שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

זוהי שיטה פשוטה לניטור פנוטיפים תאיים ותכונות של גרעיני R-pass. לעתים קרובות ניתן גם לשחזר אותו במחקר כלל-גנומי כדי למצוא את הגורמים הגנטיים המשפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass. מכיוון שמדובר באורגניזם מוטורי מבוסס היטב, טכניקה זו קלה ואינה דורשת זמן ומאמץ רב בהשוואה לשימוש בקווי תאים אנושיים או במודלים של בעלי חיים.

הצבירה של גרעיני R-pass קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון. ניתן לבדוק את החלבונים או הכימיקלים שככל הנראה משפיעים על יציבותם של גרעיני R-pass במודל שמרים אנושי זה. כדי להתחיל, לתקן שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-URA לבחירת תאים המכילים פלסמידים אלפא-סינוקלאין.

לאחר מכן, חסן את טרנספורמטורי השמרים בעלי שלושת התיקונים לכל זן ל-3 מיליליטר של SRD-URA לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב האינדוקציה של אלפא-סינוקלאין תחת מקדם Gal1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את התרבות המחוסנת ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. למחרת, חסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי עד שהם מגיעים לצפיפות אופטית של 0.2 ב-600 ננומטר.

לאחר מכן, לדגור את התרבות במשך שש שעות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, דילל את הדגימות לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר עם מים מזוקקים סטריליים בנתיב 1 של לוח 96 בארות כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.

בצע דילולים סדרתיים של פי 5 מתאי השמרים על ידי הוספת 160 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים לחמשת הנתיבים הבאים והבטח נפח כולל של 40 מיקרוליטר בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטרים מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-URA עבור הבקרות ולוחות אגר SG-URA כדי לנטר רעילות. דגרו את הלוחות המנומרים במהופך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך ארבעה ימים.

צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד היום הרביעי ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן לשלושה מיליליטרים של SRD-URA ולדגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה למשך הלילה. למחרת, מדדו את הצפיפות האופטית של התאים שגודלו בתרבית במשך הלילה ב-600 ננומטר וחסנו את התאים ל-200 מיקרוליטרים של SD-URA ו-SG-URA טריים בלוחות של 96 בארות.

התאם את הנפח הסופי הכולל את התאים ל-200 מיקרוליטרים והתאם את הצפיפות האופטית הראשונית של התא ל-0.05 ב-600 ננומטר. התאם את הגדרות התוכנית בצלחת המיקרוטיטר. הגדר את טמפרטורת היעד ל-30 מעלות צלזיוס, את זמן המרווח ל-15 דקות, את משך הטלטול ל-890 שניות, את משרעת הרעד ל-5 מילימטרים ואת המדידה כספיגה ב-600 ננומטר.

דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות. נתח את הנתונים על ידי התוויית עקומת הצמיחה. לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מיליליטר של SRD-URA ולתרבת אותם בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה.

למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית הלילה ל-3 מיליליטר של SRD-URA טרי לצפיפות אופטית של 0.003 ב-600 ננומטר, ולאחר מכן לדגור על התרבית ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סיבובים לדקה, עד שהצפיפות האופטית מגיעה ל-0.2. לאחר מכן להוסיף 300 microliters של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב 200 סיבובים לדקה. לאסוף מיליליטר אחד של תרבית התא על ידי צנטריפוגה ב 800 גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.

יש לתלות את כדור התא בעדינות ב-30 מיקרוליטרים של מים מזוקקים. הכינו כרית ג'ל אגרוז על מגלשת זכוכית. יש להשעות את התאים ולטעון חמישה מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים על מגלשת הזכוכית, ולכסות את התאים באמצעות כרית האגרוז החתוכה לבדיקה.

כדי לבצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של 100x, השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת תמונות באמצעות התוכנית ובחר brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של 100x באמצעות שמן טבילה. עבור למסנן פלואורסצנטי GFP והתאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה ל-300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. פתח את קובץ התמונה ונתח את הנתונים על ידי ספירת התאים בהתבסס על מספר המוקדים בתאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

ביטוי הסינוקלאין תחת מקדם Gal1 בווקטור PRS426 הראה פיגור גדילה משמעותי על לוחית האגר המכילה גלקטוז כמשרה. ההבדל בצמיחה על ידי ביטוי סינוקלאין נצפה גם בתרביות נוזליות. בשני תנאי התרבית, סינוקלאין מסוג בר וריאנטים עם מוטציות E46K או A53T הראו פגמי גדילה עקב רעילות סינוקלאין.

עם זאת, גרסת הסינוקלאין A30p, שאינה יוצרת אגרגטים, הראתה פנוטיפ לא רעיל. הזנים שהפגינו ציטוטוקסיות חמורה הראו מוקדים של אגרגטים של סינוקלאין, אך בגרסת A30p התפזרה צורה פחות רעילה של סינוקלאין בכל התאים. כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, חשוב להשתמש בתא באותו שלב גדילה בכל ניסוי, במיוחד כאשר אתה עוקב אחר פנוטיפים הקשורים לסינוקלאין.

כפי שהראינו בנתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי, סינוקלאין יכול ליצור אגרגטים גדולים יותר. לכן, ניתן פשוט לחלק אותו על ידי צנטריפוגה וניתן לכמת אותו על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן ספציפי לסינוקלאין. טכניקה זו ישימה לבדיקת תפוקה גבוהה כדי למצוא גורמים גנטיים חדשים ותרכובות כימיות המשפיעות על צבירה של סינוקלאין.

לפיכך, אנו מקווים למצוא מועמדים טיפוליים חדשים למחלת פרקינסון.