בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית
2 באפריל 2018
הפלסטיות המדהימה של אדריכלות גרעיני נשלטת על ידי מנגנוני epigenetic דינאמי כולל ללא קידוד RNAs, DNA מתילציה, שינוי מיקום נוקלאוזום וכן היסטון הרכב השינוי. כאן נתאר פרוטוקול Formaldehyde-Assisted בידוד של הרגולציה אלמנטים (שלהם) אשר מאפשר קביעת כרומטין נגישות בצורה פשוטה, זולה הדירים.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את נגישות הכרומטין של לוקוס גנטי על ידי קישור קוולנטי של ה-DNA לחלבונים המשויכים, ולאחר מכן טיהור וכימות של ה-DNA החופשי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכרומטין שכן ניתן לקבוע את נגישות ה-DNA, ללא קשר לסוג התא בתאים לא מטופלים וגם בתאים העוברים שיפוץ כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש באנזימים כדי לבקע את ה-DNA או הנוגדנים שצריך לטטר עבור כל סביבת ניסוי.
לפרוטוקול זה יש יתרון נוסף שהוא אינו דורש ציוד מיוחד מלבד סוניקטור. המדגימות את ההליך יהיו אולסיה ריטר וטביאה רידלינגר, שהן דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להוסיף פורמלדהיד ישירות למצע הגידול של תאים שנזרעו יום קודם לכן, כדי להגיע לריכוז סופי של 1% נפח בנפח.
דגרו את המדיום למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והרגו את הצלחות באופן ידני כל שתי דקות. לאחר מכן, הוסף גליצין לריכוז סופי של 0.125 טוחנת כדי להרוות את הפורמלדהיד. דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והרגו אותה כל שתי דקות.
שאפו את המדיום ואז הוסיפו בזהירות PBS קר כקרח לצד הכלי כדי לשטוף את התאים. שואבים את המדיום וחוזרים בזהירות על הכביסה פעמיים. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח והשתמשו במגרד תאים כדי לנתק את התאים, במידת הצורך.
העבירו אותם לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר על קרח. צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות בחום של 300 גרם וארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת על השולחן. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה FAIRE על ידי פיפטינג בזהירות למעלה ולמטה מספר פעמים. דגרו על התאים למשך 20 דקות על קרח. לאחר הדגירה, סוניקציה של ה-DNA המקושר כדי לחלוק אותו לגודל ממוצע של 200 עד 300 זוגות בסיסים ולקרר את הדגימות במהלך הסוניקציה כדי למנוע חימום הדגימה.
פיצול ה-DNA הוא קריטי לניסוי זה מכיוון שגודל השברים משפיע על רגישות התמיסה של הטכניקה כולה, ולכן חשוב לקבוע תנאי סוניקציה בזהירות מראש ולבדוק את גודל שברי הכרומטין בכל ניסוי בודד. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות ו-13,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש.
חלקו את הדגימות ל-100 מיקרוליטר. השתמש ב-100 מיקרוליטר כדי להפוך את הקישור הצולב ולשמש כהתייחסות ל-DNA הכולל. הוסף 10 מיקרוליטר של RNase A ודגר את הדגימה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של חלבון K.השתמש בתרמובלוק הניתן לתכנות כדי לדגור את הדגימה במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך שש שעות ב-65 מעלות צלזיוס כדי לבקע את החלבונים ולהפוך את הקישורים. השג מנה חדשה של 100 מיקרוליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של RNase A ודגר את הדגימה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, המשך עם הדגימה הלא מוצלבת והדגימה הלא מקושרת מהסעיף הקודם במקביל.
הוסף H2O כדי להגיע לנפח סופי של 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם במכסה אדים ומערבולת במרץ. צנטריפוגה של הדגימות למשך 10 דקות בחום של 13, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, העבירו בזהירות 280 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש. הקפד לא לקחת פסולת מהאינטרפאזה, המכילה גם חלבונים, ולהשליך את השלב התחתון שנותר כפסולת ממס אורגנית. חזור על הטיפול והעביר בזהירות 270 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש.
הוסף 270 מיקרוליטר כלורופורם במכסה אדים ומערבולת במרץ. צנטריפוגה את המדגם. לאחר הצנטריפוגה, העבירו בזהירות 250 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש, והקפידו לא לשאת פסולת מהאינטרפאזה.
השלך את הדגימה הנותרת כפסולת ממס אורגנית. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי, 250 מיקרוליטר איזופרופנול והוסף חמישה מיקרוליטרים של גליקוגן כנשא ה-DNA. הפוך את הצינורות ודגר אותם בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה כדי לזרז את ה-DNA. לאחר מכן, שטפו את כדור ה-DNA עם 400 מיקרוליטר של 70% נפח אתנול בנפח וצנטריפוגה את הדגימה. שאפו את הסופרנטנט בזהירות ותנו לכדור להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שהגלולה יבשה, השעו אותה מחדש ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE. דגרו את דגימת ה-DNA החופשית ללא קישור מוצלב למשך ארבע שעות ב-65 מעלות צלזיוס כדי להסיר קישורים צולבים בין DNA. לבסוף, כמת את כמות ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר והפעל אליקוט קטן כדי לבדוק את גודל השבר על ג'ל אגרוז של 2% משקל בנפח.
