Name: שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: חקור רעילות וצבירה של α-synuclein במודל שמרים אנושי לחקר מחלת פרקינסון. השיטה מאפשרת ניטור פנוטיפים תאיים וזיהוי גורמים גנטיים המשפיעים על יציבות החלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'יימס בארדוול וטיאגו פ. אוטיירו על שחלקו בחביבות את הפלסמידים המכילים α-סינוקלאין. צ'אנגהאן לי קיבל מימון מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מענק 2021R1C1C1011690), תוכנית המחקר המדעית הבסיסית באמצעות NRF במימון משרד החינוך (מענק 2021R1A6A1A10044950), וקרן המחקר החדשה של אוניברסיטת אג'ו.

1. הכנת מדיה ופתרונות
<ol><li>היערכות למדיה<ol><li>כדי להכין מדיום YPD, יש להמיס 50 גרם של אבקת YPD ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>כדי להפוך את האגר של YPD לבינוני, יש להמיס 50 גרם אבקת YPD ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר של dH2O. Autoclave לעיקור. לאחר שהתקרר, יוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כדי ליצור SC עם רפינוז (SRd)-Ura בינוני, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו ב 795 מ"ל של dH2O. Autoclave לעיקור. לפני השימוש יש להוסיף 100 מ"ל של 20% רפינוז, 5 מ"ל של 20% גלוקוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura לפני השימוש.</li>
		<li>כדי להפוך את SD-Ura אגר למדיום, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו 20 גרם של אגר ב 800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל2L. להוסיף 100 מ"ל של 20% גלוקוז ו 100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כדי ליצור SC עם מדיום גלקטוז (SG)-Ura agar, יש להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו-20 גרם אגר ב-800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל2L. הוסף 100 מ"ל של 20% גלקטוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>מלאי פתרונות לשימוש עם מדיית SD<ol><li>כדי ליצור מקור פחמן של 20% (גלוקוז, גלקטוז ורפינוז), יש להמיס 100 גרם של גלוקוז, גלקטוז או רפינוז ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. אוטוקלאב וחנות ב-RT.</li>
		<li>כדי להכין 10x שמרים סינתטיים שנשרו תוספים בינוניים ללא אורציל (נשירה של 10x-Ura), יש להמיס 19.2 גרם של "שמרים סינתטיים שנשרים מתוספי תזונה בינוניים ללא אורציל" ב-dH2O כדי ליצור נפח סופי של 1 ל' אוטוקלאב ולאחסן ב-RT. הערה: להכנת אגר בינוני, הוסיפו לבקבוקון מוט ערבוב מגנטי כדי לערבב את כל התמיסות היטב לפני שאתם מוזגים על צלחות פטרי.</li>
	</ol></li>
</ol>2. טרנספורמציה של שמרים
הערה: פלסמיד pRS426 שימש לשכפול הגן α-סינוקלאין והכיל את הגן URA3 כסמן הניתן לבחירה. ישנן גרסאות משפחתיות הקשורות ל-PD של α-סינוקלאין שיש להן פנוטיפים של מחלות קשות (למשל, ציטוטוקסיות). גרסאות אלה שימשו כאן גם כדי לעקוב אחר הציטוטוקסיות שלהם והיווצרות מוקדים מצטברים. השתמש באותה מושבה של טרנספורמנטים של שמרים עבור כל הניסויים כדי לקבל תוצאות עקביות.
<ol><li>לטרנספורמציה של פלסמידי ביטוי השמרים, השתמש בווקטור ריק (pRS426) כבקרה ופלסמידים המכילים α סינוקלאין. בהתייחס לשיטת ליתיום אצטט סטנדרטית (LiAc)11, הכינו שישה תאים מוכשרים ו-0.5 מיקרוגרם מכל פלסמיד, ובצעו את הטרנספורמציה.</li>
	<li>כדי לבחור עבור טרנספורמנטים של שמרים המכילים פלסמידים, השתמש במדיום המוגדר הסינתטי (מדיום SD) ללא אורציל (SD-Ura), ודגר את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.</li>
	<li>תיקון שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-Ura לבחירת תאים המכילים פלסמידים לניסויים נוספים. הערה: כדי להפיק תוצאות מדויקות ואמינות, בחנו לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל זן.</li>
</ol>3. בדיקת איתור
הערה: הביטוי של α-סינוקלאין המתויג כ-GFP בפלסמידים בעלי מספר עותקים גבוה ידוע כקשור לציטוטוקסיות בשמרים10.
<ol><li>יש לחסן את שלושת הטרנספורמנטים המתוקנים של שמרים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב השראת α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את תרבית התאים ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד. הערה: חשוב לחזור על כל הניסויים עם מושבות שונות. קבלת אותן תוצאות מיותר משלוש מושבות עצמאיות פירושה שהתוצאה אמינה.</li>
	<li>למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טריל-OD 600 של 0.2, ולדגירה במשך 6 שעות ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.</li>
