מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans
March 15th, 2018
שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להפיק זנים טטרפלואידים יציבים מדיפלואידים מכל גנוטיפ או קריוטיפ על מנת לחקור את התפקיד או ההשלכות של פוליפלואידיזציה של גנום שלם בתהליכים ביולוגיים. שיטה זו יכולה לעזור לחקור את התפקיד של פוליפלואידיזציה של גנום שלם על מינון גנים, קנה מידה ביולוגי, איתות חוץ-תאי, חוסר יציבות גנומי, פיתוח עמידות לתרופות, הסתגלות ללחץ ומנגנוני התמיינות (speciation). היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה, רב-תכליתית, פשוטה, כמו גם הטכניקה היחידה הזמינה באורגניזמים רב-תאיים ליצירת טטרפלואידים יציבים ופוריים מכל זן דיפלואידי.
הרעיון של שיטה זו עלה לי לראשונה כאשר ניתחתי את פנוטיפ הפרדת הכרומוזומים של מוטציות rec-8 בזרעונים ובביציות. מוטציות Rec-8 מייצרות זרע וביציות דיפלואידיות המצביעות על כך שהפחתת רמת ביטוי הגן rec-8 עלולה לגרום לייצור צאצאים טטרפלואידים בעת ההפריה. תדגים את ההליך הזה קתרין ריברה גומז, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.
כדי לגרום לביטוי RNA דו-גדילי rec-8 ב-Escherichia coli, הכינו צלחות אגר NGM עם IPTG מילי-מולרי אחד ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. אחסן את הצלחות הללו בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד ארבעה שבועות. כעת הכינו את החיידקים הנושאים את שיבוט ה-rec-8 המתאים.
פס אותם על הצלחות המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה ודגר את החיידקים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, חסנו מושבות בודדות מהצלחות לארבעה מיליליטר של LB עם אותו ריכוז אנטיביוטיקה וגידלו את החיידקים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה. למחרת, לגרום לייצור של RNA דו-גדילי על ידי הוספת IPTG עד שהריכוז הסופי הוא IPTG מילי-מולרי אחד.
לאחר מכן המשיכו בדגירה למשך 40 דקות. לאחר מכן, זרעו את צלחות ה- NGM IPTG המוכנות. הוסף לצלחות 100 עד 200 מיקרוליטר תרבית ודגר אותם בטמפרטורת החדר בחושך למשך הלילה.
למחרת בבוקר, הניחו שלושה עד ארבעה הרמפרודיטים צעירים בבימת L4 על צלחות החיידקים rec-8 ותנו להם לגדול ב-15 מעלות צלזיוס בחושך. כשלושה ימים לאחר מכן, כאשר הרמפרודיטים F1 נמצאים בשלב הזחל L3 עד L4, מתחילים לייצר לוחות חיידקי RNAi נוספים מסוג rec-8. לאחר כארבעה ימים על לוחות החיידקים rec-8, העבירו 20 מההרמפרודיטים הבוגרים הצעירים F1 L4 ללוחות ה-RNAi הטריים של rec-8 ואפשרו להם להפרות את עצמם.
אפשר גם לכלול ארבעה עד שישה זכרים לא מטופלים מאותו הזן. מאוחר יותר, בדוק אם יש צאצאים F2 עם הפנוטיפ הארוך. הם בסך הכל גדולים יותר מהסוג הפראי וגופם עושה סיבוב נוסף כשהם נעים קדימה ויוצרים גלי כיפוף גוף סינוסואידיים מהראש לזנב.
העבירו את הטטרפלואידים המשוערים הללו לחיידקי OP50 או HB101 E.coli רגילים. סנן את הצלחת גם עבור צאצאי F3. עם זאת, F3 אלה אינם יכולים להיחשב כזנים עצמאיים מכיוון שהם עשויים להיות אחים מאותה אם F2.
תן לתולעים הארוכות שנאספו להפרות את עצמן כדי להתרבות. המשיכו להעביר שלוש עד שש חיות ארוכות מכל דור לצלחת חדשה עד שרק צאצאים ארוכים ייוולדו. זה עשוי לקחת כמה דורות מכיוון שתולעים ארוכות הן לרוב עקרות ואינן מניבות צאצאים.
לזנים טטרפלואידים יש 12 זוגות כרומוזומים שניתן לאמת על ידי ספירת הגופים המוכתמים ב-DAPI בביציות לא מופרות. לשם כך, זרוק חמישה עד 10 מיקרוליטר של מאגר M9 על מגלשה והעביר שישה עד 10 טטרפלואידים משוערים לתוך הטיפה. תחת מיקרוסקופ מנתח, ספגו בזהירות את רוב ה-M9 לתוך רקמת ניקוי נטולת מוך.
לאחר מכן זרוק 10 מיקרוליטר של 90% אתנול על התולעים וראה את האתנול מתאדה לחלוטין. ברגע שהאידוי מסתיים, חזור על תהליך הוספת האתנול וצפה בו מתאדה. בסך הכל, הוסף 10 מיקרוליטר בארבעה יישומים.
לאחר שהטיפה האחרונה מתאדה, הוסף שישה מיקרוליטר DAPI בשני ננוגרם למיקרוליטר או כתם דומה. לאחסון ארוך טווח של המגלשות, הרכיבו את התולעים באנטי דהייה זמין מסחרית או תוצרת בית. לאחר מכן הוסף כיסוי ואוטם את הקצוות עם לק.
