בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את נגישות הכרומטין של לוקוס גנטי על ידי קישור קוולנטי של ה-DNA לחלבונים המשויכים, ולאחר מכן טיהור וכימות של ה-DNA החופשי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכרומטין שכן ניתן לקבוע את נגישות ה-DNA, ללא קשר לסוג התא בתאים לא מטופלים וגם בתאים העוברים שיפוץ כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש באנזימים כדי לבקע את ה-DNA או הנוגדנים שצריך לטטר עבור כל סביבת ניסוי.

לפרוטוקול זה יש יתרון נוסף שהוא אינו דורש ציוד מיוחד מלבד סוניקטור. המדגימות את ההליך יהיו אולסיה ריטר וטביאה רידלינגר, שהן דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, יש להוסיף פורמלדהיד ישירות למצע הגידול של תאים שנזרעו יום קודם לכן, כדי להגיע לריכוז סופי של 1% נפח בנפח.

דגרו את המדיום למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והרגו את הצלחות באופן ידני כל שתי דקות. לאחר מכן, הוסף גליצין לריכוז סופי של 0.125 טוחנת כדי להרוות את הפורמלדהיד. דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והרגו אותה כל שתי דקות.

שאפו את המדיום ואז הוסיפו בזהירות PBS קר כקרח לצד הכלי כדי לשטוף את התאים. שואבים את המדיום וחוזרים בזהירות על הכביסה פעמיים. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח והשתמשו במגרד תאים כדי לנתק את התאים, במידת הצורך.

העבירו אותם לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר על קרח. צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות בחום של 300 גרם וארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת על השולחן. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את כדור התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה FAIRE על ידי פיפטינג בזהירות למעלה ולמטה מספר פעמים. דגרו על התאים למשך 20 דקות על קרח. לאחר הדגירה, סוניקציה של ה-DNA המקושר כדי לחלוק אותו לגודל ממוצע של 200 עד 300 זוגות בסיסים ולקרר את הדגימות במהלך הסוניקציה כדי למנוע חימום הדגימה.

פיצול ה-DNA הוא קריטי לניסוי זה מכיוון שגודל השברים משפיע על רגישות התמיסה של הטכניקה כולה, ולכן חשוב לקבוע תנאי סוניקציה בזהירות מראש ולבדוק את גודל שברי הכרומטין בכל ניסוי בודד. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות ו-13,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש.

חלקו את הדגימות ל-100 מיקרוליטר. השתמש ב-100 מיקרוליטר כדי להפוך את הקישור הצולב ולשמש כהתייחסות ל-DNA הכולל. הוסף 10 מיקרוליטר של RNase A ודגר את הדגימה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של חלבון K.השתמש בתרמובלוק הניתן לתכנות כדי לדגור את הדגימה במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך שש שעות ב-65 מעלות צלזיוס כדי לבקע את החלבונים ולהפוך את הקישורים. השג מנה חדשה של 100 מיקרוליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של RNase A ודגר את הדגימה למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, המשך עם הדגימה הלא מוצלבת והדגימה הלא מקושרת מהסעיף הקודם במקביל.

הוסף H2O כדי להגיע לנפח סופי של 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם במכסה אדים ומערבולת במרץ. צנטריפוגה של הדגימות למשך 10 דקות בחום של 13, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו בזהירות 280 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש. הקפד לא לקחת פסולת מהאינטרפאזה, המכילה גם חלבונים, ולהשליך את השלב התחתון שנותר כפסולת ממס אורגנית. חזור על הטיפול והעביר בזהירות 270 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש.

הוסף 270 מיקרוליטר כלורופורם במכסה אדים ומערבולת במרץ. צנטריפוגה את המדגם. לאחר הצנטריפוגה, העבירו בזהירות 250 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור תגובה חדש, והקפידו לא לשאת פסולת מהאינטרפאזה.

השלך את הדגימה הנותרת כפסולת ממס אורגנית. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי, 250 מיקרוליטר איזופרופנול והוסף חמישה מיקרוליטרים של גליקוגן כנשא ה-DNA. הפוך את הצינורות ודגר אותם בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה כדי לזרז את ה-DNA. לאחר מכן, שטפו את כדור ה-DNA עם 400 מיקרוליטר של 70% נפח אתנול בנפח וצנטריפוגה את הדגימה. שאפו את הסופרנטנט בזהירות ותנו לכדור להתייבש במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שהגלולה יבשה, השעו אותה מחדש ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE. דגרו את דגימת ה-DNA החופשית ללא קישור מוצלב למשך ארבע שעות ב-65 מעלות צלזיוס כדי להסיר קישורים צולבים בין DNA. לבסוף, כמת את כמות ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר והפעל אליקוט קטן כדי לבדוק את גודל השבר על ג'ל אגרוז של 2% משקל בנפח.

תאי HeLA עוררו עם TNF למשך שעה ונותחו על ידי FAIRE. היחס בין ה-DNA החופשי לעומת ה-DNA הכולל נקבע עבור המקדם של ACTB, הגן המקודד לבטא-אקטין והבקרה החיובית, אזור הטרוכרומטין בכרומוזום 12, הבקרה השלילית ומקדם IL8. נוצר ג'ל מוכתם באתידיום ברומיד הכולל זמני סוניקציה שונים ומצביע על גודל הכרומטין האופטימלי של 200 עד 300 זוגות בסיסים שהתקבל לאחר 20 דקות של סוניקציה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף עמוק על מנת לקבוע את נגישות הכרומטין ברמת הגנום. אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד ופנול כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להבטיח אמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים, לבישת כפפות וסילוק מתאים של הפסולת על ידי ביצוע הליך זה.