Name: הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: למד שיטות הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות בחיידקי Streptomyces. פרוטוקולים אלה מאפשרים לאנשי מחקר מתחילים לטפח זנים ולזהות הבדלים מורפולוגיים בין טיפוסי בר למוטנטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר Otterbein אוניברסיטת מענקי מחקר של סטודנטים לתואר ראשון, תלמיד מחקר קרן פרסים GVK, SGK; האנדרטה פרופסור גילברט אי מילס Otterbein ניחן פרס תוכנית שבתון, המחלקה לביולוגיה, מדעי כדור הארץ סגל מחקר ולמדנות ניחן פרס מכה. ברט וקרן ג'יין קרן ניחן תלמיד מחקר במדעי הוענק GVK ו- SGK. המחברים גם רוצה להכיר בהכרת תודה שדוקיין האוניברסיטה במימון מלגות תוכנית מחקר לתואר ראשון עבור GVK ו- SGK. תלמידי מחקר לתואר ראשון לשעבר Juniata קולג ', ריאן ג'ונסון ודרייפר לינדסי תרם את התמונות במיקרוסקופ על דמויות 2 ו- 3, בהתאמה.

1. מכינים כלי נגינה, תרבות המדיה, פתרונות, צלחות פטרי
<ol><li>אוטוקלב קיסמים בתוך 50 מ ל מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי לשמור על סטריליות.</li>
	<li>לעקר כל אבזרי זה יהיה בשימוש החיטוי (טיפים, מקלות, כלי זכוכית, וכו '). הערה: זהירות! בצע את ההוראות כל בטיחות עבור דגם אוטוקלב בשימוש. אוטוקלאבים להוות סיכון פיצוצים, כוויות אדים, מגע עם משטחים חמים, חומרים, מדיה. אוטוקלב בטיחות, להציג "שימוש נאות של אוטוקלאבים"34.</li>
	<li>
הכינו MS אגר (מניטול סויה קמח (SFM))14 לגדול תרבויות.
	<ol>
<li>להוסיף 5 g של קמח סויה, 5 g של אגר בקבוק 1 ליטר.</li>
		<li>להמיס 5 גר' מניטול ב 250 מ של מי ברז, לוותר על תוך הבקבוק המכילות את קמח הסויה ואת אגר.</li>
		<li>להוסיף את קצף תקע ו רדיד אלומיניום לפתיחה של הבקבוק, החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך לפחות 30 דקות. התראה: בינוני שחין בקלות. השתמש בקבוקון שיכול להכיל לפחות ארבע פעמים נפח בפועל של MS אגר להיות בלוק. סיר לחץ סטנדרטי יכול לשמש במקום החיטוי עם שיקולי בטיחות דומה. לחלופין, ניתן להשתמש תנור מיקרוגל לחטא מדיה וחומרים אם גישה החיטוי אינו אפשרי35,36. מורים בתיכון ייתכן שתרצה גם לשתף פעולה עם מקומיים מכללות או אוניברסיטאות לגשת אספקה בלוק.</li>
		<li>מדיה מגניב עד נוח מספיק כדי להתמודד. להיזהר לא לצנן את זה במשך זמן רב מדי, כי אגר עפור בטמפרטורה שמתחת 50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שופכים את MS אגר מ הבקבוק לתוך צלחות פטרי סטריליות עד בתחתית כל צלחת פטרי הוא בערך חצי מלא (כ 25 מ"ל של מדיה לכל צלחת פטרי). אפשר לגבש לפני השימוש פלטות אגר. חנות פלטות אגר בשקית ניילון בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש. הערה: פלטות אגר גם ניתן לאחסן במקרר, במיוחד אם אנטיביוטיקה יש צורך בכלי התקשורת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רצף Streptomyces על גבי לוחות עבור הפצת
<ol><li>זני Streptomyces פס על גבי פלטות אגר MS למושבות יחיד באמצעות שיטה סטנדרטית, כגון המשולש צובעות שיטה כפי שמוצג סנדרס, 201237. הערה: ללולאה לחסן או קיסמים סטרילי עשוי לשמש. אופציונלי: מדיה אחרים משמשים עבור מינים Streptomyces , כגון R2YE ותקשורתי מזערי14.</li>
	<li>דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>Restreak הצלחות על-ידי בחירת שמושבה בודדת כל 4-6 ימים. כמו מושבות גיל שהם הופכים נוטה מוטציה אקראית.</li>
</ol>3. ליצור את מניות Mycelial גליצרול לאחסון חיידקי
הערה: Mycelial מניות יהיה ליצור עבור כל זני Streptomyces , כולל בעת שנסע בנין זנים, ואת מוטאנטים התפתחותיים אחרים, כי הם אפשרות להשלים הנבגה.
<ol><li>Macerate 15-20 מושבות ב 200-500 µL של גליצרול 20% שימוש של המוליך פינים מעץ סטרילי.</li>
	<li>להעביר את slurry של המושבות התמוסס 1.5 mL מקפיא תרבות צינור, באמצעות micropipette או פיפטה העברה סטרילי. הערה: היסודות של שימוש micropipette מכוסים במקום38.</li>
	<li>להוסיף גליצרול 20% מספיק כדי להפוך את עוצמת הקול הסופי 1 מ"ל ומערבבים בעדינות. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: זהירות! כפפות בטיחות קריוגני שימוש, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>4. ליצור גליצרול נבג מניות עבור זנים מסוגל הנבגה
הערה: נבג מניות עדיפים הכדאיות לטווח ארוך אבל רק ריאלי עבור זנים המסוגלים השלמת הנבגה.
<ol><li>
מורחים µL 100 התמוסס חומר (מתוך שלב 3.1) על צלחת אגר להשיג דשא confluent של צמיחה37. הערה: התפשטות ציפוי מוצג סנדרס37 (שינוי: מסתובב אינה נדרשת.). הלוח ניתן להפעיל ביד אחת תוך שימוש ביד האחרת כדי להזיז את מפזר באופן עדין הלוך תנועה על פני התקשורת אגר.<ol>
<li>Pipet 100 µL של תפטיר התמוסס למרכז צלחת אגר MS.</li>
		<li>לחטא של זכוכית או מתכת הפצת הכלי על ידי חלקית השוקע 70% אתנול ולהעביר את מפזר פעם לאט דרך להבה מבער בונזן לזרז האידוי של האתנול. התראה: אתנול הוא דליק. אין למקם את מפזר בוערים אתנול או לאפשר על ירידה הבוערים של אתנול ליפול לתוך המנה אתנול. לחלופין, השתמש ספוגית כותנה סטרילי חד פעמיות כדי להפיץ את החיידקים בצלחת, אשר דורשת אתנול או להבה.</li>
		<li>התור אגר MS צלחת עם יד אחת, תוך שימוש גב ותנועה הלאה כדי לחסן את הצלחת עם מפזר סטרילי.</li>
		<li>תקופת דגירה של 5 – 7 ימים ב- 30 ° C עד המתח sporulated היטב. הערה: הדגירה פעמים ישתנה בהתאם המין ואת המתח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ ל תמיסת סטרילית (0.8% NaCl) למרכז של מדשאה confluent של תאים Streptomyces עבר הנבגה.</li>
	<li>הקציר נבגים על ידי שפשוף בעדינות את פני השטח של תפטיר עם סטרילי מזריקים לולאה (או במקלון צמר גפן), לאט לאט נע לכיוון הקצה של הדשא.</li>
	<li>Pipet מלוחים המכילים נבגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת נמרצות כדי לפרוץ נבג שרשראות תאים בודדים.</li>
	<li>צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב x כ 2500 גרם.</li>
	<li>Pipet תגובת שיקוע, להשליך. לפזר בגדר נבג על ידי מערבולת נמרצת עצבנות סכום קטן של הנוזל הנותר.</li>
	<li>Resuspend הנבגים ב 1 מ"ל של גליצרול 20% על ידי ציור הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה.</li>
	<li>העברת המניות נבג גליצרול צינור מקפיא 1.5 mL. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: שימוש כפפות בטיחות קריוגני, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה של הכדאיות בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>5. ביצוע מוטגנזה מכוונת
<ol><li>לבצע מוטגנזה מכוונת בהתבסס על התוצאה הרצויה כמו המופנה מבוא ונבדקים לאחרונה על ידי Baltz, 201639. הערה: ניסויים phenotyping לא יחייבו את מוטגנזה מכוונת, כגון כוונה לזהות מינים חדשים מן הסביבה. שיטות מוטגנזה מכוונת אקראי כוללות השימוש של transposon8,9,10,11,12,13, קרינת UV, או כימיקלים14. האתר מכוון מוטגנזה מכוונת15,16,17,18,19,20 טכניקות יכול לשמש ליצירת מוטציות נקודה ספציפית, מחיקות, או סוגים אחרים של מוטציות.</li>
</ol>6. להשוות ולהקליט את המראה החזותי
<ol><li>שימו לב המושבה מורפולוגיה עבור כל מוטציה לעומת המתח פראי-סוג האב אחרי שהתרוצץ כל זנים כמו שלב 2. להשוות את בידוד חדשים לזה של זן למד היטב, כגון ס' coelicolor או S. venezuelae, בעת אפיון של זנים חדשים של Streptomyces . הערה המאפיינים (איור 1) כגון הצורה הבסיסית, משטח המושבה (מטושטש, קירח, מקומט, וכו), אטימות, העלאת ופיגמנטציה (להבדיל בין תפטיר וגטטיבי, תפטיר אווירי, ו/או בינוני שמסביב).</li>
	<li>תווית של אגר MS זנים פראי-סוג של מוטציה צלחת, פס בדפוסי טריז (איור 1). להיזהר כי זן לא נוגע עוד מאמץ כדי למנוע זיהום לחצות. הערה את התאריך והשעה שבהם זנים הם קווצות שער לצלחת. דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>המקום גדל פטרי בצבע או נייר לבן כדי homogenize את הרקע. לכתוב על נייר שם זן, תאריך, בטמפרטורת דגירה, זמן בצלחת הראשונה ומבטא. קח תמונות דיגיטליות של הצלחת עם המידע האחרון נכתב על רקע נייר כך בלבול הוא ממוזער. הערה: הכתיבה יכול להיחתך מן התצלום במועד מאוחר יותר אם זה שישמש עבור איור הכנה.</li>