	<li>כאשר OD600 מגיע ל-0.6-0.8, דילל את התאים בלוחות 96-well לצורך בדיקת התצפית באופן הבא.<ol><li>מדוד את OD 600 של כל הדגימות, ודלל את הדגימות ל- OD 600 של 0.5 עם dH2O סטרילי (הנפח המעורב הוא100 μL) בנתיב 1 של צלחת 96 באר כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.</li>
		<li>בצע דילול סדרתי של פי חמישה של תאי השמרים על ידי הוספת 160 μL של dH2O סטרילי לחמשת הנתיבים הבאים. ודא נפח כולל של 40 μL בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב. הערה: גורמי דילול נמוכים יכולים ליצור הבדלים גדולים יותר בין הדגימות. נדרש פיפטינג מספיק כדי להבטיח ערבוב אחיד בעת ביצוע דילולים סדרתיים. יש להחליף את קצה הפיפטה בכל נקודת דילול. אחרת, התאים המחוברים לפני השטח של הקצה יכולים להיות מועברים לבאר הבאה ולהשפיע על מספר התא.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 μL מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-Ura עבור הבקרות ולוחות אגר SG-Ura כדי לנטר רעילות. הערה: יש לייבש את הצלחות עד שהדגימות המנומרות נספגות במלואן על הצלחות.</li>
	<li>לדגום את הלוחות המנומרים הפוך ב 30 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.</li>
	<li>צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד יום 4, ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. ספרו את המושבות הבודדות בדגימה המדוללת ביותר, חשבו את מספר התאים בני הקיימא בתרבית המקורית עבור כל זן, או השוו את גודל המושבות הבודדות.</li>
</ol>4. מדידת צמיחת שמרים באמצעות קורא מיקרו-פלטות
<ol><li>יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולדגור בטמפרטורה של 30°C תחת תסיסה ב-200 סל"ד למשך הלילה. הערה: כדי להבין כל פנוטיפ מושבה של זן השמרים האנושי המבטא α-סינוקלאין, השתמש באותם טרנספורמנטים עבור כל הניסויים.</li>
	<li>למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-200 מיקרו-ליטר של SD-Ura ו-SG-Ura טריים ב-96 צלחות באר. התאם את עוצמת הקול הסופית, כולל התאים, ל- 200 μL, וכוונן את OD600 של התא הראשוני ל- 0.05.<ol><li>התאם את הגדרות התוכנית בלוח המיקרוטיטר באופן הבא: הגדר את טמפרטורת היעד ל -30 ° צלזיוס, הגדר את משך הניעודה (ליניארי) ל -890 שניות, הגדר את משרעת הרעד (ליניארית) ל -5 מ"מ, הגדר את זמן המרווח ל- 00:15:00 והגדר את המדידה כספיגה ב- 600 ננומטר.</li>
		<li>דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את הנתונים על-ידי התוויית עקומת הצמיחה (לדוגמה, באמצעות חוברת עבודה). השג את נקודות הנתונים על ידי ממוצע ערכי הספיגה משלושת המשכפלים הביולוגיים, וציין את פסי השגיאה. השתמש בערך הספיגה ממדיה בלבד כפקד, והפחת זאת מהערכים מתאים בתרבית (אופציונלי).</li>
</ol>5. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
<ol><li>לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולתרבת אותם במשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד. הערה: כדי לקבוע את המתאם של הפנוטיפ עם ציטוטוקסיות והיווצרות מוקדים, השתמש באותן מושבות לניסוי.</li>
	<li>למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טרי ל-OD600 של 0.003 . לדגור את התרבות עד OD 600 מגיע 0.2 ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב200 סל"ד (~ 18 שעות).</li>
	<li>כאשר OD 600 של 0.2 מושגת, להוסיף 300 μL של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 °C תחת תסיסה ב200 סל"ד.</li>
	<li>לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.</li>
	<li>יש למרוח את כדור התא בעדינות ב-30 μL של מים מזוקקים.</li>
	<li>טען 5 μL של התאים המחיים על זכוכית שקופית. הכינו פד ג'ל אגרוז12 והניחו אותו על התאים הטעונים כדי לגרום לו להתפשט באופן שווה.</li>
	<li>בצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של פי 100 באמצעות מסנני שדה בהיר ו-GFP-פלואורסצנטי.<ol><li>ראשית, השתמש ב-brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של פי 100 באמצעות שמן טבילה. השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת התמונות באמצעות התוכנית.</li>
		<li>עבור למסנן GFP-פלואורסצנציה. התאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה עד 300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. לכידת מסך את התמונה באמצעות התוכנית.</li>
		<li>צלם תאים רבים מנקודות מרובות ולא רק מנקודה אחת.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את התמונות על ידי ספירת אחוז התאים המכילים מוקדים של אגרגטים α-סינוקלאין באמצעות תוכנה אנליטית. שימו לב להבדלים בין אות החלבון המסיס של GFP לבין אות ה-GFP שנוצר על ידי מוקדים, כמו גם את הדיפוזיה של GFP עם הצורה של גרסת A30P של α-סינוקלאין. הערה: היווצרות מוקדים תיצפה עם גרסאות מסוג בר, E46K ו-A53T של α-סינוקלאין.</li>
</ol>

