הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

המטרה הכוללת של הטכניקות הבאות היא להכשיר חוקרים מתחילים לעבוד עם Streptomyces ומינים קשורים אחרים במעבדת ההוראה באוניברסיטה ובכיתות תיכון. תצפית פנוטיפית חשובה לחוקרים הרבים הנכנסים לתחום מחקר הסטרפטומיצס. סרטון זה מתאר שיטות להתפשטות חיידקים, אחסון ובדיקה חזותית ומיקרוסקופית.

שיטות הפנוטיפיה המתוארות כאן משתמשות ב-Streptomyces coelicolor כמודל. עם זאת, השיטות ישימות לכל חברי הסוג הגדול כמו גם ל-Actinomyces הקרובים ביותר. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן נועדו להיות נגישות לחוקרים מתחילים בכיתת תיכון או במעבדת הוראה לתואר ראשון וכן לאנשי מעבדה מנוסים.

לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת הפרוטוקול הנלווה, חוקרים חדשים אמורים להיות מסוגלים לתפעל את זני הסטרפטומיצס שלהם, לאחסן אותם כראוי ולהתחיל בניסויי אפיון חזותי. מי שידגים את הנהלים יהיו גארט קנדל ושון קירק, תלמידי מחקר לתואר ראשון מהמעבדה שלי באוניברסיטת אוטרביין. כדי להתחיל, השתמש בשיטה סטנדרטית, כגון שיטת הפס הרביע שהודגמה ב-Saunders 2012 כדי לפספס זני Streptomyces על צלחות אגר MS ותרבית למושבות בודדות.

כל ארבעה עד שישה ימים, בחרו מושבה אחת והניחו אותה מחדש על צלחת טרייה. ככל שהמושבות מזדקנות, הן הופכות מועדות למוטציות אקראיות. לאחר ביצוע מוטגנזה על פי פרוטוקול הטקסט, שימו לב למורפולוגיה של המושבה עבור כל מוטציה בהשוואה לזן ההורים מסוג הבר.

בעת אפיון מיני Streptomyces חדשים, השווה את הבודד החדש לזה של מין שנחקר היטב תוך ציון הצורה הבסיסית, פני השטח של המושבה, האטימות, הגובה והפיגמנטציה. סמן צלחת אגר MS ופס זנים מסוג פרא ומוטנטי בדפוסי טריז. היזהר שאף זן לא ייגע בזן אחר כדי למנוע זיהום צולב.

שימו לב לתאריך ולשעה שבהם הזנים מפוספסים על הצלחת. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. זכור, חשוב ביותר להגן תמיד על דגימת הסטרפטומיצס שלך מפני זיהום.

השתמש בטכניקה הסטרילית הטובה ביותר שלך לכל השלבים, פתיחת צלחות וצינורות למשך הזמן הקצר ביותר האפשרי. מניחים צלחות פטרי מגודלות על נייר צבעוני או לבן כדי להפוך את הרקע להומוגניזציה. כתוב על הנייר את שם הזן, התאריך, טמפרטורת הדגירה והשעה מהפסים של הצלחת הראשונה.

צלם תמונות דיגיטליות של הצלחת עם מידע המתח כתוב על רקע הנייר כך שהבלבול יהיה מינימלי. עקר פינצטה על ידי שטיפתן באתנול 70% ולאחר מכן העברתן דרך להבת מבער בונסן כדי לאדות את האתנול. עקרו את הכיסויים על ידי שטיפתם באתנול 70% ולאחר מכן הניחו להם להתייבש בצלחת פטרי סטרילית.

לאחר מכן, כדי להכין הרמת כיסוי של גידול חיידקים, השתמש בפינצטה סטרילית כדי להרים כיסוי סטרילי ולהניח את הכיסוי על צלחת אגר MS שבה גידול החיידקים צפוף. בעזרת פינצטה, לחץ בעדינות על גב הכיסוי כדי להבטיח העברה מספקת של נבגי חיידקים ותפטיר אווירי. הרם את הכיסוי מהצלחת והנח אותו בזווית של 45 מעלות כשחומר התא פונה לפני השטח של שקופית מיקרוסקופ המכילה טיפה של 15 מיקרוליטר של 50% גליצרול.

אפשר לכיסוי ליפול על הגליצרול, מה שיפחית את בועות האוויר. כדי לבצע מיקרוסקופ ניגודיות פאזה במרווחי זמן שונים, הנח את השקופית המוכנה על שלב המיקרוסקופ והוסף טיפת שמן טבילה למרכז הכיסוי. סובב את מטרת הפאזה פי 100 במקומה והגדר את צריח המעבה להגדרת השלב התואמת המתאימה.