</ol>7. ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה 70% אתנול, ואז עובר להבה מבער בונזן מתמוססות האתנול. לאפשר להתקרר.</li>
	<li>לחטא coverslips על ידי שטיפה אתנול 70% ומאפשר להם להתייבש בצלחת פטרי סטריליות אז.</li>
	<li>
להכין טרמפ coverslip של הגידול חיידקי להיבדק.
	<ol>
<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי ולמקם את coverslip על צלחת אגר MS איפה צפופה התפתחות חיידקים. לחץ על גב coverslip בעדינות עם פינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, תפטיר אווירי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה לכיוון פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, עם טיפת 15 µL גליצרול 50% במים מוכנים הרכבה. להפחית את בועות אוויר על-ידי הצבת את coverslip בזווית של 45° לשקופית ולתת לו ליפול על גבי גליצרול 50%.</li>
	<li>(אופציונלי) חותם עם נקי לק לשימור של השקופית.</li>
	<li>
ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי פרוליך40 במרווחי זמן שונים במהלך מחזורי החיים. הערה: הדמיה חוזרות מאפשר ניתוח מלא יותר את היכולת לזהות את עיכוב בהתפתחות. באופן עצמאי חזור על התצפיות כדי להבטיח דיוק הפארמצבטית.<ol>
<li>למקם את השקופית מוכנים על הבמה מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של שמן טבילה למרכז של תגית כיסוי. לסובב את שלב X 100 מטרת למקם ולהגדיר צריח מעבה את הרקע המתאים שלב "תואמים". למקד את התמונה באמצעות רק הידית התאמת משובח פעם העדשה אובייקטיבית הוא במגע עם השמן.</li>
		<li>בחן מספר שדות ראייה להבחין ההבדלים ניכרת ועקבית בין זנים מוטציה לסוג הפראי, כגון היכולת טופס נבגים, נבג ו צורה בגודל המספר הכולל של נבגים (ראה איור 2). הערה: חלופות במיקרוסקופ ניגוד שלב כוללים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) מיקרוסקופיה40 , טכניקות צביעת פשוטה עבור שימוש עם שדה בהיר מיקרוסקופים41, כגון צביעת קריסטל ויולט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ביצוע מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה אתנול 70% ולאחר מכן הפעלה דרך להבה מבער בונזן.</li>
	<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי והמקום על צלחת אגר MS שבו ניכרת התפתחות חיידקים. לגעת בגב coverslip בעדינות עם הפינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, חוטים אווירי.</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה למעלה, על כרטיסים על מנת להקל על מניפולציה של coverslip.</li>
	<li>להציף את coverslip עם מתנול כקרח (~ 300 µL עבור coverslip2 20 x 20 מ מ) ולתת לו לחלוטין אוויר יבש. זהירות: מתנול היא מוטגן. יש להימנע ממגע ישיר עם העור.</li>
	<li>לשטוף את coverslip שלוש פעמים פוספט Buffered מלוחים (PBS)42 על ידי בעדינות dispensing והסרה של הפתרון.</li>
	<li>להוסיף 15 µL של 100 μg/ml יודיד Propidium ו/או μg/מ"ל נבט-חיטה-Agglutinin מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) שבוצעו ב- 50% גליצרול שקופית שכותרתו מיקרוסקופ. הערה: Propidium יודיד כתמי DNA אדום כדי לזהות בהכפלת ה-DNA מיקום בזמן WGA-FITC כתמי קיר התא הירוק.</li>
	<li>היפוך coverslip עם הפנים כלפי מטה על גבי הירידה של הכתם פלורסנט בשקופית זכוכית. (אופציונלי) חותם עם לק ברורים לשימור של שקופית.  כמו הצבעים הם רגישים לאור, תקופת דגירה של 15 דקות בחדר החשוך או בתאורה עמומה.</li>
	<li>לצפות בשקופיות תחת עדשת 100 X המטרה באמצעות ניגוד שלב או מיקרוסקופ DIC מצויד epifluorescence עירור קוביות propidium יודיד (להגדיר מסנן 'טקסס אדום' או maxima עירור/פליטת 535/617 nm), FITC (FITC לסנן nm לקבוע או 490/525 maxima עירור/פליטה).</li>
	<li>במקום השקופית על הבמה ונוחות שימוש את ידיות התאמת בסדר וגסים.</li>
	<li>להתבונן על ידי קרינה פלואורסצנטית כפי שמוצג במקום43.</li>
	<li>השתמש חבילת תוכנה של תמונה חופשית ניתוח שיכול לעזור בזיהוי נבגים עם פלורסצנטיות נמוך העוצמה44.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור מתחילים Streptomyces החוקרים ליזום מחקרים על-ידי הכללת השלבים הדרושים כדי להפיץ זנים ולהכין מניות לאחסון לטווח ארוך. לאחר מכן נתאר את הפרוטוקולים עבור אפיון ויזואלי, מיקרוסקופיים של זנים Streptomyces . כמה צעדים הראשונית טיפוסי phenotyping התפתחותית המוטציות הן: 1) בדיקה חזותית של המושבות מוטציה בהשוואה פראי סוג המושבות של אגר בינוני; 2) מיקרוסקופ שלב חדות; ו 3) זריחה מיקרוסקופיה של sporogenic hyphae אווירית. בהתבסס על פנוטיפ מוצגים שלושה שלבים אלה, במגוון טכניקות עשוי להיות מועסק להבחין נוספת של פנוטיפ למתח מסוים.
Phenotyping הראשונית ניסויים משמשים כדי לאפיין מינים חדשים, לזהות מוטציות של עניין, חלקית לאפיין מוטציות, ולהתחיל להבחין את התפקיד טיפוסי של גן מסוים על סמך על פנוטיפ של מזוהה מוטציה. כבר בשימוש בשיטות המתוארות כאן באוניברסיטה מלמד מעבדות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של מוטציות Streptomyces , כולל אלה בעלי פגמים בחלוקת התא48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54הנבגה55,56, תפטיר אווירי היווצרות57,58, ייצור לאנטיביוטיקה59, השליח השני איתות47, כרומוזום סגרגציה 60. שיטות אלה צעדים חיוניים לקביעת של פנוטיפ של מוטציות באופן כללי ולחשוף את כמות גדולה של מידע חשוב אודות התפקידים של הגנים של עניין. השיטות בקלות יורחב כדי מינים אחרים של Streptomyces , כבר השתמשו כדי לתאר את זני תזונתם העיקרי ס, ס venezuelae, גרדת סו streptomycetes רבים אחרים. הפרוטוקולים וידאו המתוארים כאן צפויים לשמש משאב חשוב עבור חוקרים חדשים נכנסים תחומי מחקר Streptomyces , כמו למשל בתחום גילוי תרופות. זה כולל את המדריכים החדשים אשר עובדים כדי להתמודד עם המשבר עמידות לאנטיביוטיקה ולחנך את מספרי אינספור של חוקרים הסטודנטים לתואר ראשון חדשים מצטרפים המאמצים מיקור המונים של היוזמה עולם קטן.
מהטכניקות שתוארו כאן ניתן בקלות להתאים לשימוש בכיתה במכללה ובתיכון בנוסף מעבדות מחקר, באמצעות השינויים המתוארים וידאו, טקסט. סטודנטים במודול מיקרוסקופ השנה הראשונה במכללה קטנה שבע האמנויות החופשיות הצליחו צובעות זנים, לקחת תמונות דיגיטליות של זנים גדל על אגר מדיה, ולבצע מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, זריחה, אשר הגיע לשיאו הגשת תיק של דמויות רב ספון בקצה של המודול 3 בשבוע, המייצג h 15 של עבודה בבית-lab. כ 160 לתלמידי השנה הראשונה היו אחראים phenotyping הראשונית של מוטציות transposon הרומן 320. תלמידי מחקר לתואר ראשון במוסדות שלושה השתתפו את phenotyping הראשוני של מוטציות נוספות ואפיון עוקבות של הזנים רבים. הנתונים מקיף שהושג תוך תקופה קצרה יחסית של זמן, ממחישים את הערך של הפרוטוקולים המתוארים כאן. מאות מוטציות נוספות אוחסנו גליצרול מניות mycelial של אפיון בעתיד.
בעקבות הניסויים הראשוניים המתוארים כאן, מגוון שיטות עשוי להיות מועסק כדי להאריך את האיכות של מידע המתייחס זנים מעניינים. אם המוטציה אינם ידועים, שיטה genotyping צריך להיות מועסק כדי לקבוע את סוג ו/או מיקום המוטציה. לדוגמה, transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת פראי-סוג כרומוזום6,7,8,9,10,11,12,13 תוצאות במושבות צריך עוברים הראשונית פנוטיפי במסכים כגון מהמתואר לעיל. אז המיקום של transposon צריכה להיות מזוהה באמצעות טכניקה כגון פולימראז הופכי תגובת שרשרת (iPCR)61. קביעת של גנוטיפ של מוטציות שהתגלתה היא צעד חשוב בעקבות משלב האפיון הראשוני.
כמה שיטות מתקדמות נפוץ לניתוח phenotyping הבאים עשויים להיות הזכיר בכיתה או חקר באמצעות מחקרי המשך כוללים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג כדי לקבוע תבניות לוקליזציה עבור החלבון של עניין, ג'ין ביטוי ניתוחים כגון נדל בפעם ה-PCR כמותי (qPCR) ודפוסי ביטוי גנים הכללית של פראי-סוג לעומת מוטציה באמצעות ה-RNA רצף (RNA-seq). Phenotyping מיומנויות נדרשות גם לניתוח קומפלמנטציה גנטי. בניסוי קומפלמנטציה, העותק פראי-סוג של גנים מוחדרים זן שעבר שינוי כדי לקבוע אם אלל שנוספו לאחרונה יכול לפצות על האובדן-של-הפונקציה של אלל מוטציה. השוואת של פנוטיפ של המתח המלווים לזה של המוטציה המקורי והן את ההורים, פראי-סוג מאמץ נדרש.