<ol><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+synucleins%3A+%26%2334%3BHere%2C+there+and+everywhere%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of synucleins: &#34;Here, there and everywhere&#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li>
<li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+aggregation%2C+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li>
<li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li>
<li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genes+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li>
<li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+yeast+to+model+human+biology%2C+disease+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunham%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+and+Genomics%22">Methods in Yeast Genetics and Genomics</a>. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li>
<li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+systems+biology%3A+Model+organism+and+cell+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421(2019).</li>
<li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+aging%3A+learning+from+yeast+lessons%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li>
<li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15(2019).</li>
<li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+implicated+in+familial+Parkinson%27s+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643(2021).</li>
<li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545(2012).</li>
<li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621(2016).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+%CE%B1-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+bacterial+amyloid+promotes+%CE%B1-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111(2020).</li>
<li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בהתחשב במורכבות של מערכות תאיות שונות בבני אדם, כדאי להשתמש בשמרים כמודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. למרות שכמעט בלתי אפשרי לחקור את האינטראקציות התאיות המורכבות של המוח האנושי באמצעות שמרים, מנקודת מבט של תא בודד, לתאי שמרים יש רמה גבוהה של דמיון לתאים אנושיים במונחים של הומולוגיה של רצף גנומי ותהליכים תאיים אאוקריוטים בסיסיים 8,13. יתר על כן, בהתחשב בקלות של מניפולציה גנטית, שמרים יכולים להקל על המחקר של מערכות אנושיות מורכבות ותובעניות. לכן, שמרים כבר ...