לאחר שעדשת האובייקט נמצאת במגע עם השמן, השתמש רק בכפתור הכוונון העדין כדי למקד את התמונה. בחנו מספר שדות ראייה כדי להבחין בהבדלים ניכרים ועקביים בין זני מוטנטים לסוג הפראי. כגון היכולת ליצור נבגים, גודל וצורת הנבגים והמספר הכולל של הנבגים.

בעזרת פינצטה סטרילית, הכינו מעלית כיסוי מצלחת אגר MS כמו קודם במקום בו ניכרת צמיחת חיידקים ונגעו בעדינות בחלק האחורי של הכיסוי עם הפינצטה כדי להבטיח העברה מספקת של נבגי חיידקים וחוטי אוויר. הרם את הכיסוי מהצלחת והנח אותו על מלאי הכרטיסים כך שהצד עם חומר התא פונה כלפי מעלה כדי להקל ולתפעל את הכיסוי. עם מתנול קר כקרח, הציפו את הכיסוי ותנו לו לשבת במשך חמש דקות.

באמצעות PBS שטפו את הכיסוי פעמיים על ידי חלוקה עדינה והסרה של התמיסה. הוסף 15 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם לתמיסת יודיד פרופידיום מיליליטר ו/או 10 מיקרוגרם למיליליטר של WGA-FITC לשקופית. הנח את הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על טיפת כתם פלורסנט.

דגרו את הדגימות בחדר חשוך או מואר עמום למשך 15 דקות. יש להגן על מלאי הכתמים הפלואורסצנטיים ודגימות הכתמים מפני האור. מומלץ לחוקרים להשתמש בתנאים של תאורה חלשה בזמן הכנת הדגימות ולהשתמש בקופסה חשוכה כדי להחזיק דגימות לאחר הכנתן.

התבונן בשקופיות תחת עדשת אובייקטיבית פי 100 באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ DIC המצויד בקוביות עירור אפיפלואורסצנטיות עבור פרופידיום יודיד ו-FITC. נתח את התמונות לפי פרוטוקול הטקסט. מוצגות כאן דוגמאות למוטציות Streptomyces הנובעות ממוטגנזה של טרנספוזון.

תפטיר אווירי בצבע בהיר יותר עשוי להצביע על רמה נמוכה יותר של פיגמנט אפור הנגרם על ידי פגם בנבגים. או שהיעדר מראה מטושטש מעיד על גוש בהיווצרות תפטיר אווירי. כפי שניתן לראות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מושבות S.coelicolor מסוג בר מייצרות בדרך כלל תפטיר אווירי על ידי כיומיים של צמיחה.

ושרשראות ארוכות של נבגים בשלושה ימי צמיחה. מוטציות לבנות עשויות להתעכב לצורך היווצרות נבגים, להראות ירידה בשפע הנבגים המיוצרים, לייצר נבגים עם פגמים בצורתם או בגודל או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט הנבגים האפור הבוגר. מוצג כאן באמצעות DIC ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם צביעת PI, צביעה במרווחים קבועים עבור שרשרת נבגים בדגימה מסוג בר מושווה לדפוס הצביעה לסירוגין עבור שתי מוטציות החדרת טרנספוזון המציגות פגם בהפרדת כרומוזומים.

שימוש ב-WGA-FITC כדי להכתים את דופן התא מסוג פרא S.venezuelae קיים כחוטי אוויר חלקים בין שרשראות הנבגים. ומציג את המערך הרוחבי דמוי מחיצות החלוקה שנראות בדרך כלל במהלך נבגים. עבודה עם אורגניזם חוטי שונה מאוד מעבודה עם חיידקים ידועים בצורת מוט.

פרוטוקולי הווידיאו כאן אמורים לשמש כמשאב חשוב לחוקרים חדשים לגמרי הנכנסים לתחום מחקר הסטרפטומיצס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להתחיל לחקור מיני Streptomyces וחיידקים קשורים אחרים. לאחר הניסויים הראשוניים הללו, ניתן להשתמש במגוון טכניקות במעבדת מחקר כדי ללמוד עוד על זני הסטרפטומיצס שלך.

לדוגמה, חלק מהטכניקות המתקדמות עשויות להיות תיוג חלבונים או ניתוחי ביטוי גנים כגון PCR ו-RNA בזמן אמת. ניסויי פנוטיפ ראשוניים משמשים לזיהוי ואפיון זנים חדשים ולהבחנה בתפקיד האופייני של גן מסוים. שיטות אלה כבר שימשו במעבדות הוראה באוניברסיטאות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של זני Streptomyces.