Streptomycetes הם חיידקים גראם חיוביים, filamentous קרקע ידועה וביכולתם לייצר מגוון של מטבוליטים משניים, כולל שני שלישים של אנטיביוטיקה זמין מסחרית, כמו גם כמה אנטי הגידול, תרופות נגד איידס, ואני נגד טפילים 1. ס coelicolor הוא החבר מאופיין ביותר גנטית של סוג2,3 , והוא המין בשימוש בשיטות המתוארות כאן. ס coelicolor יש מחזור חיים מורכב מתחיל עם הנביטה של נבג יחיד, ומתחזקים נרחב, מסעף תפטיר צמח שגדל לתוך המדיום אגר. כל מחזור החיים של התמורה, חוטים אווירי נוצרות לשבור את מתח הפנים של תפטיר המצע, סוף סוף מחולקים שרשראות ארוכות של תאים מומרים בסופו של דבר נבגים בוגרת, גריי-פיגמנט. פיזור של נבגים שהוקם אלה מהווה את תחילת מחזור החיים הבא4.
בגלל שלה דפוס מורכבות של בידול, ס coelicolor משמש מודל מצוין עבור חקר התפתחות חיידקים. מבחינה היסטורית, מוטציות כתוצאה בבלוקים עבור שני שלבים עיקריים של פיתוח ומפיקים פנוטיפים חזותיים ברורים. המוטציות (קירח) בנין נחסמות על היווצרות תפטיר אווירי ולהוביל חוסר תפטיר אוויר מעורפל להקניית מראה המושבה "קירח". מוטציות עכבות במבנה נבג, ההבשלה מכונים מוטציות הל (לבן) כי הם בדרך כלל נכשלים לייצר רמות פראי-סוג של הפיגמנט נבג אפור תפטיר אוויר נשאר לבן. מוטאנטים מעניינים אחרים הם והשרירי לאנטיביוטיקה ייצור, חלוקת התא, סגרגציה כרומוזום או תהליכים חשובים אחרים,4,5.
למרות גילוי גנים התפתחותיים רבים במינים Streptomyces , ישנם רבים יותר האמינו להתקיים בהתבסס על חוסר הרוויה של מסכי מוטציה. מעבדות שלנו להמשיך לזהות גנים התפתחותיים חדשים באמצעות מערכת transposon מיני ואנחנו יש נבנה. הרומן זנים מוטציה מבודד בניסויים מוטגנזה מכוונת אקראי עם transposon שלנו עוברים סינון פנוטיפי כדי לזהות את תפקיד אפשרי של כל חדש ג'ין גילה6,7. שיטות phenotyping חיידקי המתוארים כאן הרלוונטיים מוטציות Streptomyces מבודדים-transposon מוטגנזה מכוונת8,9,10,11,12, 13 ו אקראית בשיטות אחרות, כגון כימי, אולטרה סגול (UV) מוטגנזה מכוונת14, כמו גם בנייה בבימויו של מוטציות כגון מחיקות הגן באמצעות15,recombineering16 או CRISPR-Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) הגנום עריכה טכנולוגיה17,18,19 ו מוטציות נקודה20.
עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים הופך נפוץ יותר ויותר, הצורך אנטיביוטיקה חדשה הופך יותר ויותר דחוף21,22. "היוזמה עולם קטן" (או מושכל) הוא יעיל המדע, טכנולוגיה, הנדסה, מתמטיקה (גזע) למידה23 ומחקר אסטרטגיה24 כדי להילחם עמידות לאנטיביוטיקה דרך מיקור המונים של סטודנטים, ועוד לאחרונה תלמידי תיכון. תמיכה קורסים עבודתו כוללת זיהוי חיידקים אדמה חדשה לייצר אנטיביוטיקה הרומן (http://www.smallworldinitiative.org). הוא האמין כי המקור העיקרי של אנטיביוטיקה שעדיין לא התגלו ימשיכו להיות Streptomyces מינים נמצאו במגוון רחב של אדמה ומים בתי גידול25,26,27,28, 29,31. לאחרונה, המעבדה שלנו עבודתם של אחרים גילו והם יהיו מאופיין איתות גנים במינים Streptomyces המסדירים מורפולוגיה ופיתוח, לרבות ייצור לאנטיביוטיקה7,32. 33. שינויים בביטוי הגנים האלה לגרום שינוי הכמות ואת העיתוי של אנטיביוטיקה המיוצר. Phenotyping מיומן של מינים חדשים, המוטנטים מייצרי אנטיביוטיקה החדשים ימשיכו להיות חשוב. כמו מדריכים חדשים ותלמידים שלהם להיות התורמים העיקריים בתחום של גילוי תרופות, הכשרה phenotyping חיידקי הוא הכרחי עבור ההצלחה של אנשים אלה המתחיל. יתר על כן, הניסויים האלה הם צייתן בתיכון גזע או אוניברסיטת מיקרוביולוגיה החינוך מעבדות. הם מייצגים הפגנה של עקרונות יסוד גנטי מיקרוביאלי מעבדת הוראה הגדרת.