מחלת פרקינסון (PD) היא בעיה רצינית עבור חברות מזדקנות ברחבי העולם. הצבירה של α-סינוקלאין קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון, ואגרגטים חלבוניים של α-סינוקלאין נמצאים בשימוש נרחב כסמן ביולוגי מולקולרי לאבחון המחלה1. α-סינוקלאין הוא חלבון חומצי קטן (140 חומצות אמינו באורך) בעל שלושה תחומים, כלומר סליל α קושר שומנים N, התחום המרכזי קושר עמילואיד (NAC) והזנב החומצי C-terminal2. קיפול שגוי של α-סינוקלאין יכול להתרחש באופן ספונטני ובסופו של דבר מוביל להיווצרות של אגרגטים עמילואידים הנקראים גופי לוי3. α-סינוקלאין עשוי לתרום לפתוגנזה של מחלת פרקינסון במספר דרכים. באופן כללי, הוא חשב כי צורות אוליגומריות חריגות ומסיסות הנקראות פרוטופיברילים הן מינים רעילים הגורמים למוות של תאי עצב על ידי השפעה על מטרות תאיות שונות, כולל תפקוד סינפטי3.
המודלים הביולוגיים המשמשים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות חייבים להיות רלוונטיים לבני אדם ביחס לגנום ולביולוגיה התאית שלהם. המודלים הטובים ביותר יהיו קווי תאים עצביים אנושיים. עם זאת, קווי תאים אלה קשורים למספר בעיות טכניות, כגון קשיים בתחזוקת תרביות, יעילות נמוכה של טרנספקציה והוצאות גבוהות4. מסיבות אלה נדרש כלי קל ואמין להאצת ההתקדמות בתחום מחקר זה. חשוב לציין, הכלי צריך להיות קל לשימוש לניתוח הנתונים שנאספו. מנקודות מבט אלה, אורגניזמי מודל שונים היו בשימוש נרחב, כולל דרוזופילה, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, שמרים ומכרסמים5. ביניהם, שמרים הוא אורגניזם המודל הטוב ביותר כי מניפולציה גנטית היא קלה, וזה זול יותר מאשר אורגניזמים מודל אחרים. והכי חשוב, לשמרים יש קווי דמיון גבוהים לתאים אנושיים, כגון 60% הומולוגיה של רצף לאורתולוגים אנושיים ו-25% הומולוגיה קרובה עם גנים הקשורים למחלות אנושיות6, והם גם חולקים ביולוגיה בסיסית של התא האאוקריוטי. שמרים מכילים חלבונים רבים בעלי רצפים דומים ותפקודים מקבילים לאלה שבתאים אנושיים7. ואכן, שמרים המבטאים גנים אנושיים נמצאים בשימוש נרחב כמערכת מודל להבהרת תהליכים תאיים8. זן שמרים זה נקרא שמרים אנושיים והוא כלי שימושי לחקר תפקודם של גנים אנושיים9. לשמרים אנושיים יש יתרון בחקר אינטראקציות גנטיות מכיוון שמניפולציה גנטית מבוססת היטב בשמרים.
במחקר זה השתמשנו בשמרים Saccharomyces cerevisiae כאורגניזם מודל לחקר הפתוגנזה של מחלת פרקינסון, במיוחד לחקר היווצרות אגרגטים α-סינוקלאין וציטוטוקסיות10. לביטוי של α-סינוקלאין בשמרים הניצנים, זן W303a שימש לטרנספורמציה עם קידוד פלסמידים עבור גרסאות PD מסוג בר ומשפחתיות של α-סינוקלאין. מכיוון שלזן W303a יש מוטציה אוקסוטרופית ב-URA3, הוא ישים לבחירת תאים המכילים פלסמידים עם URA3. הביטוי של α-סינוקלאין המקודד בפלסמיד מוסדר תחת מקדם GAL1. לפיכך, ניתן לשלוט ברמת הביטוי של α-סינוקלאין. בנוסף, היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באזור C-terminal של α-סינוקלאין מאפשר ניטור של היווצרות מוקדי α-סינוקלאין. כדי להבין את המאפיינים של הווריאנטים המשפחתיים הקשורים ל-PD של α-סינוקלאין, ביטאנו את הווריאנטים האלה גם בשמרים ובחנו את ההשפעות התאיות שלהם. מערכת זו היא כלי פשוט לסינון תרכובות או גנים המציגים תפקידי הגנה מפני ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין.

<table><tbody><tr><td>96 באר צלחת</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>TAESHIN</td><td>0158</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>לנשום קל</td><td>ביוטק מגוון</td><td>BEM-1</td><td>קרום איטום חדיר גז למיקרוטיטר צלחות</td></tr><tr><td>כיסוי משקפיים</td><td>Marienfeld</td><td></td><td>24 x 60 מ"מ</td></tr><tr><td>צינור תרבות</td><td>SPL</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>ratiolab</td><td>2712120</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלקטוז</td><td>סיגמא</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-רפינוז פנטהידראט</td><td>Daejung</td><td>6638-4105</td><td></td></tr><tr><td>חממה (רועד)</td>דגם <td>לבטרון</td><td></td><td>: SHI1</td></tr><tr><td>אינקובטור (סטטי)</td><td>ראייה מדעית</td><td></td><td>דגם: VS-1203PV-O</td></tr><tr><td>LiAc</td><td>סיגמה</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>Tecan</td><td>30050303 01</td><td>דגם: פיפטה רב-ערוצית אינסופית 200 פרו</td></tr><tr><td>20-200 ומיקרו; ל</td><td>גילסון</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית 2-20 ומיקרו; L</td><td>גילסון</td><td>FA10009</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אולימפוס אולימפוס</td><td></td><td>IX-53</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>סיגמא</td><td>P4338</td><td>ממוצע מול משקל 3,350</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>pRS426</td><td></td><td></td><td>כריסטיאנסון, ט.ו., סיקורסקי, ר.ס., דנטה, מ., שרו, ג'יי.ה. & Hieter, P. וקטורי מעבורת שמרים רב תכליתיים עם מספר עותק גבוה. גן. 110 (1), 119-122 (1992).</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha;-synuclein A30P</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 מקדם &alpha;-synuclein A53T</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha;-synuclein E46K</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promoter &alpha;-synuclein WT</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & לינדקוויסט, ס. תאי שמרים מספקים תובנה לגבי ביולוגיה ופתוביולוגיה של אלפא-סינוקלאין. מדע. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>מאגר</td><td>SPL</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>אפנדורף</td><td>6131 05560</td><td></td></tr><tr><td>W303a</td><td></td><td></td><td>מתנה מג'יימס בארדוול</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי מזון ללא אורציל</td><td>סיגמא</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>YPD</td><td>קונדלב</td><td>1547.00</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

