הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הקשר בין היווצרות אגרגטים של חלבון תוך תאי והשפעתם על עקה חמצונית תאית באמצעות שמרי האופה Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום של מחלות קיפול ואגרגציה של חלבונים, כגון הפרעות ניווניות ועמילואידיוזות לא נוירופתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ומאפשרת לכמת את נזקי העקה החמצונית התאית באוכלוסיית שמרים גדולה.

בשיטה זו, אנו יכולים לספק תובנה לגבי המתאם בין מצב מסיס או מצטבר תוך תאי של חלבון עמילואידוגני עם רמות עקה חמצונית בשמרים. בנוסף, ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים מודל אחרים המבטאים חלבונים רקומביננטיים. מי שתדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה תהיה מנואלה קוסטה, טכנאית ממתקן ציטומטריית הזרימה ב-UAB.

במחקר זה, עוקבים אחר מצב הצבירה התוך-תאי של גרסאות שונות של פפטיד A-beta-42 באמצעות S.cerevisiae שעבר טרנספורמציה עם קידוד פלסמיד ל-A-beta-42 שהתמזג ל-GFP תחת שליטת מקדם המעורר גלקטוז. בחר מושבה אחת של תאי השמרים שעברו טרנספורמציה, וחסן ל-20 מיליליטר של SC מינוס מדיום Ura המכיל 2% גלוקוז. גדל את התרבית ב -30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה בן לילה.

למחרת, יש לחסן 100 מיקרוליטר מתרבית הלילה לחמישה מיליליטר של SC טרי מינוס מדיום אורה, ולגדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש. כאשר התרבית נמצאת בצפיפות אופטית של 590 ננומטר או OD 590 של 0.5, צנטריפוגה את התרבית ב-3,000 פעמים גרם למשך ארבע דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום SC טרי מינוס אורה המכיל 2% רפינוז. דגרו על התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, צנטריפוגה של התאים ב-3,000 פעמים גרם למשך ארבע דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במדיום SC טרי מינוס Ura המכיל 2% גלקטוז כדי לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי. החזירו את התאים לחממה למשך 16 שעות. לאחר 16 שעות, קצרו את התאים על ידי העברת כמות של מיליליטר אחד של התרבית לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים וצנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 פעמים גרם למשך ארבע דקות.

התחל הליך זה על ידי קביעת ה-OD 590 של תאי השמרים המושרים 16 שעות. לאחר מכן יש לדלל את התאים ב-PBS סטרילי ל-OD 590 של 0.1. העבר את מתלי התאים המבטאים לצינורות פוליסטירן תחתונים עגולים המסומנים כראוי, והגן עליהם מפני אור.

הכן תאים שאינם מושרים כבקרה שלילית לניתוח ציטומטריית הזרימה. הוסף את בדיקת המתח החמצוני לכל דגימה בריכוז סופי של חמש מיקרומולר. מכסים את הדגימות בנייר אלומיניום, ומדגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

כאשר הדגירה מסתיימת, סובבו את התאים, הסירו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורי התא ב-PBS. שטפו את התאים שלוש פעמים בצורה זו עם PBS. לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את התאים באותו נפח של PBS.

ודא שתאים לא מוכתמים כלולים בניתוח ציטומטריית הזרימה. באמצעות הלייזרים והפילטרים המתאימים, בצע את ניתוח ציטומטריית הזרימה כדי לזהות GFP ואת האות הפלואורסצנטי של בדיקת המתח החמצוני. התחל בלחיצה על החלונית פתח גיליון עבודה חדש, ותן שם לניסוי.

בסרגל הכלים, בחר בכלי Scatter Plot וצור תרשים עם המשתנים Side Scatter Area על ציר ה-y לעומת Forward Scatter Area בקנה מידה ליניארי על ציר ה-x. לחץ על הכלי Scatter Plot וצור תרשים עם המשתנים FITC Area על ציר ה-x לעומת APC Area בקנה מידה לוגריתמי על ציר ה-y. לחץ על הסמל הגדרת מכשיר והגדר את כל רמות הפיצוי לאפס בכרטיסייה פיצוי.

לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה רכישה ובחר מספר כולל של 20,000 אירועים לרישום עם קצב זרימה נמוך. מכיוון שניתן לזהות את אות הפליטה הפלואורסצנטי של פלואורוכרום אחד על ידי גלאי אחר, חשוב לבצע תהליך פיצוי כדי להשוות את האות המינימלי של כל פלואורוכרום בכל הגלאים על ידי בקרה בצבע יחיד. שנה את שם שפופרת 001 כבקרה שלילית, ולחץ על הכרטיסייה Acquire כדי להתחיל להריץ את התאים הלא מושרים והלא מוכתמים.

