Name: הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: חקור את הקשר בין צבירת חלבונים לסטרס חמצוני תוך-תאי ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר של נזק תאי באוכלוסיות גדולות ומספקת תובנות למחלות ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. תרבויות cerevisiae ס וביטוי חלבונים
הערה: גרסאות Aβ התערוכה מספק שלעצמו צבירת היחסי שונה עקב מוטציה בגן משקע אחד במיקום 19 (Phe19) של פפטיד Aβ42 (איור 1 א'). גרסאות פפטיד אלה מתויגות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אשר משמש כתב (איור 1) צבירת29.
<ol><li>להפוך פלסמידים קידוד עבור 20 Aβ42-GFP משתנים לתוך תאי שמרים עם BY4741 רקע הורים (מאטה שלו3Δ1 leu2Δ0 פגש את15Δ0 ura3Δ0)30. כל פלסמיד מקודד עבור מוטציה Aβ42 דבוקה GFP באמצעות מקשר GSSGSSG. פלסמידים הינם pESC(-URA) וכוללים דה מרקר לבחירה URA329.<ol>
<li>להכין המדיום מלאה סינתטי ללא אורציל (SC-עורה) עם הרכיבים הבאים: 1.9 גרם/ליטר חנקן שמרים בסיסי ללא אורציל, 5 g/L אמוניום סולפט, 900 מל של ddH2O בשילוב עם 100 מ של גלוקוז 20% (w/v).</li>
		<li>מכניסים המושבה אחד של תאי שמרים טרנספורמציה 20 מ"ל של המדיום SC-עורה המכיל 2% גלוקוז ולגדול התרבויות בין לילה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחרת, לגדול תרבויות חדשות של תאי שמרים מאת לחסן 100 µL של התרבות לילה לתוך מ של מדיום SC-עורה צח.</li>
	<li>יתר590 של 0.5, centrifuge התרבויות ב x 3000 g למשך 4 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים באותו אמצעי אחסון בינוני SC-עורה צח המכיל 2% raffinose.</li>
	<li>דגירה ב 30 ° C תחת עצבנות-210 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, centrifuge את התאים ב 3000 g x במשך 4 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend התאים במדיום SC-עורה צח המכיל 2% גלקטוז לזירוז הביטוי חלבון רקומביננטי.</li>
	<li>לאחר ה' 16 של גרימת ביטוי חלבון במדיום SC-עורה המכיל 2% גלקטוז, קציר 1 מ"ל של התאים המושרה צינורות סטרילי microcentrifuge על ידי צנטריפוגה ב 3000 g x במשך 4 דקות. הערה: ההבדלים הרלוונטיים ביותר להתרחש לאחר תקופה אינדוקציה של תאי שמרים המושרה ה 16 לבטא Aβ42-GFP משתנים, ניתן לאבחן על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי לקבוע את התפלגות חלבון רקומביננטי בתוך התאים (איור 2B).</li>
</ol>2. התא מכתים
הערה: תאים שאינם-induced טריים נדרשים כפקד שלילי כדי לקבוע סף פלורסנט במהלך ניתוח FC.
<ol><li>לוקחים תאי שמרים h-induced 16 ולקבוע שלהם צפיפות אופטית-590 nm (OD590). לדלל אותם בתוך תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) יתר590 של 0.1.<ol>
<li>להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח כדלקמן: להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, ולמלא 0.24 גר'2פו ח'4 800 מ של ddH2O. הפתרון עד 1 L של ddH2O לאחר התאמת רמת ה-pH ל 7.4 עם HCl. לסנן את המאגר דרך מסנן 0.2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את המתלים תא לביטוי כראוי שכותרתו צינורות (פוליסטירן 12 ממ עגול-התחתון × 75), להגן עליהם מפני אור. ודא כי הם מוכנים להיות טעון על cytometer זרימת לניתוח, יחד עם תאים שאינם-induced ו שאינו מוכתם.</li>
	<li>להוסיף החללית סטרס חמצוני (למשל, אדום עמוק CellROX) כל דגימה-ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.</li>
	<li>לאחר דגירה, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 x PBS, resuspend אותם באמצעי האחסון באותו מאגר לפני ניתוח שלהם על ידי מועדון הכדורגל.</li>
</ol>3. לזרום Cytometry ניתוח
הערה: השתמש התקנה FC עם לייזרים המתאים ומסננים כדי לזהות GFP ושידור פלורסצנטיות בדיקה סטרס חמצוני. Cytometer זרימה מצוידים 488 ננומטר כחול בלייזר איתור GFP, לייזר nm אדום 635 איתור סטרס חמצוני בדיקה קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש. רכישת פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP, סטרס חמצוני בדיקה מבוצע עם 530/30 ננומטר BP מסנן, מסנן BP 660/20, בהתאמה (טבלה 1).
<ol><li>לחץ על פתיחת החלונית ' גליון עבודה חדש וליצור החלקות נקודה הרכישה הבאה.<ol>
<li>בחר את פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים לצד פיזור-אזור (האס-A) על ציר ה-y לעומת קדימה פיזור-אזור (FSC-A) בסרגל ליניארי של בציר ה-x.</li>