<table><tbody><tr><td>50% גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה (סוג DF)</td><td>קרגיל&nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>נייר עדשה</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr>קיסמים <td></td> P1304MP <td></td><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>(שטוח)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה (10 מ"ל)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה (200 מ"ל)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה (1,250 מ"ל)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים מעץ 6''</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>צמר גפן ספוגיות</td><td>פישרברנד</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>קמח סויה&nbsp;</td><td>הטחנה האדומה של בוב&nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול 100%</td> <td>VWR אמרסקו מדעי החיים&nbsp;</td><td>0854-1 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (מי מלח)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>צינור מקפיא 1.2 מ"ל</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>נמוך במיוחד (-80 &deg; ג) מקפיא</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>כפפות בטיחות קריו</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי #1.5</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td><td>קרולינה</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>קרוליינה 624504</td><td></td><td></td>ביולוגי</tr><tr><td>מבער בונסן מתנול</td><td>706706</td><td></td><td>ביולוגי קרוליינה</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מלח מאגר פוספט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>BIOTIUM</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>תוכנה</td><td></td>חופשית</tr><tr><td>100 מ"ל</td><td>פיירקס ארה"ב</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 ליטר</td><td>קרולינה ביולוגית</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 ליטר בקבוק</td><td>פישרברנד</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק</td><td>פיירקס ארה"ב</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"ל צילינדר מדורג</td><td>קרולינה ביולוגית</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר בוגר 500 מ"ל&nbsp;</td><td>קרולינה ביולוגי</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>ערבוב בר</td><td>פישר מדעי</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה למיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>כפפות לבדיקת ניטריל (Med)</td> <td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת מערבולת מיקסר</td><td>קרולינה ביולוגית</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית streptomyces

