זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב חיידקי Escherichia באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

מטרת ניסוי זה היא לזהות אינטראקציות חלבון, חלבון והרכב תת-היחידות של קומפלקסים מקומיים של MultiPro מ-e coli. זה מושג על ידי הגברת תוצרי ה-PCR הליניאריים הספציפיים לרצף, קידוד תג ה-SPA וסמן לבחירה, המשולבים ומתבטאים במסגרת כהיתוך מסוף קרבוקסי ברקע ddy 3, 3 0 באמצעות מערכת רקומבינציה של חיידקים Fage lambda כשלב שני טיהור דו-שלבי מתבצע באמצעות מודלין פרה וחרוזי זיקה נגד דגל כדי לשחזר ביעילות קומפלקסים של חלבונים בשפע נמוך. לאחר מכן, החלבונים הקשורים הנרמזים עם מודלין פרה, מאגר פליטה או CEB מתעכלים עם טריפסין ומעובדים בספקטרומטריית מסה לזיהוי חלבונים.

התוצאות שהתקבלו מראות כי מספר יחידות המשנה של אנזים הליבה של RNA פולימראז, כולל סיום השעתוק, גורמי אנטי-קביעה מטוהרים ביעילות עם חלבון תת-יחידה D מתויג של RNA פולימראז, מה שמצביע על כך שניתן לחשוף ביעילות את הרכיבים הקשורים החדשים באמצעות גישה זו. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק עם שני טיהורי זיקה עגולים, כאשר עיבוד זהיר של ליזאט התא עם פתרונות חיץ מתאימים הוא הכרחי לחלוטין כדי להבטיח הצלחה בשחזור יעיל של מתחמי עומס בשפע נמוך וגבוה מתרביות בקנה מידה גדול. פרוטוקול זה מתחיל במיקוד של רצפים מוגברים ספציפיים לזן DDY 30 שבו מתבטא מנגנון הרקומבינציה האדומה של למבדה כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר מכן, כאשר החיידקים מפריחים את מערכת הרקומבינציה של למבדה המבטאת מתח בן לילה בשני מיליליטר של מדיום Luria bati או LB ב-32 מעלות צלזיוס, רועדים ב-180 סל"ד למחרת, מחסנים מיליליטר אחד של תרבית הלילה ל-70 מיליליטר של מדיום LB טרי בבקבוק חרוטי של 500 מיליליטר. גדל את החיסון ב-32 מעלות צלזיוס על ידי ניעור ב-180 סל"ד עד שה-OD 600 מגיע לכ-0.8. השרה את התאים על ידי דגירה של הבקבוק באמבט מים ב-42 מעלות צלזיוס על ידי ניעור עדין ב-180 סל"ד למשך 15 דקות.

מיד לאחר האינדוקציה, דגרו את הבקבוק באמבט מי קרח למשך 30 דקות לפחות עם ניעור. לאחר קצירת ושטיפת התאים כמתואר בנוהל הכתוב, ריס השהה את כדור התא ב-700 מיקרוליטר קרח, מים קרים וסטריליים וכתוצאה מכך תאים בעלי יכולת אלקטרו באמצעות אלקטרופורציה. הכניסו מיקרוליטר אחד של האמפליקון המטוהר ל -40 מיקרוליטר של התאים המוכשרים אלקטרו.

התאים עוברים אלקטרופוציה לאחר רקומבינציה ואינטגרציה הומולוגית. הטרנספורמטורים ששילבו בהצלחה את קלטת ה-slash לתוך הכרומוזום נבחרים על סמך התנגדות ל-canmycin לבחור שנאים מרובים לכתמים מערביים כדי לאמת את הדור הנכון של חלבוני ההיתוך המתויגים ב-SPA עם נוגדן שני אנטי-דגל M שהוא סלקטיבי כנגד אפיטופים של הדגל של תג ה-SPA להעביר 10 מיליליטר מתרבית הלילה ל-990 מיליליטר של שחפת טרייה. בתוספת של 25 מיקרוגרם למיליליטר של פחית מיצין בבקבוק של ארבעה ליטר.

גדל את התרבית ב-32 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד ב-250 סל"ד למשך חמש עד שש שעות עד שה-OD 600 מגיע בין שתיים לשלוש. העבירו את תרבית תג ה-SPA של ליטר אחד לבקבוקי צנטריפוגה נקיים וסובבו את התאים בארבע מעלות צלזיוס ו-3,993 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר החייאה, השעיית התאים כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

העבירו את הדגימות לכוס נירוסטה סטרילית המונחת על קרח לסוניקציה. טבלו את הגשושית לתוך הדגימה ועשו סוניקציה למשך שלוש דקות. לאחר סוניקציה, אפשר שתי דקות נוספות לקרר את הדגימה מהתחממות יתר בעקבות צנטריפוגה של הליזאט הסוניקט.

העבירו בזהירות את הסופרנטנט S מצינור הצנטריפוגה לצינור פלקון פוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר. הקפיאו את הדגימה באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו את תמצית התאים הקפואים הסוניקטיבית לתקופה מקסימלית של שישה חודשים במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. כדי להתחיל בטיהור הזיקה לתמצית התאים הקפואים, על ידי הנחת הצינור במים קרים, יש לדגור על תמצית תאי TH עם שלושה מיקרוליטרים של בנזו, נוקלאז למשך 30 דקות של ארבע מעלות צלזיוס.