		<li>לחץ על פיזור כלי מגרש מסרגל הכלים וליצור מגרש עם המשתנים באזור FL1 (FITC)-ציר ה-x vs. FL3-האזור (APC) ב לוגריתמי בציר ה-y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחץ על הסמל הגדרות מכשירים . לחץ על הכרטיסיה פיצויים וקבע בכל רמות הפיצוי. לחץ על הכרטיסיה ייבוא , בחר את המספר הכולל של אירועים 20,000 שיירשמו.</li>
	<li>לחץ על הסמל קצב הזרימה כדי לעבור את קצב זרימה נמוכה.</li>
	<li>לחץ על הכרטיסיה ייבוא להתחיל לרוץ את התאים הלא-induced, מוכתם ולהתאים את המתח הגדרות המכשיר פארווערטס ואת פיזור בצד עד האוכלוסייה מופץ ברבע השמאלי האמצעי.<ol>
<li>לחץ על הסמל ' מצולע ' כדי להגדיר אזור R1 סביב האוכלוסייה תא למעט שאריות תאים, ולהשתמש אוכלוסייה מגודרת זו P1 = R1 עבור כל נקודה פלורסנט חלקות וייצוגי היסטוגרמה (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להתאים את המתח PMT של האות פלורסצנטיות, להפעיל את התאים מוכתם העלילה נקודה FL1-FL3, כוונון של הרווח בכרטיסיה כלי ההגדרה , עד התאים מופצים ברבע השמאלי התחתון.</li>
	<li>לשנות את דגימת התאים המושרה למדידת קרינה פלואורסצנטית GFP. בכרטיסיה כלי ההגדרה , להגדיר את רווח FSC-A נ' FL1 (FITC) כאשר האוכלוסייה מופץ ברבע הימני התחתון. הגדרת האוכלוסייה תא חיובית עם שער (שער P2).</li>
	<li>שינוי הדוגמית להוכיח אי-induced מוכתם לתאים כדי להציג סטרס חמצוני זריחה על FSC-A נ' FL3 (APC) נקודה מגרש. מנגינה של הרווח עד האוכלוסייה תא מופץ ברבע השמאלי-עליון. שער אוכלוסיית תאים חיוביים P3.</li>
	<li>לעשות שני מגרשים היסטוגרמה עם סמל היסטוגרמה לייצג את פלורסצנטיות תא. כדי לייצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ודא FL1 (FITC) המייצג את פלורסצנטיות GFP ב ציר ה-x, FL3 (APC) המייצג את זריחה בציר ה-y, החלת P2, P3 אוכלוסיות בקנה מידה לוגריתמי, בהתאמה. הערה: כיסויי היסטוגרמה הם דרך טובה כדי להמחיש את ההבדלים בין הפרופילים זריחה של תאים לבטא את Aβ וריאציות שונות.</li>
</ol>4. Immunodetection חלבון רקומביננטי
<ol><li>כדי לקבוע רמות ביטוי החלבון, לקצור את התרבויות שמרים המושרה עבור 16 h על ידי צנטריפוגה-g 4,000 x עבור 6 דקות ואחסן את כדורי תא ב- 80 ° c<ol>
<li>Resuspend התאים שנאספו ביטוי חלבון רקומביננטי עבור 16 h ב- PBS. להכין 200 המתלים תא µL של כל מוטציה Aβ42-GFP יתר590 של 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לניתוח שבר מוחלט חלבון, לקצור 100 µL של כל מוטציה על ידי צנטריפוגה ב g 14,000 x במשך 20 דקות, resuspend כדורי תאים באותו אמצעי אחסון שמרים פירוק מאגר Y-לכל (50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1% דימתיל סולפוקסיד, 200 מ"מ NaCl, המכיל 10 מ"ג/מ"ל (myr 14-SB3 EDTA 1 מ מ istyl sulfobetaine) בתוספת 1 מ"מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF)).<ol>
<li>דגירה הדגימות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות קלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את הריכוז תמצית חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. לטעון עד 5 µg של חלבון תמצית של כל מדגם on a ג'ל אלקטרופורזה מרחביות-דף 15% אקרילאמיד כתם על גבי קרום polyvinylidene difluoride (PVDF) ב- 100 וולט עבור 60 דקות.<ol>
<li>הכן של ברדפורד מגיב עם 100 מ ג של G-250 כחול מבריק Coomassie התפרקה ב 50 מ של 95% אתנול, להוסיף 100 מ של חומצה זרחתית 85% (w/v). לאחר מכן, כאשר לצבוע התפרקה לחלוטין, לדלל את התערובת עם ddH2O עד 1 ליטר, דרך נייר סינון תאית רק לפני השימוש. הערה: הכימית ברדפורד צריך להיות חום בהיר.</li>
		<li>להכין תקן של שור אלבומין (BSA) הנע בין 5 ל- 100 µg של חלבון ב- 1,000 µL מהתרכובת ברדפורד.</li>
		<li>להוסיף 1-10 µL של חלבון תמצית 1 מ"ל מהתרכובת ברדפורד, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>למדוד את ספיגת תקנים ולחלץ החלבון דגימות-OD595.</li>
		<li>לניתוח, הופכים מגרש עם הערכים ספיגת שהתקבלו עבור הסטנדרטים vs. µg של חלבון. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, לקבוע את ריכוזי הדגימות המקורי כמות של חלבון, בהתחשב בכך את נפח ואת דילול, אם בכלל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם 1 x באגירה טריס תמיסת מלח (TBS), 0.1% Tween 20 (TTBS), ולחסום אותו באמצעות חלב יבש ללא שומן 5% (w/v) ב- 1 x TTBS.<ol>
