ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כמו למשל כיצד מבנה הדנ"א משתנה במהלך מחזור התא של חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין מבנה אולטרה של תאי חיידקים שלמים קרוב למצב החי בנקודות זמן מתאימות ללא טיפולים נוספים. המדגימים את ההליך יהיו צ'יהונג סונג, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, ומאקו היאשי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה של ד"ר קנקו.

התחילו בגידול ציאנובקטריה על צלחות BG-11 מעוקרות באורך תשעה סנטימטרים המכילות 1.5% אגר ו-0.3% נתרן תיוסולפט. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור של 12-12 עם 50 מיקרו-E אור למ"ר לשנייה. כדי לשמור על התאים, העבירו אותם לצלחות אגר BG-11 טריות מדי שבוע.

תוך שבוע, תרבויות מופיעות כפסים ירוקים. העבירו את גושי התאים הירוקים באמצעות לולאה מעוקרת להבה, ופסו אותם על הצלחת החדשה. כדי לצפות בדחיסת DNA, אסוף את התאים שגודלו במשך שישה ימים בתום תקופת האור.

כדי לשחרר את התאים מהצלחת, הוסף מיליליטר אחד של סוכרוז 0.2 מולארי. לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים, וחזרו על הוספת הסוכרוז והסרתו עד שהתמיסה הופכת לירוקה. שינוי הצבע מצביע על כך שרוב התאים שוחררו.

כעת, העבירו 500 מיקרוליטר של תמיסת תאים מרחפים לשפופרת מיקרופוגה, והוסיפו כתם הוכסט לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, תנו לתאים לדגור בחושך למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובבו את התאים, השליכו את הסופרנטנט והשעו אותם מחדש ב-10 מיקרוליטרים של סוכרוז 0.2 מולארי.

לאחר מכן, העבירו מיקרוליטר אחד של המתלה למגלשת זכוכית, הניחו תלוש כיסוי והתבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן UV. באמצעות מטרת טבילה של פי 100 בשמן, חפש עדויות לדחיסת DNA, שאמורה להיות ניתנת לצפייה ברוב התאים. ראשית, הכינו את מכשיר הקפאת הצלילה.

לאחר מכן, הגדר את מיכל החנקן הנוזלי על ידי הכנסת מיכל האתאן וחיבור מוט הקירור. לאחר מכן, מלאו את המיכל בחנקן נוזלי, וקררו אותו לטמפרטורת חנקן נוזלי. לאחר מכן, טען גז אתאן למיכל.

הקפידו להרכיב משקפי בטיחות, מכיוון שאתאן נוזלי הוא חומר נפץ. לבסוף, הסר את חיבור מוט הקירור, וכסה את המיכל במכסה פלסטיק כדי למנוע הצמדת כפור. כדי להמשיך, זוהר לפרוק את צד הפחמן של רשת EM מצופה פחמן למשך 30 שניות ב-50 מיליאמפר באמצעות מחסום יונים פלזמה.

לאחר מכן, הכינו את ה-Vitrobot בהתאם לפרוטוקול הבדיקה. השתמש בפינצטה כדי להגדיר את רשת ה-EM המטופלת מראש לתא. טפל ברשת ה-EM עם עוקב זהב BSA אחד של מיקרוליטר ו-15 ננומטר כדי לשמש כסמן נאמן לפני מריחת הדגימה.

כעת, 2.5 מיקרוליטר של תרחיף תאים על הרשת. מחק כל תמיסה עודפת באמצעות נייר פילטר, והקפיא מיד את הרשת באתאן נוזלי. שמור את הרשת הקפואה מאוחסנת בחנקן נוזלי עד שניתן יהיה לבחון אותם.

לאחר מכן, הפעל את ה-HVEM והגדר אותו למתח גבוה של מגה-וולט אחד. לאחר מכן, יש לקרר את מחזיק רשת הדגימה למינוס 150 מעלות צלזיוס באמצעות חנקן נוזלי. לאחר שהתקרר, הרכיב את הרשת הקפואה לתוך מחזיק דגימת הקריאו המקורר, וטען אותה לתוך ה-HVEM.

הקפד להימנע מזיהום ההתקנה בקרח. כעת, בחר אזור הדמיה בהגדלה נמוכה של פי 1,000. לאחר מכן, התאם את גובה ציר ה-z האוצנטרי, והטה את שלב הדגימה ל-60 מעלות שליליות.

לאחר מכן, הסר את תגובת הנגד של סיבוב ההטיה. כעת, התמקד ליד מיקום המטרה בהגדלה של פי 10,000. הגדר תת-מיקוד של שישה עד 10 מיקרון על ידי סטייה מהתמונה הממוקדת.