מחלת פרקינסון היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה ומאופיינת במוות תאי מתקדם הנגרם על ידי היווצרות גופי לוי המכילים α-סינוקלאין מקופלים ומצטברים. α-סינוקלאין הוא חלבון קדם-סינפטי בשפע המווסת את הסחר בשלפוחית הסינפטית, אך הצטברות התכלילים החלבניים שלו גורמת לרעילות עצבית. מחקרים אחרונים גילו כי גורמים גנטיים שונים, כולל מלווים חיידקיים, עשויים להפחית את היווצרותם של אגרגטים α-סינוקלאין במבחנה. עם זאת, חשוב גם לעקוב אחר אפקט אנטי צבירה בתא כדי ליישם את זה כטיפול פוטנציאלי עבור החולים. זה יהיה אידיאלי להשתמש בתאים עצביים, אבל תאים אלה קשה לטפל ולוקח הרבה זמן להציג את הפנוטיפ נגד צבירה. לכן, נדרש כלי in vivo מהיר ויעיל להערכה נוספת של פעילות אנטי-צבירה in vivo . השיטה המתוארת כאן שימשה לניטור וניתוח הפנוטיפ האנטי-צבירה בשמרים האנושיים Saccharomyces cerevisiae, שביטאו α-סינוקלאין אנושיים. פרוטוקול זה מדגים כלי in vivo שיכולים לשמש לניטור רעילות תאית הנגרמת על-ידי α-סינוקלאין, כמו גם להיווצרות אגרגטים α-סינוקלאין בתאים.

הביטוי הגבוה של α-סינוקלאין ידוע כקשור למוות תאי עצב ולפרקינסון במערכות מודל של מחלת פרקינסון. מחקר זה מתאר שלוש שיטות לניטור ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין והיווצרות מוקדים של α-סינוקלאין מצטברים בשמרים. כאן, הסינוקלאין α התבטא יתר על המידה בשמרים, ונבחנו הפנוטיפים של α-סינוקלאין מסוג בר ושלוש גרסאות של α-סינוקלאין הידועות כמוטנטים משפחתיים של PD (איור 1 וטבלת החומרים).
הביטוי α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 בווקטור pRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי...