<li>להכנת 1 ליטר של 10 x TBS, להמיס 24 גר' טריס הבסיס ו- g 88 של NaCl ב 900 מל של2O Hdd ולהתאים את ה-pH ל 7.6. DdH2O להוסיף נפח סופי של 1 ל' פתרון 1 x, לערבב 1 חלק של מניות x 10 עם 9 חלקים של ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הקרום עבור h 1 עם 1:1,000 6E10 בדילול נוגדן ראשוני β-עמילואיד, לשעה בטמפרטורת החדר עם עז משני נוגדן אנטי עכבר IgG-HRP המספר המשלים מדולל 1:10, 000.</li>
	<li>לפתח ממברנות באמצעות 1 מ"ל של ריאגנט פלורסנט Luminata ולכמת להקות על ידי ניתוח densitometric, כפי שמתואר בשלב 5.2.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>כדי לנתח את הנתונים שבידי FC, ליצור טבלה מציג את עוצמת פלורסנט רשע (MFI), קרינה פלואורסצנטית החציוני לשגיאה הסטנדרטית המתאימים ו/או המקדם של השונות (CV) עבור קרינה פלואורסצנטית GFP ורמות סטרס חמצוני.<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה מפקח בסמל נתונים סטטיסטיים כדי להתאים אישית את נתונים סטטיסטיים הדרושים לכל ערוץ. הערה: בעת השוואת גרסאות חלבון, להמיר פלורסצנטיות ערכי הנתונים מקפלים-over רקע או מדד רזולוציה (RD): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> בהמדד, המדגם רשע הוא זריחה מתכוון הבעיה דוגמאות של הפקד רשע הוא זריחה אכזרי של תאים משמש פקד, הגרמנים הוא סטיית התקן של זריחה אומר. פקטור רואד הוא אינדקס מדויקת יותר מהערך MFI הוא לא רק מחשב את ההפרש בין דגימות, אלא גם חשבונות עבור הפצת הנתונים. חישוב זה רלוונטי במיוחד כאשר משווים נתונים שמקורם ניסויים שונים מתבצעת לאורך זמן. לאחר ה-RDs חושבו, השימוש של מבחן סטטיסטי מומלץ לאשר את משמעות ההבדלים שנצפה בין גרסאות חלבון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור חלבון immunodetection, לכמת את רמות חלבון רקומביננטי מאת תספיג באמצעות תוכנת ImageJ.<ol>
<li>לפני הניתוח densitometry, להמיר תמונות raw המקורי של קרום מפותחת תבנית קובץ JPEG ומצב בגווני אפור.</li>
		<li>להתאים את המקטע להגדיר מידות של התפריט נתח לערך גריי אומר.</li>
		<li>לחץ על הכלי מלבן של ImageJ ולהגדיר אזור בעל עניין (ROI) בגודל אחיד לניתוח densitometry הלהקה. מרכז כל הלהקה על התמונה ממברנה בתוך המסגרת מלבני נוצר והקלטה של מדידה אחת באמצעות Ctrl + M (הפקודה מדידה).</li>
		<li>למדוד את הרקע מקומי צמוד כל הלהקה, החלת רועי באותו האזור. לאחר המדידה, להחסיר הרקע המקומי המתאים כל הלהקה בודדים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo%3A+the+role+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li>
<li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12181546">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+diseases%3A+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart%3A+a+clinical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li>
<li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li>
<li>Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li>
<li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+is+good%3A+yeast+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li>
<li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+model+of+amyloid-%CE%B2+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li>
<li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+yeast%3A+modeling+neurotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li>
<li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420(2013).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27654890">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li>
<li>Pallarès, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28685682">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li>
<li>Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li>
<li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li>
<li>Conchillo-Solé, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGGRESCAN%3A+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+%26%2334%3Bhot+spots%26%2334%3B+of+aggregation+in+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &#34;hot spots&#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).</li>
<li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li>
<li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24698014">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li>
<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

