דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה ליצירה ובידוד של תאים עצורי מחזור תאים עם קריוטיפים מורכבים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום חקר האנופלואידים, כגון האינטראקציה של מערכת החיסון עם תאים אנופלואידים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מייצרת אוכלוסיית תאים המכילה רק קריוטיפים מורכבים.

כדי להתחיל בסנכרון של תאי RPE-1 hTERT, השתמש בתאים שהופשרו זה עתה והחלק אותם לצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר באמצעות שמונה מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי. לאחר מכן, השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע את מספר התא. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך הלילה.

למחרת, החלף את מצע הגידול הסטנדרטי במדיום המכיל חמישה מילי-מולרי תימידין. דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לסנכרן תאים בגבול G1S. לאחר 24 שעות יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול סטנדרטי לתאים השטופים ודגרו במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ראשית, יש לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 500 ננו-מולרי מעכב Mps1 היפוך.

דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום גידול סטנדרטי והחזיר את הצלחות לחממה.

כ- 72 שעות לאחר המיטוזה החריגה הראשונה, יש לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 330 ננו-מולרי נוקודזול. דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, שאפו את מדיום הנוקודאזול. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר PBS למנה והקישו על צד הצלחת כדי לנער את התאים המיטוטיים. סובב את הצלחת בין כל ברז כדי לאפשר הסרה אחידה של תאים מיטוטיים.

לאחר הניעור הראשוני, יש לשאוב כל נוזל שנדבק למכסה ולקצה הצלחת. לאחר מכן, בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. לאחר מכן שטפו את התאים עם חמישה מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הוסף מדיום המכיל 330 נוקודזול ננו-מולרי. דגירה למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הניעור הסופי, הוסף 10 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי.

דגרו על התאים למשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע הבדיקות. התאים שנותרו על הצלחת מכונים עצורים עם קריוטיפ מורכב או תאי ArCK. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד תאי ArCK ומספר תכונות ספציפיות לתאי ArCK מנותחות כדי לאשר את בידודם.

תאי ArCK מראים רמות מוגברות של מעכבי מחזור התא p53, p21 ו-p16 בניתוח האימונובלואיד, בעוד שתאי מחזור אופלואידים ואנופלואידים לא. בנוסף, תאי ArCK חיוביים לבטא-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות, אשר מכתים כחול-ירוק בעוד שתאי בקרה אופלואידים לא. תרשימי פילוח מגלים שתאי ArCK הם אנופלואידים, המאופיינים ברווחי כרומוזומים מרובים ואקראיים ואובדן כרומוזומים.

תרשימי פילוח מציגים את מספר ההעתקים של תאים בודדים מכרומוזום אחד עד X, ביחס לסולם יומן ייחוס אופלואיד שני. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד להסיר את כל התאים המיטוטיים במהלך כל ניעור. לאחר ביצוע הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות ציטוקינים.

בדיקות אלו יעזרו לענות על שאלות נוספות כגון היכולת של תאי ArCK לקיים אינטראקציה עם תאי מערכת החיסון. אל תשכח שנוקודאזול הוא מסוכן. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בזמן השימוש במגיב זה.

לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבודד ביעילות תאי ArCK במבחנה. ניתן לבצע הליך זה תוך שבעה ימים אם הוא מבוצע כראוי.