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes הם חיידקים אדמה filamentous השייכת שלקרוא Actinobacteria פזורים ברחבי העולם, לייצר מגוון רחב של אנטיביוטיקה, מטבוליטים משניים אחרים. Streptomyces coelicolor הוא מין מאופיין היטב, פתוגניים שאינם זה לבצע מגוון רחב של ניתוחים במעבדה. Phenotyping בשיטות המתוארות כאן להשתמש ס coelicolor כמו streptomycete דגם; עם זאת, השיטות ישימות כל בני הסוג גדולים, כמו גם כמה actinomycetes הקשורים קשר הדוק. Phenotyping יש צורך לאפיין מינים חדשים של Streptomyces זיהה בסביבה, זה גם צעד ראשון חיוני באפיון לאחרונה מבודד מוטציה זנים של Streptomyces. מיומנות ב phenotyping חשוב עבור החוקרים חדשים רבים אשר נכנסים לשדה המחקר Streptomyces , כולל המחקר של התפתחות חיידקים, חלוקת התא, כרומוזום סגרגציה השליח השני איתות. מיקור המונים האחרונות של גילוי לאנטיביוטיקה תוך בידודו של חיידקים אדמה חדשה הביאה צורך בהכשרה phenotyping למדריכים החדשים בשטח המחקר Streptomyces , מכללה או תיכון שלהם מוגבר סטודנטים. כתב יד זה מתאר שיטות הפצת זן חיידקי, אחסון של אפיון באמצעות בדיקה חזותית, מיקרוסקופיים. לאחר קריאת מאמר זה, חוקרים חדשים (מעבדות מיקרוביולוגיה החינוך ומדענים אזרח) אמור להיות מסוגל לתמרן זנים Streptomyces ולהתחיל אפיון ויזואלי ניסויים.

