני שתאפשרו לצלחת להתייבש באוויר למשך חמש דקות. הרכיבו את לוחות הזכוכית עם מרווחים עם הצלחת המחורצת מעל.

והשתמש במלחציים יציקה כדי להדק את שני צידי המכלול. לאחר מכן, שפכו כמות מתאימה של תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד 6% ללא דנטורציה לכוס לסט הצלחת. הוסף 20 מיקרוליטר TEMED ו -200 מיקרוליטר טרי 20% APS וערבב בעדינות.

שפכו מיד ובזהירות את התמיסה ללוחות הזכוכית המורכבים לאורך קצה הצלחת המחורצת, וממלאים את החלל כמעט עד למעלה. והכנס את המסרק. לאחר מכן הוסיפו נפח קטן של תמיסת ג'ל מעל המסרק והניחו לג'ל להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

כאשר הג'ל מפולימר במלואו, הסר את היציקה clamps ומקם את הצלחת שנקבעה ביחידת מיכל האלקטרופורזה כשהצלחת המחורצת פונה לכיוון מאגר החיץ העליון. השתמש בגדול clamps כדי לחבר את ערכת הצלחת ליחידת המיכל. יוצקים ליטר אחד של מאגר 0.5 X TBE לכל אחד מהתאים העליונים והתחתונים.

לאחר מכן הסר את המסרק והשתמש בפיפטה או במזרק מלא במאגר כדי לשטוף היטב את כל הבארות. כדי להפעיל את ג'ל הפוליאקרילאמיד, טען כמיקרוליטר אחד של מוצר PCR לכל באר. כמו כן, טען סולם DNA משני קצותיו.

לאחר מכן תקן את מכסה הבטיחות לתא החיץ העליון. חבר את המוליכים לאספקת החשמל, תוך התאמת הצבע המקודד אדום לאדום, ושחור לשחור. הפעל את הג'ל במתח קבוע של 110 וולט עד שהצבע מגיע למצב מוגדר.

בדרך כלל, למשך כ-70 דקות. לאחר האלקטרופורזה, פתח את השסתום ונקז את המאגר מהתא העליון לכוס גדולה. נתק את הצד clamps והסר את הצלחת מהמכשיר.

לאחר מכן השתמש במרית כדי להפריד בזהירות את לוחית הזכוכית המחורצת לאורך צד אחד וודא שהג'ל נשאר מחובר לצלחת הזכוכית השנייה המצופה ב-Bind-silane. לאחר מכן, הכינו ליטר אחד של תמיסת הספגה טרייה על ידי המסת 1.5 גרם חנקת כסף בליטר מים מזוקקים. לאחר מכן הכינו ליטר אחד של תמיסת פיתוח טרייה על ידי המסת 10 גרם נתרן הידרוקסיד ב -900 מיליליטר מים מזוקקים.

הוסף מיליליטר אחד של 37% פורמלדהיד והשתמש במים מזוקקים כדי להתאים לנפח סופי של ליטר אחד. עם מים מזוקקים בשפע, שטפו בזהירות את הג'ל וצלחת הזכוכית כדי להסיר את מאגר האלקטרופורזה. לאחר מכן הניחו את הצלחת כשהג'ל פונה כלפי מעלה לתוך מגש פלסטיק וטבלו את הג'ל בליטר אחד של תמיסת הספגה.

נענע בעדינות את המגש על שייקר ב-60 סל"ד למשך שלוש עד ארבע דקות. העבירו את הצלחת מתמיסת ההספגה למגש אחר. לאחר מכן השתמש במים מזוקקים בשפע כדי לשטוף את תמיסת ההספגה הנותרת מעל פני הצלחת והג'ל פעמיים למשך שלוש עד חמש שניות כל אחת.

שלב שטיפת הג'ל לאחר הספגה הוא קריטי. כביסה לא מספקת הסיבה שלי הסרה לא מלאה של תמיסת הספגה. והתוצאה היא רקע כהה.

מניחים את המקום כשהג'ל פונה כלפי מעלה למגש אחר. טבלו את הצלחת בליטר אחד של תמיסת פיתוח ולאחר מכן נערו בעדינות את המגש ב-50 סל"ד למשך כשלוש דקות. עקוב אחר הופעתם של שברי DNA ועצור את ההתפתחות כאשר נצפה היחס הגבוה ביותר בין האות של שברי DNA לרעש הרקע.

זמן ההתפתחות המתאים הוא צעד מפתח נוסף. פיתוח יתר יכול לגרום לרקע חום כהה עם תמונה בעלת ניגודיות נמוכה של שברי DNA. שטפו את הצלחת והג'ל במים מזוקקים בשפע פעמיים והשתמשו בנייר טישו לייבוש צלחת הג'ל.

לאחר מכן השתמש בסורק ובתוכנה המתאימה כדי לסרוק את הג'ל ב-300 DPI ולהתאים את הבהירות והניגודיות כדי לקבל הדמיה ברורה של רצועות ה-DNA. לבסוף, ציון דפוס הרצועות של סמני ה-SSR על סמך גדלי שברי ה-DNA בתמונה. אמפליקוני ה-PCR המוצגים כאן יוצרו באמצעות זוגות פריימר SSR המתאימים בכרוב סיני פורח וטבק.

לאחר האלקטרופורזה, ג'לי הפוליאקרילאמיד נצבעו באמצעות פרוטוקול צביעת הכסף המודגם בסרטון זה. שזיהה באופן חד משמעי את דפוסי הפסים של סמני SSR. כדי להשוות את יעילות הזיהוי של פרוטוקולי צביעת כסף שונים, מוצרי PCR של סמני SSR הופרדו באמצעות PAGE, והודגמו באמצעות חמישה פרוטוקולי צביעת כסף שפורסמו ושיטה שישית שהודגמה בסרטון זה.

הפרוטוקול שהודגם כאן היה בעל רעש הרקע הנמוך ביותר והניגודיות הגבוהה ביותר של מקטעי DNA כך שהוא ייצר את בהירות התמונה הגבוהה ביותר. מבין ששת הפרוטוקולים שנבדקו, השיטה המודגמת כאן לוקחת את הזמן הקצר ביותר ודורשת את המספר הנמוך ביותר של ריאגנטים כימיים ושלבי תהליך. לבסוף, איור זה מציג את הרגישות של הפרוטוקול כפי שנמדדה באמצעות דילול סדרתי של סמן DNA של 50 עד 2000 bp על ג'ל פוליאקרילאמיד שאינו מפרק דנטורציה מ-10 ננוגרם לפס בנתיב 1 ל-9.8 פיקוגרם לפס DNA בנתיב 11.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למנוע זיהום צולב של פתרונות הספגה ופיתוח. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לגנוטיפ מהיר של סמני SSR.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות בפשטות וביעילות סמני SSR בג'ל פוליאקרילאמיד שאינו דנטור באמצעות מכתים כסף. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים כימיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש ללבוש אמצעי זהירות כגון כפפות, בעת ביצוע הליך זה.