דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים
13 באפריל 2018
אנאפלואידיה מוביל לחוסר יציבות הגנום, אשר בסופו של דבר מייצר תאים בבידוד-מחזור התא עם karyotypes מורכבים. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ונוחה לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה להפסיק לחלק.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה ליצירה ובידוד של תאים עצורי מחזור תאים עם קריוטיפים מורכבים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום חקר האנופלואידים, כגון האינטראקציה של מערכת החיסון עם תאים אנופלואידים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מייצרת אוכלוסיית תאים המכילה רק קריוטיפים מורכבים.
כדי להתחיל בסנכרון של תאי RPE-1 hTERT, השתמש בתאים שהופשרו זה עתה והחלק אותם לצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר באמצעות שמונה מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי. לאחר מכן, השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע את מספר התא. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך הלילה.
למחרת, החלף את מצע הגידול הסטנדרטי במדיום המכיל חמישה מילי-מולרי תימידין. דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לסנכרן תאים בגבול G1S. לאחר 24 שעות יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול סטנדרטי לתאים השטופים ודגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ראשית, יש לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 500 ננו-מולרי מעכב Mps1 היפוך.
דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום גידול סטנדרטי והחזיר את הצלחות לחממה.
כ- 72 שעות לאחר המיטוזה החריגה הראשונה, יש לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 330 ננו-מולרי נוקודזול. דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, שאפו את מדיום הנוקודאזול. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר PBS למנה והקישו על צד הצלחת כדי לנער את התאים המיטוטיים. סובב את הצלחת בין כל ברז כדי לאפשר הסרה אחידה של תאים מיטוטיים.
לאחר הניעור הראשוני, יש לשאוב כל נוזל שנדבק למכסה ולקצה הצלחת. לאחר מכן, בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. לאחר מכן שטפו את התאים עם חמישה מיליליטר PBS.
לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 330 נוקודזול ננו-מולרי. דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הניעור הסופי, הוסף 10 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי.
דגרו על התאים למשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע הבדיקות. התאים שנותרו על הצלחת מכונים עצורים עם קריוטיפ מורכב או תאי ArCK. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד תאי ArCK ומספר תכונות ספציפיות לתאי ArCK מנותחות כדי לאשר את בידודם.
תאי ArCK מראים רמות מוגברות של מעכבי מחזור התא p53, p21 ו-p16 בניתוח האימונובלואיד, בעוד שתאי מחזור אופלואידים ואנופלואידים לא. בנוסף, תאי ArCK חיוביים לבטא-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות, אשר מכתים כחול-ירוק בעוד שתאי בקרה אופלואידים לא. תרשימי פילוח מגלים שתאי ArCK הם אנופלואידים, המאופיינים ברווחי כרומוזומים מרובים ואקראיים ואובדן כרומוזומים.
תרשימי פילוח מציגים את מספר ההעתקים של תאים בודדים מכרומוזום אחד עד X, ביחס לסולם יומן ייחוס אופלואיד שני. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד להסיר את כל התאים המיטוטיים במהלך כל ניעור. לאחר ביצוע הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות ציטוקינים.
בדיקות אלו יעזרו לענות על שאלות נוספות כגון היכולת של תאי ArCK לקיים אינטראקציה עם תאי מערכת החיסון. אל תשכח שנוקודאזול הוא מסוכן. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בזמן השימוש במגיב זה.
לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבודד ביעילות תאי ArCK במבחנה. ניתן לבצע הליך זה תוך שבעה ימים אם הוא מבוצע כראוי.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה פשוטה לבידוד תאים אנאופלואידיים בעלי קריוטיפים מורכבים שנמצאים במצב של מעצר במחזור התא. הטכניקה שואפת להעמיק את ההבנה בנוגע לאנאופלואידיות ולהשלכותיה על התנהגות תאית ואינטראקציות חיסוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
- מדעי המוח
רקע
- אנאויפלואידיות קשורה לחוסר יציבות גנומית.
- תאים בעלי קריוטיפים מורכבים מפסיקים לעיתים קרובות להתחלק.
- הבנת תאים אלו עשויה לספק תובנות לגבי סרטן ומחלות אחרות.
- בידוד תאים אלו יכול לסייע במחקר נוסף של תכונותיהם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירה ובידוד של תאים שנמצאים במצב של מעצר במחזור התא.
- בחינת המאפיינים של תאים אנאופלואידיים.
- חקירת האינטראקציה בין תאים אנאופלואידיים לבין מערכת החיסון.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- סנכרון של תאי RPE-1 hTERT באמצעות תימידין ונוקודזול.
- טכניקת ניעור תאים (shake-off) לבידוד תאים במצב מיטוזה.
- ניתוח אימונובלוט להערכת מעכבי מחזור התא.