מגוון רחב של מחלות קשורה להצטברות של חלבונים misfolded לתוך הסלולר פיקדונות6,7,8,33. מאמצים רבים נעשו כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המפעילות את התפרצות של מחלות אלו באמצעות גישות חישובית, אשר לא עשה חשבון חלבון ריכוזים, או במבחנה מתקרב, שבו ריכוז חלבון נשארת קבועה במהלך התגובה. עם זאת, בתוך התא, חלבונים נמצאים כל הזמן מסונתז והשפילו בסביבה צפופה, אי-הומוגניות. זה מסביר את הסתירות ...

פרוטוסטאזיס הוא דטרמיננטה הבסיסית של כושר תא ותהליכי הזדקנות. תאים, חלבון הומאוסטזיס נשמר על ידי בקרת איכות החלבון המתוחכם רשתות שנועד להבטיח את נכונות refolding של חלבונים misfolded conformers מלווים ו/או proteolysis יישוב שלהם עם מספר מנגנונים שנשמרת היטב1 ,2,3,4,5. מספר רב של מחקרים מספקים תמיכה לקשר בין התפתחות והתקדמות של מגוון רחב של מחלות האדם וכישלון פרוטוסטאזיס, המוביל אל חלבון misfolding, צבירת. למשל, הנוכחות של חלבון פיקדונות נחשב סימן היכר פתולוגי של הפרעות ניווניות רבים, כמו אלצהיימר, פרקינסון, ו הנטינגטון מחלות6,7,8, מחלות prionogenic, amyloidoses ניוונית9. הוצע כי הרכבות oligomeric, protofibrillar מוקדמת בהתגובה צבירת הן elicitors הראשי של cytotoxicity, הקמת aberrant אינטראקציות עם חלבונים אחרים חצרו הסלולר צפוף10. בנוסף, חלבון הכללות (PI) יכול להיות מועבר בין תאים, הפצת שלהם השפעה רעילה11,12. לכן, זה יכול להיות כי היווצרות של PI אולי אכן מהווה מנגנון בעלת מגבילה את נוכחותם של מינים צבורים מסוכן למיקומים ספציפיים בתא, היכן ניתן לעבד או שנצבר ללא תופעות לוואי משמעותיות 13 , 14.
תקן במבחנה גישות הביוכימי סיפקו תובנות חשובות מינים שונים that לאכלס את צבירת תגובות ו15,שלהם מאפיינים16. עם זאת, תנאי שימוש אלה מבחני בבירור שונות מאלו המתרחשים בתוך התא ולתשאל, לכן, מאבדים רלבנטיות פיזיולוגיים. בגלל השימור הבולטים של מסלולים סלולריים כגון בקרת איכות חלבון, autophagy או ברגולציה של הסלולר חמצון-חיזור המדינה17,18 בין פרוקריוטים19,20,21 ,22,23, שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) התפתחה מיוחס מודל הסלולר פשוט ללמוד על גורמים מולקולרית של צבירת חלבון והשפעתו המשויך ציטוטוקסיות סביבות ביולוגית רלוונטית24,25,26.
חלבון צבירת הנטייה היא תכונה מטבעו מקודד ברצף העיקרי. לפיכך, היווצרות עמילואיד-מבני ניתן לחזות המבוסס על זיהוי, הערכה של עוצמת קידום צבירת אזורים polypeptides27. עם זאת, למרות ההצלחה של אלגוריתמים bioinformatic כדי לחזות את המאפיינים צבירת במבחנה של רצפי חלבונים, הם עדיין רחוק מלהיות חיזוי איך לתרגם אלה מספק שלעצמו ויוו ציטוטוקסיות ההשפעה. מחקרים כתובת הקישור בין המדינה צבורים של חלבון נתון שלה נזק תאי המשויכים בצורה שיטתית עשוי לעזור כדי לעקוף מגבלה זו חישובית. חיבור זה הוא התייחס במחקר הנוכחי, ניצול של סט גדול של גרסאות של פפטיד עמילואיד-β Aβ42 שונות רק ב משקע יחיד, אך הצגת טווח רציף של צבירת מספק שלעצמו ויוו28. בפרט, מתואר גישה מבוססת-FC לזהות את הזן הסתגלותי החשבונאי נזק חמצוני שהפיק צבירת נוטה חלבונים בתאים שמרים. המתודולוגיה מספק יתרונות רבים כגון פשטות, תפוקה גבוהה יכולת מדידה כמותית מדויקת. גישה זו אפשרו לאשר את PI לשחק תפקיד מגן מפני עקה.