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

זוהי שיטה פשוטה לניטור פנוטיפים תאיים ותכונות של גרעיני R-pass. לעתים קרובות ניתן גם לשחזר אותו במחקר כלל-גנומי כדי למצוא את הגורמים הגנטיים המשפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass. מכיוון שמדובר באורגניזם מוטורי מבוסס היטב, טכניקה זו קלה ואינה דורשת זמן ומאמץ רב בהשוואה לשימוש בקווי תאים אנושיים או במודלים של בעלי חיים.הצבירה של גרעיני R-pass קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון. ניתן לבדוק את החלבונים או הכימיקלים שככל הנראה משפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass במודל שמרים אנושי זה. כדי להתחיל, לתקן שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-URA לבחירת תאים המכילים פלסמידים אלפא-סינוקלאין.לאחר מכן, חסן את טרנספורמטורי השמרים בעלי שלושת התיקונים לכל זן ל-3 מיליליטר של SRD-URA לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב האינדוקציה של אלפא-סינוקלאין תחת מקדם Gal1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את התרבות המחוסנת ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. למחרת, חסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית של 0.2 ב-600 ננומטר.לאחר מכן, לדגור את התרבות במשך שש שעות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, דילל את הדגימות לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר עם מים מזוקקים סטריליים בנתיב 1 של לוח 96 בארות כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.בצע דילולים סדרתיים של פי 5 מתאי השמרים על ידי הוספת 160 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים לחמשת הנתיבים הבאים והבטח נפח כולל של 40 מיקרוליטר בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטרים מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-URA עבור הבקרות ולוחות אגר SG-URA כדי לנטר רעילות. דגרו את הלוחות המנומרים במהופך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים.צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד היום הרביעי ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן לשלושה מיליליטרים של SRD-URA ולדגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה למשך הלילה. למחרת, מדדו את הצפיפות האופטית של התאים שגודלו בתרבית במשך הלילה ב-600 ננומטר וחסנו את התאים ל-200 מיקרוליטרים של SD-URA ו-SG-URA טריים בלוחות של 96 בארות.התאם את הנפח הסופי הכולל את התאים ל-200 מיקרוליטרים והתאם את הצפיפות האופטית הראשונית של התא ל-0.05 ב-600 ננומטר. התאם את הגדרות התוכנית בצלחת המיקרוטיטר. הגדר את טמפרטורת היעד ל-30 מעלות צלזיוס, את זמן המרווח ל-15 דקות, את משך הטלטול ל-890 שניות, את משרעת הרעד ל-5 מילימטרים ואת המדידה כספיגה ב-600 ננומטר.דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות. נתח את הנתונים על ידי התוויית עקומת הצמיחה. לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מיליליטר של SRD-URA ולתרבת אותם בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה.למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית הלילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי לצפיפות אופטית של 0.003 ב-600 ננומטר, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה, עד שהצפיפות האופטית מגיעה ל-0.2. לאחר מכן להוסיף 300 microliters של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. לאסוף מיליליטר אחד של תרבית התא על ידי צנטריפוגה ב 800 גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.יש לתלות את כדור התא בעדינות ב-30 מיקרוליטרים של מים מזוקקים. הכינו כרית ג'ל אגרוז על מגלשת זכוכית. יש להשעות את התאים ולטעון חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים על מגלשת הזכוכית, ולכסות את התאים באמצעות כרית האגרוז החתוכה לבדיקה.כדי לבצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של 100x, השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת תמונות באמצעות התוכנית ובחר brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של 100x באמצעות שמן טבילה. עבור למסנן פלואורסצנטי GFP והתאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה ל-300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. פתח את קובץ התמונה ונתח את הנתונים על ידי ספירת התאים בהתבסס על מספר המוקדים בתאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.ביטוי הסינוקלאין תחת מקדם Gal1 בווקטור PRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי על לוחית האגר המכילה גלקטוז כמשרה. ההבדל בצמיחה על ידי ביטוי סינוקלאין נצפה גם בתרביות נוזליות. בשני תנאי התרבית, סינוקלאין מסוג בר וריאנטים עם מוטציות E46K או A53T הראו פגמי גדילה עקב רעילות סינוקלאין.עם זאת, גרסת הסינוקלאין A30p, שאינה יוצרת אגרגטים, הראתה פנוטיפ לא רעיל. הזנים שהפגינו ציטוטוקסיות חמורה הראו מוקדים של אגרגטים של סינוקלאין, אך בגרסת A30p התפזרה צורה פחות רעילה של סינוקלאין בכל התאים. כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב להשתמש בתא באותו שלב גדילה בכל ניסוי, במיוחד כאשר אתה עוקב אחר פנוטיפים הקשורים לסינוקלאין.כפי שהראינו בנתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי, סינוקלאין יכול ליצור אגרגטים גדולים יותר. לכן, ניתן פשוט לחלק אותו על ידי צנטריפוגה וניתן לכמת אותו על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי לסינוקלאין. טכניקה זו ישימה לבדיקת תפוקה גבוהה כדי למצוא גורמים גנטיים חדשים ותרכובות כימיות המשפיעות על צבירה של סינוקלאין.לפיכך, אנו מקווים למצוא מועמדים טיפוליים חדשים למחלת פרקינסון.

a-method-to-study-synuclein-toxicity-aggregation-using-humanized

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים...

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ללמוד על הצטברות עצבי-מערכת בהצטברות נוירונים לעכבר הראשי דופמין. מערכת זרחזת-מצרפים לאגרגטים בנוירונים מושרה במבנה טרום-ביצוע. הדמיה אוטומטית של תאים אימונוofluor, וניתוח תמונה משוחדת להפוך את הפרוטוקול הזה חזק מתאים הקרנת תפוקה בינונית עד גבוהה של תרופות המעזות α-הצטברות.

לימוד טרום בנוי Fibril ריל המושרה α-Synuclein הצטברות בעכבר עובריים העיקרי מיילדופאמין דופמין המוח

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

חקור רעילות וצבירה של α-synuclein במודל שמרים אנושי לחקר מחלת פרקינסון. השיטה מאפשרת ניטור פנוטיפים תאיים וזיהוי גורמים גנטיים המשפיעים על יציבות החלבון.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

גלה סרטונים נוספים