- צביעת בטא-גלקטוסדידאז הקשורה לסנסנציה (Senescence-associated beta-Galactosidase) לזיהוי תאי ArCK.
תוצאות עיקריות
- תאי ArCK מראים רמות מוגברות של מעכבי מחזור התא.
- תאים אלו חיוביים לסמנים הקשורים להזדקנות (senescence).
- תרשימי סגמנטציה מאשרים אנאופלואידיות בתאים מבודדים.
- השיטה מבודדת ביעילות תאים בעלי קריוטיפים מורכבים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק דרך מהימנה לחקר תאים אנויפלואידיים.
- ניתן להשתמש בתאי ArCK מבודדים למחקרים נוספים על אינטראקציות חיסוניות.
- ביצוע נכון של השיטה יכול להניב תוצאות בתוך שבוע.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
בידוד תאים שעצרו את מחזור התא ובעלי קריוטיפים מורכבים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של פנוטיפים המונעים על ידי אנאופלואידיה בביולוגיה של גילוי. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור לחקר חוסר יציבות כרומוזומלית והשפעתו על הזדקנות תאית, דלקת ואינטראקציות חיסוניות. ההסתמכות של השיטה על טכניקות סטנדרטיות לתרבית רקמות משפרת את יכולת ההרחבה (scalability) ואת האימוץ הבין-תחומי בקווי מחקר ופיתוח (R&D) בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות אנויפלואידיות (aneuploidy) לחוסר יציבות גנומית ולפנוטיפים פרו-דלקתיים.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית וזולה ליצירת תאי ArCK באמצעות סנכרון באמצעות thymidine, reversine ו-nocodazole.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יצירת אוכלוסיית תאים מוגדרת בעלת קריוטיפים מורכבים לצורך ניתוח כמותי של סמני הזדקנות (senescence) והפרשת ציטוקינים.
- ערך תפעולי: תמיכה בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בידוד עקבי של תאים שעצרו את מחזור השכפול באמצעות shake-off וטיפול ב-nocodazole.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על חקר האינטראקציות של תאים אנאופלואידיים עם תאי מערכת החיסון, ובכך מספק מידע להערכת מטרות אימונו-מודולטוריות.
- ערך תפעולי: מאפשר ביצוע בדיקות תפקודיות המשך, כגון פרופיל ציטוקינים וצביעת בטא-גלקטוזידאז הקשורה לסנסינציה (senescence-associated beta-Galactosidase), כדי לתקף תוצרים פנוטיפיים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לסריקה פנוטיפית, במיוחד עבור מנגנונים הכוללים אי-יציבות כרומוזומלית ומסלולי תגובה למעמדות (stress response pathways).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תאים בעלי מורכבות קריוטיפית מוגדרת, כדי להבהיר קשרים סיבתיים בין אנאויפלואידיות לבין פנוטיפים תאיים.
- סריקה: מאפשר הכנה הדירה של תאי ArCK לצורך ניתוח בעל תוכן גבוה של מעכבי מחזור התא ופרופילים הפרשתיים.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים הכוללים זיהוי באמצעות אימונובלוט של p53, p21, p16 ותרשימי פילוח של שינויי מספר עותקים ברמת התא הבודד.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרי אינטראקציה חיסונית, ותומך בחקר ביומרקרים בפנוטיפים הפרשתיים הקשורים להזדקנות תאית (senescence-associated secretory phenotypes).
- שימוש חוזר ארגוני: משתמש בריאגנטים נגישים ובציוד תרבית סטנדרטי, מה שמאפשר התאמה בין מעבדות שונות ללא צורך בתשתית מתמחה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגנונית במחקר על אנאופלואידיה על ידי אספקת מודל עצירה מוגדר עם קריוטיפים מורכבים.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקול של שבעה ימים עם ספציפיות גבוהה לתאי ArCK, ובכך משפר את התפוקה ואת השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של סיכונים ביולוגיים המונעים על ידי אנאופלואידיה במסלולים מטרים.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות הקשורות לחוסר יציבות כרומוזומלית ולהזדקנות תאית (senescence).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות לסנכרון תאים ובפרוטוקולים של mitotic shake-off.
- תלוי בגישה לאינקובטורים סטנדרטיים לתרביות רקמה, המוציטומטרים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במיקרוסקופיה בשדה בהיר לצורך תיקוף.
- מצריך סטנדרטיזציה של הטיפול ב-nocodazole ובשלבי השטיפה כדי להבטיח הסרה מלאה של תאים במיטוזה בין חזרות שונות.
- התאמה לקווי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ריכוזי ה-thymidine, reversine ו-nocodazole ושל תזמוני הטיפול.
- מוגבל למודלים in vitro; יישום על רקמה ראשונית או in vivo לא נדון בחומרי המקור.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