Phenotyping הראשונית ניסויים נחוצים עבור אפיון מינים חדשים, זנים, יכול לשמש בגישה חינם פילוגנטיקה, DNA-DNA הכלאה ניסויים המשמשות לטיפול באפיון של זנים חדשים. Streptomyces מוטציות הנובעות מוטגנזה מכוונת אקראית בשיטות כגון כימיקלים, UV, או transposon מוטגנזה מכוונת מזוהים בדרך כלל דרך מסכי ישירה, חזותי על פלטות אגר. מושבות של Streptomyces נבדקים לשינויים בפנוטיפ לעומת המתח פראי-סוג, הורים. לדוגמה, תפטיר אווירי בצבע בהיר מצביעים על רמה נמוכה יותר של פיגמנט האפור הנגרם על ידי פגם הנבגה, או חוסר מראה מטושטש מעידה על חסימה במבנה תפטיר אווירי (איור 1). Streptomycetes רבים לייצר אנטיביוטיקה פיגמנט תפטיר וגטטיבי או אגר שמסביב. ס coelicolor מייצרת שני סוגי אנטיביוטיקה פיגמנט, כמו גם שני אלה ללא פיגמנט. Actinorhodin הוא אנטיביוטיקה-פיגמנט כחול והוא undecylprodigiosin45-פיגמנט אדום לאנטיביוטיקה. זנים שעברו ראשוני המושבה החזותית מסכי מופצים ואז על ידי ומבטא עבור מושבות יחיד.
בעקבות זיהוי חזותי של פוטנציאל מעניין מוטציות, זנים הם נתון בבדיקה מיקרוסקופית. שלב-ניגודיות מיקרוסקופ מתאימה במיוחד לבחינת Streptomyces מוטציות פגמים התפתחותית, באמצעות הלחץ פראי-סוג כפקד (איור 2). מושבות ס coelicolor פראי סוג בדרך כלל לייצר של תפטיר מהאוויר על ידי כיומיים של צמיחה ב 30 מעלות צלזיוס על אגר MS, שרשראות ארוכות של נבגים על ידי שלושה ימים של צמיחה. מחזור חיי יתפתחו מעט איטי או מהיר יותר על סוגי מדיה אחרים. זה הכרחי כי המוטציות לנתח בתנאים צמיחה אותו כסוג פראי בעת הסקת מסקנות על ליקויים התפתחותיים, עיכובים. מוטציות קירח עשויה לייצר נבגי לאחר צמיחה ממושכת במדיה אגר. מחלקה של מוטציות המכונה מוטציות לבן עשוי להתעכב גם על היווצרות נבג, להראות ירידה השפע של נבגים המיוצר, נבגים תוצרת עם פגמים צורה ו/או גודל, או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט ספורה בוגרת, אפור46 . מוטאנטים אחרים נחקרו עד כה מתעכבת או מואצת בהתקדמות מחזור החיים כגון המוטציות יושפע עבור ההצטברות של מולקולות (למשל, מחזורית-di-GMP47) איתות.
המשך פשוט הטכניקה מיקרוסקופ אור שתוארו לעיל היא מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות propidium יודיד הכתם בהכפלת ה-DNA nucleoids, agglutinin fluorescently שכותרתו נבט חיטה כתם בדופן התא הנבגה septa. נבגים חסר כרומוזום יהיה חסר יודיד propidium אדום מכתים, בעוד נבגים המכילים את הדנ א פחות מכפי הרגיל ניתן לזהות אם הם מופיעים כדי ירדו מכתים (איור 3). נבט חיטה agglutinin עשוי לשמש כדי להכתים את דופן התא, ייבחנו הבדלים דופן התא מכתים דפוסים (כלומר, חלוקת התא פגמים). בזן איור 4 הפראי-סוג של ס' venezuelae, זן לאחרונה משמשת כמודל עוד streptomycete בשל מחזור החיים מהיר יותר היכולת sporulate ב נוזלי45, יש נוטף WGA-FITC להבהיר המערך דמוי סולם של החטיבה septa שהם ראו בדרך כלל מוקדם במהלך הנבגה.
האסטרטגיות phenotyping הראשונית המתוארים כאן יביא הפעולות הבאות: 1) זיהוי זנים mutant הריבית ללימוד נוסף; 2) רכשה את הידע החשבונאי שזוהה ועל התפקיד הפוטנציאלי של גן זה יש כבר מוטציה; 3) ניסוח של סדרת השלבים הבאים ניסיוני יכול לשמש כדי להבהיר עוד יותר את התפקיד של הגן המדובר עוקבות. במקרה של streptomycete שזוהה מן הסביבה, החוקר יקבל ידע של מינים חדשים פוטנציאליים בהשוואה כבר מאופיין מינים של Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> איור 1: תצלום של צלחת אגר נציג הוכחת המושבה מאקרוסקופית פנוטיפים של S. coelicolor. צלחת אגר מראה מעורפל, אפור המראה החזותי של תפטיר אווירי עבור פראי-סוג coelicolor ס זן MT1110 (WT) בהשוואה transposon אקראיים שונים ההכנסה מוטציות עם פנוטיפים התפתחותית. מוטציות חסרים גם של תפטיר אווירי [קירח (בנין)] או של תפטיר אווירי עם פיגמנטציה נבג מופחתת [לבן (א)]. מוטציות transposon נוצרו באמצעות מיני-Tn5 עבור הכניסה מוטגנזה מכוונת6,7. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. צלחת פטרי קוטר 100 מ מ.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> איור 2: שלב-ניגודיות micrographs מציג נציג אווירי בשביל המוטציה S. coelicolor לבן זנים המכילים transposon אקראיים ההכנסה מוטציות. (א) מוצג הוא פילמנט אווירי נציג פראי סוג עבר חלוקות תאים סינכרונית, המרווחות באופן קבוע, ייצור אחיד בצורת, בגודל נבגים (MT1110). (B–F) הלוחות הנותרים מראים על הפנוטיפים מיקרוסקופיים שונה לחלוטין של מוטציות לבן שונים שהיו מבודדים באמצעות מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים. פאנל B מראה של פילמנט אווירי לא עבר הנבגה, אך במקום זאת הפיק בולטות שטחים בתוך חוט הלהט. חיצים ארוכים ב- C, Dו- F מציינים נבגים גדולה באופן חריג האופייניים של מוטציות MIC42, MIC43 ו- TH49. החץ קצר בחלונית D מציין דוגמה תא נבג lysed. פאנל E מראה התאים קטנים יותר בחלקו מכווץ האופייניים של הרשתות נבג המיוצר על ידי מוטציה TH10. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות אינן קשורות לאלו המוצגות באיור1. נבג פראי סוג הוא כ 1.1 מיקרומטר על ציר זמן. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> איור 3: נציג micrographs מראה coelicolor ס מוטציה כרומוזום פנוטיפים סגרגציה. (א) A תרשים ייצוג מראה פראי-סוג, המרווחות באופן קבוע צביעת במראה הטיפוסי של שרשרת של נבגים (כל נבג מכיל DNA כרומוזומלית) לעומת התבנית מכתימים לסירוגין עבור מוטנט המציג כרומוזום סגרגציה פגם. (B) לכל זוג פאנלים מראה הנבג באותה שרשרת שנצפה על ידי ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC) התמונה משמאל תמונת פלורסצנטיות שהוכתמו יודיד propidium מוצגת בצד הימין. פנוטיפ פראי-סוג (a, b) לעומת שתי מוטציות ההכנסה transposon אקראיים (c, d ו- e, f). חיצים מציינים נבגים ללא ה-DNA. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות המוצגות אינן קשורות לאלו איור 1 ו- 2 איור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> איור 4: זריחה micrograph של זן פראי-סוג venezuelae ס מוכתם WGA-FITC. (א) A תרשים של פילמנט אווירי מופיעה חלקה עם אין כניסות ויש סימנים נראים לעין הנבגה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהשוואה המערך דמוי סולם של צביעת קיר התא, זה מצביע על שלב מוקדם הנבגה החלה את הלהט אותו באמצעות WGA-FITC תחת מיקרוסקופ זריחה. Micrographs (B) של פראי-סוג venezuelae ס. חוטים אווירי חלקה () נמצאים בין שרשראות של נבגים. (b) במרחק תפטיר שמוצג בחלונית, אחד נימה אווירי בשלב מוקדם בהתפתחות הנו מערך דמוי סולם של דופן התא התצהיר. חיצים מציינים היווצרות המרווחות באופן קבוע של צלב-קירות מוכתמת WGA-FITC המתפתחים באופן סינכרוני בתוך פילמנט אווירי יחיד כמו זה עובר הנבגה הקשורים נכה. המתח היה גדל על MYM MYM (altoseמ', תמצית מזרח Y, תמצית alt מ') אגר במשך 38 h ב- 30 ° C. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