תאי HeLA עוררו עם TNF למשך שעה ונותחו על ידי FAIRE. היחס בין ה-DNA החופשי לעומת ה-DNA הכולל נקבע עבור המקדם של ACTB, הגן המקודד לבטא-אקטין והבקרה החיובית, אזור הטרוכרומטין בכרומוזום 12, הבקרה השלילית ומקדם IL8. נוצר ג'ל מוכתם באתידיום ברומיד הכולל זמני סוניקציה שונים ומצביע על גודל הכרומטין האופטימלי של 200 עד 300 זוגות בסיסים שהתקבל לאחר 20 דקות של סוניקציה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף עמוק על מנת לקבוע את נגישות הכרומטין ברמת הגנום. אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד ופנול כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להבטיח אמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים, לבישת כפפות וסילוק מתאים של הפסולת על ידי ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לקביעת נגישות כרומטין באמצעות שיטת Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE). הטכניקה היא פשוטה, ניתנת לשחזור ואינה דורשת ציוד מיוחד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אפיגנטיקה
- ביולוגיה של כרומטין
רקע
- נגישות הכרומטין חיונית להבנת ויסות גנים.
- מנגנונים אפיגנטיים דינמיים משפיעים על הארכיטקטורה הגרעינית.
- ל-RNAs שאינם מקודדים, למתילציה של DNA ולמודיפיקציות של היסטונים יש תפקידים משמעותיים.
- פרוטוקול ה-FAIRE מאפשר ניתוח של מבנה הכרומטין בסוגי תאים שונים.
מטרת המחקר
- לקביעת נגישות הכרומטין בלוכוסים גנטיים ספציפיים.
- לספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת כרומטין.
- לאפשר ניתוחים גנומיים נוספים לאחר הערכת נגישות הכרומטין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קישור קוולנטי של DNA לחלבונים הקשורים באמצעות פורמאלדהיד.
- טיהור וכמות של DNA חופשי.
- סוניקציה לשבירה של ה-DNA לגדלים אופטימליים לצורך ניתוח.
- שימוש במיצוי פנול-כלורופורם לטיהור דגימות DNA.
תוצאות עיקריות
- קביעה מוצלחת של נגישות כרומטין בתאי HeLa.
- תנאי סוניקציה אופטימליים מניבים מקטעי DNA של 200-300 base pairs.
- השוואה בין יחסי DNA חופשי ל-DNA כולל בפרומוטורים של גנים ספציפיים.
- הדגמה של התאימות של השיטה למסגרות ניסיוניות שונות.
מסקנות
- פרוטוקול FAIRE הוא כלי בעל ערך לחקר נגישות הכרומטין.
- ניתן לבצעו ללא ציוד מיוחד והוא יעיל מבחינת עלויות.
- יישומים נוספים כוללים ריצוף עמוק (deep sequencing) לצורך ניתוח כרומטין ברחבי הגנום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מדידה מהימנה של נגישות הכרומטין היא קריטית לאישור יעדים בשלבים מוקדמים ולצמצום סיכונים מכניסטיים במחקרי ויסות גנים. פרוטוקול ה-FAIRE מאפשר הערכה כמותית, ללא תלות בנוגדנים, של מצבי כרומטין ספציפיים לאטלה (locus), ובכך תומך ברמת ביטחון חזויה בתהליכי גילוי וסינון. פשטות התפעול והשחזוריות של הפרוטוקול מקלות על שילובו בצנרת מו"פ בקנה מידה ארגוני למחקר אפיגנטי ושעתוקי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של נגישות הכרומטין בלוקוסים גנטיים ספציפיים לצורך הבהרת מנגנונים רגולטוריים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין אזורי כרומטין פתוחים לאזורים דחוסים, ללא הטיות הנובעות משימוש בנוגדנים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של מצב הכרומטין על פני סוגי תאים ותנאים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין פרופילים מאושרים של נגישות כרומטין עבור בדיקות המשך מבוססות qPCR או ריצוף.
- מנרמל את מדידת מצב הכרומטין, ובכך מפחית שונות ניסויית ומשפר את השחזוריות.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה שאינם תלויי פלטפורמה, עבור סריקת תרכובות או הפרעות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני נגישות לכרומטין למודלים של ויסות גנים הרלוונטיים למחלה כאשר הם מיושמים במערכות תאים רלוונטיות.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור פרופיל כרומטין ברחבי הגנום או באתרי לוקוס ספציפיים.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי ויסות תעתוק לצורך קבלת החלטות על קידום מבוסס הערכת סיכונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול ה-FAIRE משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר חקירת כרומטין מונחית-השערות תוך תמיכה בתהליכי זיהוי ותיקוף של מולקולות מובילות (leads).
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את פתיחות הכרומטין כדי לבחון היפותזות רגולטוריות ולהבהיר מנגנוני בקרה של גנים.
- סריקה: מספק פלטי כמותיים הניתנים לשחזור של נגישות הכרומטין, המתאימים לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק יחסי תנובת DNA ונתוני גודל פרגמנטים להשוואה סטטיסטית חסונה של תנאים ניסיוניים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקל על התאמת ביומרקרים והמשכיות מנגנונית כאשר הוא מיושם במודלים הרלוונטיים למחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית, שאינה תלויה בנוגדנים, הניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים ולהגדרות ניסיוניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי ויסות גנים ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים הדורשים מעט ציוד.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים חסונים על מצב הכרומטין בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות אפיגנטיות ושעתוקיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה של כרומטין וב-qPCR כמותי או בניתוחי רצף.
- נדרשת גישה לסוניקטור ומכשור סטנדרטי לביולוגיה מולקולרית.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית של פרמטרי הסוניקציה והמיצוי בין צוותים שונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימו לסוגים שונים של תאי יונקים ולתנאים ניסיוניים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- נקיטת אמצעי זהירות היא חיונית בשל שימוש בריאגנטים מסוכנים כגון פורמלהיד ופנול-כלורופורם.