לאחר שהלק התייבש, ניתן לקלוע את השקופיות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ובהגדלה של פי 100. ראשית מצא את הביצית הלא מופרית הבוגרת ביותר הסמוכה מיד לזרע הזרע ועדיין לא נכנסה לא לזרע או לרחם.
גופי ה-DAPI כאן הם ככל הנראה זוגות כרומוזומים בודדים. לאחר מכן, התמקדו בגרעין הביצית והשתמשו במיקוד העדין של המיקרוסקופ כדי לסרוק אותה לאט מלמעלה למטה תוך כדי ספירת גופי ה-DAPI. לאחר מכן ספרו מחדש את גופי ה-DAPI באותו גרעין על ידי הזזת המיקוד מלמטה למעלה.
לביציות מסוג בר יש שישה גופי DAPI בממוצע. נוכחותם של 12 גופי DAPI מצביעה על כך שבעלי החיים בזן זה הם טטרפלואידים חלקיים או מלאים. נתח לפחות 10 בעלי חיים לכל זן.
לעתים קרובות זוגות כרומוזומים יהיו קרובים מאוד או נוגעים כך שמספר גופי ה-DAPI לרוב קטן מהמספר האמיתי של זוגות הכרומוזומים. זנים טטרפלואידים מרובים נוצרו על ידי הזנת חיידקי C.elegans המבטאים RNA דו-גדילי rec-8. טטרפלואידים יכולים להיווצר על ידי הפריה עצמית של הרמפרודיטים במשך שניים עד שלושה דורות או על ידי הכלאה של הדור הראשון של הרמפרודיטים עם זכרים לא מטופלים מאותו גנוטיפ.
בתרחיש האחרון, הזכרים בהכלאה נחשפים לחיידקי ה-rec-8 RNAi משלב L4 ואילך במהלך ההזדווגות. זני טטרפלואידים אושרו על ידי סינון נוכחותם של 12 זוגות כרומוזומים שנמצאו בביציות של הרמפרודיטים טטרפלואידים בהשוואה לשישה זוגות כרומוזומים שנמצאו בביציות של הרמפרודיטים דיפלואידים. זוהו שני טיפוסים של הרמפרודיטים טטרפלואידים.
אחד גידל זכרים בתדירות דומה להרמפרודיטים דיפלואידים והשני גידל זכרים בתדירות גבוהה בהרבה. הראשון הוא טטרפלואיד עבור כל הכרומוזומים והשני הוא טטרפלואיד עבור כל האוטוזומים אך הוא טריפלואידי עבור כרומוזום המין. זני טטרפלואידים גדלים לאט יותר ומייצרים דגים קטנים יותר.
בדיקה שטחית של זני הטטרפלואידים לא חשפה מספרים גבוהים מספיק של ביציות אנופלואידיות או חלוקות ביציות או זרע חריגות כדי להסביר את הירידה שנצפתה בגודל הדגים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן ההתפתחותי והביולוגיה האבולוציונית לחקור את תפקידה של פוליפלואידיזציה של גנום שלם על מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. בעת שימוש בטכניקה זו, חשוב לזכור להשתמש תמיד בלוחות NGM IPTG טריים כדי לגרום לביטוי חיידקי של RNA דו-גדילי.
אם הכל ילך כשורה, ניתן לייצר טטרפלואידים תוך פחות משלושה שבועות.
סקירה
מתודולוגיה זו מאפשרת את יצירתם של נמטודות Caenorhabditis טטרפלואידיות ותלת-פלואידיות יציבות מכל זן דיפלואידי. היא שימושית במיוחד לחקר תפקידה של פוליפלואידיזציה של הגנום השלם בתהליכים ביולוגיים שונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה אבולוציונית
- ביולוגיה של סרטן
רקע
- פוליפלואידיזציה של הגנום השלם יכולה להשפיע על מינון הגנים והסקלינג הביולוגי.
- שיטה זו היא השיטה היחידה הקיימת להפקת טטרפלואידים יציבים ופוריים מכל זן דיפלואידי.
- מחקר על מוטציות rec-8 הוביל לפיתוח המתודולוגיה הזו.
- זנים פולפלואידים שימשו לחקר אינטראקציות כרומוזומים במהלך פרופזה מיוטית.
מטרת המחקר
- להפיק זנים טטרפלואידים יציבים מנמטודות דיפלואידיות.
- לחקור את התוצאות של פוליפלואידיזציה של הגנום השלם.
- לחקור מנגנונים של היווצרות מינים והסתגלות ללחץ.
שיטות ששימשו
- גירוי של ביטוי RNA כפול הגדיל של rec-8 באשלריה קולי.
- הכנת צלחות אגר NGM לתרבות חיידקים.
- העברה של הרמפרודיטים צעירים לצלחות חיידקי rec-8 RNAi.
- אימות של זנים טטרפלואידים על ידי ספירת גופים צבועי DAPI באוציטים.
תוצאות עיקריות
- נוצרו בהצלחה זנים טטרפלואידים מרובים.
- זנים טטרפלואידים הציגו 12 זוגות כרומוזומים באוציטים.
- תצפתרו תדירויות שונות של צאצאים זכריים בהרמפרודיטים טטרפלואידים.
- הושגה ריבוי יציב של זנים טטרפלואידים באמצעות הפריה עצמית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה אמינה להפקת נמטודות פולפלואידיות.
- היא פותחת אפשרויות לחקר שאלות ביולוגיות יסודיות.
- מחקר נוסף יכול לחקור את ההשלכות של פוליפלואידיזציה בתחומים שונים.