המטרה הכוללת של הטכניקות הבאות היא להכשיר חוקרים מתחילים לעבוד עם Streptomyces ומינים קשורים אחרים במעבדת ההוראה באוניברסיטה ובכיתות תיכון. תצפית פנוטיפית חשובה לחוקרים הרבים הנכנסים לתחום מחקר הסטרפטומיצס. סרטון זה מתאר שיטות להתפשטות חיידקים, אחסון ובדיקה חזותית ומיקרוסקופית.שיטות הפנוטיפיה המתוארות כאן משתמשות ב-Streptomyces coelicolor כמודל. עם זאת, השיטות ישימות לכל חברי הסוג הגדול כמו גם ל-Actinomyces הקרובים ביותר. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן נועדו להיות נגישות לחוקרים מתחילים בכיתת תיכון או במעבדת הוראה לתואר ראשון וכן לאנשי מעבדה מנוסים.לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת הפרוטוקול הנלווה, חוקרים חדשים אמורים להיות מסוגלים לתפעל את זני הסטרפטומיצס שלהם, לאחסן אותם כראוי ולהתחיל בניסויי אפיון חזותי. מי שידגים את הנהלים יהיו גארט קנדל ושון קירק, תלמידי מחקר לתואר ראשון מהמעבדה שלי באוניברסיטת אוטרביין. כדי להתחיל, השתמש בשיטה סטנדרטית, כגון שיטת הפס הרביע שהודגמה ב-Saunders 2012 כדי לפספס זני Streptomyces על צלחות אגר MS ותרבית למושבות בודדות.כל ארבעה עד שישה ימים, בחרו מושבה אחת והניחו אותה מחדש על צלחת טרייה. ככל שהמושבות מזדקנות, הן הופכות מועדות למוטציות אקראיות. לאחר ביצוע מוטגנזה על פי פרוטוקול הטקסט, שימו לב למורפולוגיה של המושבה עבור כל מוטציה בהשוואה לזן ההורים מסוג הבר.בעת אפיון מיני Streptomyces חדשים, השווה את הבודד החדש לזה של מין שנחקר היטב תוך ציון הצורה הבסיסית, פני השטח של המושבה, האטימות, הגובה והפיגמנטציה. סמן צלחת אגר MS ופס זנים מסוג פרא ומוטנטי בדפוסי טריז. היזהר שאף זן לא ייגע בזן אחר כדי למנוע זיהום צולב.שימו לב לתאריך ולשעה שבהם הזנים מפוספסים על הצלחת. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. זכור, חשוב ביותר להגן תמיד על דגימת הסטרפטומיצס שלך מפני זיהום.השתמש בטכניקה הסטרילית הטובה ביותר שלך לכל השלבים, פתיחת צלחות וצינורות למשך הזמן הקצר ביותר האפשרי. מניחים צלחות פטרי מגודלות על נייר צבעוני או לבן כדי להפוך את הרקע להומוגניזציה. כתוב על הנייר את שם הזן, התאריך, טמפרטורת הדגירה והשעה מהפסים של הצלחת הראשונה.צלם תמונות דיגיטליות של הצלחת עם מידע המתח כתוב על רקע הנייר כך שהבלבול יהיה מינימלי. עקר פינצטה על ידי שטיפתן באתנול 70% ולאחר מכן העברתן דרך להבת מבער בונסן כדי לאדות את האתנול. עקרו את הכיסויים על ידי שטיפתם באתנול 70% ולאחר מכן הניחו להם להתייבש בצלחת פטרי סטרילית.לאחר מכן, כדי להכין הרמת כיסוי של גידול חיידקים, השתמש בפינצטה סטרילית כדי להרים כיסוי סטרילי ולהניח את הכיסוי על צלחת אגר MS שבה גידול החיידקים צפוף. בעזרת פינצטה, לחץ בעדינות על גב הכיסוי כדי להבטיח העברה מספקת של נבגי חיידקים ותפטיר אווירי. הרם את הכיסוי מהצלחת והנח אותו בזווית של 45 מעלות כשחומר התא פונה לפני השטח של שקופית מיקרוסקופ המכילה טיפה של 15 מיקרוליטר של 50% גליצרול.אפשר לכיסוי ליפול על הגליצרול, מה שיפחית את בועות האוויר. כדי לבצע מיקרוסקופ ניגודיות פאזה במרווחי זמן שונים, הנח את השקופית המוכנה על שלב המיקרוסקופ והוסף טיפת שמן טבילה למרכז הכיסוי. סובב את מטרת הפאזה פי 100 במקומה והגדר את צריח המעבה להגדרת השלב התואמת המתאימה.לאחר שעדשת האובייקט נמצאת במגע עם השמן, השתמש רק בכפתור הכוונון העדין כדי למקד את התמונה. בחנו מספר שדות ראייה כדי להבחין בהבדלים ניכרים ועקביים בין זני מוטנטים לסוג הפראי. כגון היכולת ליצור נבגים, גודל וצורת הנבגים והמספר הכולל של הנבגים.בעזרת פינצטה סטרילית, הכינו מעלית כיסוי מצלחת אגר MS כמו קודם במקום בו ניכרת צמיחת חיידקים ונגעו בעדינות בחלק האחורי של הכיסוי עם הפינצטה כדי להבטיח העברה מספקת של נבגי חיידקים וחוטי אוויר. הרם את הכיסוי מהצלחת והנח אותו על מלאי הכרטיסים כך שהצד עם חומר התא פונה כלפי מעלה כדי להקל ולתפעל את הכיסוי. עם מתנול קר כקרח, הציפו את הכיסוי ותנו לו לשבת במשך חמש דקות.באמצעות PBS שטפו את הכיסוי פעמיים על ידי חלוקה עדינה והסרה של התמיסה. הוסף 15 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם לתמיסת יודיד פרופידיום מיליליטר ו/או 10 מיקרוגרם למיליליטר של WGA-FITC לשקופית. הנח את הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על טיפת כתם פלורסנט.דגרו את הדגימות בחדר חשוך או מואר עמום למשך 15 דקות. יש להגן על מלאי הכתמים הפלואורסצנטיים ודגימות הכתמים מפני האור. מומלץ לחוקרים להשתמש בתנאים של תאורה חלשה בזמן הכנת הדגימות ולהשתמש בקופסה חשוכה כדי להחזיק דגימות לאחר הכנתן.התבונן בשקופיות תחת עדשת אובייקטיבית פי 100 באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ DIC המצויד בקוביות עירור אפיפלואורסצנטיות עבור פרופידיום יודיד ו-FITC. נתח את התמונות לפי פרוטוקול הטקסט. מוצגות כאן דוגמאות למוטציות Streptomyces הנובעות ממוטגנזה של טרנספוזון.תפטיר אווירי בצבע בהיר יותר עשוי להצביע על רמה נמוכה יותר של פיגמנט אפור הנגרם על ידי פגם בנבגים. או שהיעדר מראה מטושטש מעיד על גוש בהיווצרות תפטיר אווירי. כפי שניתן לראות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מושבות S.coelicolor מסוג בר מייצרות בדרך כלל תפטיר אווירי על ידי כיומיים של צמיחה.ושרשראות ארוכות של נבגים בשלושה ימי צמיחה. מוטציות לבנות עשויות להתעכב לצורך היווצרות נבגים, להראות ירידה בשפע הנבגים המיוצרים, לייצר נבגים עם פגמים בצורתם או בגודל או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט הנבגים האפור הבוגר. מוצג כאן באמצעות DIC ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם צביעת PI, צביעה במרווחים קבועים עבור שרשרת נבגים בדגימה מסוג בר מושווה לדפוס הצביעה לסירוגין עבור שתי מוטציות החדרת טרנספוזון המציגות פגם בהפרדת כרומוזומים.שימוש ב-WGA-FITC כדי להכתים את דופן התא מסוג פרא S.venezuelae קיים כחוטי אוויר חלקים בין שרשראות הנבגים. ומציג את המערך הרוחבי דמוי מחיצות החלוקה שנראות בדרך כלל במהלך נבגים. עבודה עם אורגניזם חוטי שונה מאוד מעבודה עם חיידקים ידועים בצורת מוט.פרוטוקולי הווידיאו כאן אמורים לשמש כמשאב חשוב לחוקרים חדשים לגמרי הנכנסים לתחום מחקר הסטרפטומיצס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להתחיל לחקור מיני Streptomyces וחיידקים קשורים אחרים. לאחר הניסויים הראשוניים הללו, ניתן להשתמש במגוון טכניקות במעבדת מחקר כדי ללמוד עוד על זני הסטרפטומיצס שלך.לדוגמה, חלק מהטכניקות המתקדמות עשויות להיות תיוג חלבונים או ניתוחי ביטוי גנים כגון PCR ו-RNA בזמן אמת. ניסויי פנוטיפ ראשוניים משמשים לזיהוי ואפיון זנים חדשים ולהבחנה בתפקיד האופייני של גן מסוים. שיטות אלה כבר שימשו במעבדות הוראה באוניברסיטאות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של זני Streptomyces.