<table><tbody><tr><td>תאי שמרים BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>גנוטיפ: MATa his3&Delta; 1 leu2&דלתא; 0 met15&דלתא; 0 ura3&דלתא; 0</td></tr><tr><td>pESC(-Ura) פלסמיד&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>פלסמיד ביטוי שמרים עם מקדם גל. סמן לבחירה URA3</td></tr><tr><td>שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי מזון</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>גלקטוז</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>פוספט מי מלח חומציים (PBS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>פתרון 10X</td></tr><tr><td>ריאגנט אדום עמוק של CellROX&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>חיישן פלואורסצנטי של רדיקלים חופשיים, לא פלואורסצנטי במצב מופחת, ומציג פלואורסצנטיות בהירה בעת חמצון על ידי מיני חמצן תגובתיים (ROS), עם ספיגה/פליטה מקסימלית של 644/665 ננומטר.</td></tr><tr><td>מגיב מיצוי חלבון Y-PER&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>מאגר ליזה של תאים נוזליים</td></tr><tr><td>אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>תמיסת</td></tr> צבע <tr><td>ברדפורד</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>5000205</td><td>ריאגנט צבע לקביעת שלב אחד של ריכוז החלבון</td></tr> <tr><td>ונוגדני עמילואיד 6E10&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>עכבר IgG1. האפיטופ נמצא בתוך חומצות אמינו 3-8 של בטא עמילואיד (EFRHDS).</td></tr><tr><td>מצומד IgG-HRP נגד עכבר עיזים&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Premixed, מוכן לשימוש מגיב זיהוי HRP כימילומינסנט</td></tr><tr><td>תמיסת פלואוריד פנילמתאן סולפוניל (PMSF)</td> מעכב פרוטאז <td>Sigma</td><td>93482</td><td>. מומס ב-0.1 מ' באתנול</td></tr><tr><td>FACSציטומטר זרימה של קאנטו&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>מצויד ב-488&nbsp; לייזר כחול nm לזיהוי GFP, ו-635&nbsp; לייזר אדום ננומטר / מסנן 530/30 ננומטר BP ומסנן 660/20 ננומטר תא</td></tr><tr><td>העברת אלקטרופורזה תא העברת</td><td>חלבון Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>מערכות</td></tr><tr><td>יציקה ידנית</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>מערכת אלקטרופורזה</td></tr></tbody></table>