להדמיה, הגדר את המינון לשני אלקטרונים לאנגסטרום מרובע לשנייה או פחות. שימו לב למינון האלקטרונים, המשתקף מצפיפות הזרם, וצלמו תמונה במצלמה דיגיטלית או בסרט אלקטרונים. לאחר מכן, אסוף תמונות הטיה מנגטיב 60 לחיובי 60 מעלות במרווחים של שתיים עד ארבע מעלות.

השתמש בתכונות האוטומטיות של המיקרוסקופ במידת האפשר. פתחו את חבילת התוכנה המסחרית וטענו את תמונות ההטיה לשחזור הטומוגרפי. לאחר מכן, צור קובץ אוסף תמונות מהתמונות הבודדות באמצעות הפקודה tif2mrc או newstack.

לאחר מכן, הפעל את תוכנת eTomo GUI והזן את פרמטרי התמונה עבור גודל פיקסלים, קוטר פידוציאלי, סיבוב תמונה וכן הלאה. לפיכך, צור את תסריט העריכה. כעת, השתמש בתוכנה המוצעת כדי ליצור סדרת הטיה, מיושרת באמצעות סמנים פידוציאליים, עם שגיאה שיורית ממוצעת של פחות מ-0.5.

לבסוף, שחזר טומוגרפיה תלת מימדית באמצעות אלגוריתם SIRT. כעת, חלץ אזור עניין מהטומוגרפיה, והחל מסנן הפחתת רעשים, כגון מסנן דיפוזיה אנזוטרופי, מסנן דו-צדדי או מסנן מורפולוגיה מתמטית. בצע את הסינון באמצעות פרמטרים המשפרים את ניגודיות התמונה.

לאחר מכן, פלח תכונה מעניינת. השתמש בתכונת החיתוך כדי לפתוח את הטומוגרפיה. לאחר מכן, עבור אל חלון עורך הפילוח ובחר שדה תווית חדש כדי ליצור קובץ פילוח.

לאחר מכן, עקוב ידנית אחר גבול התכונה המעניינת בפרוסה הראשונה ולאחר מכן בכל אחת מהפרוסות האחרות. ניתן להוסיף תכונה מעניינת נוספת באמצעות אותן פעולות. כעת, כדי ליצור עיבוד משטח באמצעות אפשרויות בתפריט SurfaceGen כדי להמחיש את אמצעי האחסון המפולח, בחר בתפריט SurfaceView.

כדי להזיז, לסובב ולהגדיל את אמצעי האחסון התלת-ממדי, השתמשו בכלים בחלון 'מציג תלת-ממד'. ניתן לבצע פילוח אוטומטי באמצעות כלי שרביט הקסמים. לחץ על אובייקט והתאם את המחוונים בתצוגה ובמיסוך כך שתכונות האובייקט ייבחרו במלואן.

בתרבית סינכרונית מדויקת, ה-DNA המסומן ב-Hoechst מראה פיזור אחיד נורמלי במצב החושך ולאחר מכן נדחס בהדרגה בתוך התא במהלך תקופת האור, ומקבל מבנה גלי דמוי מוט עד סוף תקופת האור. לבסוף, המוט מתחלק במרכז, ושני חלקיו מופצים לתאי הבת. לאחר חלוקת התא, ה-DNA הדחוס נעלם מיד, וה-DNA חוזר להתפלגות אחידה נורמלית.

כאשר תאים בשלב הסופי של דחיסת ה-DNA הוקפאו ונצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים במתח גבוה, רבים הראו דחיסת DNA מובהקת שניתן היה להבדיל בקלות מתאים רגילים. חלקם הראו התכווצות במרכז התאים, כצפוי לפני חלוקת התאים. מהטומוגרפיות התלת-ממדיות, DNA קומפקטי מופרד באופן גלוי בציטופלזמה ומוקף בחומר בצפיפות נמוכה.

שכבות הממברנה התילקואידית מעוותות לאורך המוט הגלי של ה-DNA הדחוס. מעניין שגופי פוספט קטנים רבים נצמדים ל-DNA הדחוס ובדרך כלל מופיעים בזוגות. גופי פוליפוספט אלה עשויים להיות ספקי הפוספט לסינתזת DNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין אולטרה-מבנה של תאי חיידקים שלמים קרוב למצב החיים בנקודת הזמן המתאימה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים במתח גבוה ללא כל טיפול נוסף כמו צביעה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמצב דחיסת ה-DNA משתנה עם כל דקה בסוף מחזור האור. ודא שאתה לא מפספס את התזמון הטוב ביותר להקפיא את הדגימה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו CLEM על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי לוקליזציה של חלבונים או נוקלאוטידים ספציפיים ב-DNA הדחוס. לאחר פיתוחה, טכניקה זו אמורה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור חלוקת תאים, הפרדת DNA וזיהום ויראלי בחיידקים או באיקריוטים קטנים.