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

מקור: בנט, ג'יי א. ואחרים. הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות של Streptomyces. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הגידול וההשוואה הפנוטיפית של זני Streptomyces coelicolor מסוג בר ומוטנטי. הוא מתאר נהלים למזעור מוטציות ספונטניות, מניעת זיהום צולב וקידום צמיחת חיידקים באמצעות טכניקות ציפוי מתאימות. לבסוף, הסרטון מדגיש הבדלים חזותיים במורפולוגיה של המושבה כדי להמחיש את ההשפעות ההתפתחותיות של מוטציות בזני החיידקים.

השוואה פנוטיפית של זנים פראיים ומוטנטיים של Streptomyces coelicolor

מקור: בנט, ג'יי א. ואח'. הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות של Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לבחון הבדלים פנוטיפיים בין Streptomyces coelicolor מסוג בר למוטנטי. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנה והדמיה של חוטי אוויר לאיתור פגמים התפתחותיים בהיווצרות נבגים.

מיקרוסקופ ניגוד פאזה להערכת מוטציות התפתחותיות בסטרפטומיצס

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Streptomyces מאופיינים במחזור חיים מורכב שהיה מאתגר מבחינה ניסויית למחקר באמצעים ביולוגיים של תאים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מחזור החיים השלם על ידי גידול Streptomyces venezuelae במכשיר מיקרופלואידי.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

תולעים נימיות Caenorhabditis elegans הוא מודל מצוינת לנתח פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. המתוארים כאן הוא פרוטוקול להדביק את התולעת עם חברי streptococci קבוצה מיטיס ולקבוע ההפעלה של התגובה סטרס חמצוני נגד H2O2 המיוצר על ידי קבוצה זו של אורגניזמים.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כתב יד זה מתאר שיטה לסינון ספריות מוטנטיות בגודל בינוני של קנדידה אלביקנס עבור פנוטיפים של מורפוגנזה במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

למד שיטות הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות בחיידקי Streptomyces. פרוטוקולים אלה מאפשרים לאנשי מחקר מתחילים לטפח זנים ולזהות הבדלים מורפולוגיים בין טיפוסי בר למוטנטים.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

גלה סרטונים נוספים