כוונן את המתח בהגדרות המכשיר של הפיזור קדימה והצד עד שהאוכלוסייה תתחלק ברביע השמאלי האמצעי. לחץ על סמל המצולע כדי להגדיר אזור R1 סביב אוכלוסיית התאים למעט פסולת תאים, והשתמש באוכלוסייה מגודרת זו P1 שווה ל-R1 עבור כל עלילות הנקודות הפלואורסצנטיות וייצוגי ההיסטוגרמה. כדי לכוונן את מתח ה-PMT של אות הקרינה, הפעל את התאים הלא מוכתמים בעלילת הנקודות FL1 עד FL3, כוונן את הרווח בכרטיסייה הגדרת מכשיר, עד שהתאים מופצים ברביע השמאלי התחתון.

באמצעות הכלי Scatter Plot, צור תרשים נקודות עם המשתנים FITC-A בציר ה-x לעומת FSC-A ותרשים נקודה שנייה עם המשתנים APC-A בציר ה-x לעומת FSC-A. לאחר מכן, שנה את הדגימה לתאים המושרים כדי למדוד פלואורסצנטיות GFP. בכרטיסייה הגדרת מכשיר, הגדר את הרווח ב-FSC-A לעומת FITC כאשר האוכלוסייה מחולקת ברביע הימני התחתון.

הגדר את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-GFP באמצעות שער. שנה את הדגימה לתאים המוכתמים שאינם מושרים. הצג מתח חמצוני על ידי הקרינה בתרשים נקודות FSC-A לעומת APC-A.

כוונן את הרווח עד שאוכלוסיית התאים מופצת ברבע העליון השמאלי. שער את אוכלוסיית התאים החיוביים ב-P3. בעזרת סמל ההיסטוגרמה, צור שתי תרשימי היסטוגרמה כדי לייצג את הקרינה של התא, אחת עבור FITC ואחרת עבור פלואורסצנציה של APC. צור טבלה המציגה את עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת ואת הקרינה החציונית עם שגיאת התקן המתאימה ו/או מקדם השונות עבור רמות הקרינה והמתח החמצוני של GFP.

לחץ על הכרטיסייה פיצוי והגדר את כל רמות הפיצוי לאפס. לחץ על הכרטיסייה צירוף משתמשים ובחר מספר כולל של 20,000 אירועים לתיעוד. הכן שלוש שפופרות חדשות של דגימות, ותן להן שמות לא מושרים, מסיסים מושרים ומצטברים מושרים.

רכוש נתונים מהדגימות עם ההגדרות המוגדרות מראש. נתח את הנתונים על ידי פתיחת גיליון חדש ויצירת תרשים נקודות עבור המשתנים FITC-A ו-APC-A, שער התאים החיוביים לצביעה של CellROX. עבור כל דגימה, צור טבלת סטטיסטיקה עם הקרינה הממוצעת ושגיאת התקן עבור ערוצי FITC ו-APC.

אפשר גם למיין תאים עם סדרן FACS בעקבות ספירת החלבון המצטברת. תאי שמרים המבטאים גרסאות A-beta-42 לאחר תקופת אינדוקציה של 16 שעות מוצגים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את התפלגות החלבון הרקומביננטי בתוך התאים. תמונות אלה מייצגות גרסאות נבחרות של A-beta-42 GFP.

היווצרות תכלילי חלבון, או PI, אושרה ב-10 מתוך 20 הגרסאות מהאוסף שנותח. גרף עמודות זה מציין את אחוז התאים המכילים מספרים שונים של PI המחושב מתוך סך של 500 תאים פלואורסצנטיים עבור כל וריאנט לשכפולים ביולוגיים. נצפתה התאמה מצוינת בין תכונות צבירה חזויות ו-in vivo.

רמות ביטוי החלבון בתמציות תאים כומתו באמצעות נוגדן ספציפי ל-A-beta. כמגמה כללית, וריאנטים יוצרי PI A-beta-42, צבועים בירוק, נמצאים ברמות נמוכות יותר מאלה המפוזרים באופן מפוזר בציטוזול, צבועים באדום. הבדלים חשובים בין גרסאות A-beta-42 נצפו כאשר הקרינה של בדיקת המתח החמצוני, רמות החלבון ותכונות הקרינה של GFP יוצגו ביחס ליכולתם ליצור PI ונטיות הצבירה הפנימיות שלהם שנחזו על ידי אלגוריתם הביואינפורמטיקה AGGRESCAN או TANGO.

הגרסאות היוצרות PI הן בירוק, והגרסאות שאינן יוצרות PI הן באדום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות אחרות כגון צביעת פרופידיום יודיד או אנקסין V כדי לענות על שאלות נוספות כמו קביעת ההשפעה של וריאנט חלבון מבוטא תוך תאי על אפופטוזיס או ציטוטוקסיות של התאים.