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

חלבון misfolding, צבירת לתוך עמילואיד הייצורים החיים קשורה עם התחלתה של התקדמות של מספר מחלות ניווניות. עם זאת, יש עדיין מעט מידע על חלבונים מסיסים איך אגרגטים להפעיל את ההשפעות הרעילות שלהם בתוך vivo. אורגניזמים פשוטים prokaryotic ו האיקריוטים מודל, כגון חיידקים, שמרים, תרמו משמעותית להבנתנו הנוכחי של המנגנונים מאחורי היווצרות עמילואיד תאיים, הפצת אגרגטים, רעילות. ב פרוטוקול זה, השימוש של שמרים מתואר כמודל לנתח את הקשר בין היווצרות של אגרגטים חלבון והשפעתם על הסלולר סטרס חמצוני. השיטה משלבת את הגילוי של המדינה מסיסים/המצטברים תאיים החלבון amyloidogenic עם כימות של נזק חמצוני הנובע ביטויה באמצעות cytometry זרימה (FC). גישה זו היא פשוטה, מהירה, כמותית. המחקר מדגים את הטכניקה על-ידי התאמת את הסלולר עקה הנגרמת על ידי קבוצה גדולה של עמילואיד-β משתנים פפטיד עם שלהם מספק שלעצמו צבירת מהותי בהתאמה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעסיק אוסף של משתנים 20 של פפטיד Aβ42 שבו יש כבר מוטציה Phe19 proteinogenic טבעי כל חומצות אמינו28. מספק צבירת התיאורטי שלעצמו החלבונים האלה ניתן לנתח באמצעות אלגוריתמים שונים bioinformatic שני (AGGRESCAN וטנגו31,32). בשני המקרים, ניתוח זה הופך את שינוי הדרגתי פרוגרסיבי של צבירת נטיות, ומייחס, ככלל, את הערכים הגבוהים ביותר ואני את שאריות הידרופובי לאלה טעונה, קוטבי (<strong class="xfi...

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הקשר בין היווצרות אגרגטים של חלבון תוך תאי והשפעתם על עקה חמצונית תאית באמצעות שמרי האופה Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום של מחלות קיפול ואגרגציה של חלבונים, כגון הפרעות ניווניות ועמילואידיוזות לא נוירופתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ומאפשרת לכמת את נזקי העקה החמצונית התאית באוכלוסיית שמרים גדולה.בשיטה זו, אנו יכולים לספק תובנה לגבי המתאם בין מצב מסיס או מצטבר תוך תאי של חלבון עמילואידוגני עם רמות עקה חמצונית בשמרים. בנוסף, ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים מודל אחרים המבטאים חלבונים רקומביננטיים. מי שתדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה תהיה מנואלה קוסטה, טכנאית ממתקן ציטומטריית הזרימה ב-UAB.במחקר זה, עוקבים אחר מצב הצבירה התוך-תאי של גרסאות שונות של פפטיד A-beta-42 באמצעות S.cerevisiae שעבר טרנספורמציה עם קידוד פלסמיד ל-A-beta-42 שהתמזג ל-GFP תחת שליטת מקדם המעורר גלקטוז. בחר מושבה אחת של תאי השמרים שעברו טרנספורמציה, וחסן ל-20 מיליליטר של SC מינוס מדיום Ura המכיל 2% גלוקוז. גדל את התרבית ב -30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה בן לילה.למחרת, יש לחסן 100 מיקרוליטר מתרבית הלילה לחמישה מיליליטר של SC טרי מינוס מדיום אורה, ולגדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש. כאשר התרבית נמצאת בצפיפות

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים...

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

שפע החלבונים משקף את שיעורי סינתזת החלבון ופירוק החלבון. מאמר זה מתאר את השימוש במרדף ציקלוהקסימיד ואחריו הכתמה מערבית כדי לנתח פירוק חלבון במודל האיקריוט החד-תאי, Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

חקור את הקשר בין צבירת חלבונים לסטרס חמצוני תוך-תאי ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר של נזק תאי באוכלוסיות גדולות ומספקת תובנות למחלות ניווניות.

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

גלה סרטונים נוספים