לתערובת זו מוסיפים חומר ניקוי לא יוני Triton X 100 ו -200 מתלים מיקרוליטר של שני חרוזי אגרו נגד דגל M. מערבבים בעדינות את התוכן על ידי סיבוב הצינור במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס לאחר שלוש שעות סיבוב, צנטריפוגה את הצינור ב-1, 700 פעמים G למשך שש דקות. לאחר הצנטריפוגה הסר בזהירות כמה שיותר מהסטה מבלי להפריע לכדור המהירות הרופף.

השעו מחדש את הגלולה ב-SNA שנותר ולאחר מכן העבירו לעמודת הכנה מפוליפרופילן. הסר את תקעי השקע התחתונים של העמוד כדי לאפשר לפליטה להתנקז על ידי כוח הכבידה. זרם. לאחר מכן, שטפו את העמודה חמש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FC פעם אחת והמשיכו לקליב עם TEV כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

מעקב מהיר אחר המחשוף הן בחלק העליון והן בחלק התחתון של העמוד בחוזקה. מערבבים בעדינות את התוכן בעמודה על ידי סיבוב לילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר סיבוב לילה. מסננים את האלואט על ידי הסרת המכסה העליון והתקע התחתון לתוך העמודה החדשה.

שטפו את העמודה הישנה עם 400 מיקרוליטר של מאגר כריכה אחד x cal Modlin והשעיה של 150 מיקרוליטר של חרוזי קשירה של Cal Modlin. יש להוציא את החלבון הקשור בארבעה שברים של 50 מיקרוליטר בצינור אורף טרי. שימוש במאגר פליטה אחד של Modlin.

מחלקים את השבר המנומק לשני צינורות אורף נקיים בנפחים שווים. לאחר מכן יבש את תכולת שני הצינורות באמצעות ואקום מהירות. הפליטה המיובשת מצינור אחד משמשת להפעלת ג'ל צביעה כסוף כמתואר בטקסט ואילו השנייה מאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לשימוש עתידי בספקטרומטריית מסה לדגימה המיובשת, הוסיפו 50 מיקרוליטר ממאגר העיכול ו-0.9 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרית tris phosphine hydrochloric acid דגרו את התערובת למשך 45 דקות של טמפרטורת החדר לשלב ההפחתה לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של 500 מילי-מולרי IDO acetamide ודגרו בחושך למשך 40 דקות נוספות. כדי לאפשר אלקילציה לדוגמה לאחר סבב הדגירה השני, הוסף מיקרוגרם אחד של טיולים לתערובת. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות או לילה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.

הקפד לעצור את התגובה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של חומצה אצטית. לאחר מכן הכן את קצה הרוכסן של Millipore, קצה הפיפטה כמתואר בטקסט לקשירה יעילה של הפפטיד לצינור הקצה. מערבבים את תערובת הפפטידים 20 פעמים שוטפים את תערובת הפפטידים שהיא עשתה לקצה על ידי שאיבה וחלוקה של תמיסת הכביסה.

חזור על הליך זה פעמיים לקשירה יעילה של תערובת הפפטידים לקצה כשהקצה מכיל את הפפטיד הקשור. שאפו 10 מיקרוליטר מתמיסת ההרטבה ושיווי המשקל והוציא לתוך צינור אורף נקי. חזור על שלב זה פעמיים.

לאחר ייבוש הדגימות שנפלטו בוואקום מהירות, ניתן לנתח את הדגימות מיד על ידי ספקטרומטריית מסה או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש. עמודות המיקרו המשמשות בהליך זה ארוזות בכ-10 סנטימטרים של שרף C 18 ירחי של שלושה מיקרון ומתממשקות למקור יונים ננו אלקטרוספריי פרו ציון הממוקם בקו אחד עם מכשיר האורביטרפ. משאבת HPLC בינארית של זרימה ננו פרו ציון משמשת כדי לספק קצב זרימת קצה יציב של כ-300 ננוליטר לדקה במהלך הפרדות הפפטידים כדי להשיג דילול פפטיד להגדיר שיפוע חיץ אורגני בהתאם למורכבות הדגימה.

עבור דגימת SPA זו של e coli, לממס הפאזה הנייד A יש 95% מים בשיפוע HPLC ו-5% אצטו ניטריל עם 0.1% חומצה פורמית ואילו לממס B יש 5% מי שיפוע HPLC ו-95% אצטו ניטריל עם 0.1% חומצה פורמית לאחר חיפוש ספקטרומטריית מסה באמצעות אלגוריתם חיפוש במסד נתונים כגון Seaquest מול מסד נתונים של רצפי חלבון אי קולי. סינון סטטיסטי של התוצאה באמצעות אלגוריתם הסתברות כגון Star Quest כדי להבטיח שיעור גילוי שגוי נמוך, גם גורם סיגמא RNA פולימראז מתויג SPA וגם חלבון יאק LA בעל פונקציה לא ידועה מטוהרים במיוחד עם אנזים הליבה RNA פולימראז כולל תת-יחידות אלפא בטא ובטא פריים, כמו גם גורם מיחזור RNA פולימראז. בניגוד ל-RNA פולימראז מתויג, גורם סיגמא, יאק L קשור בנוסף לגורם אנטי-קביעה של סיום שעתוק חיוני, מה שמרמז על פונקציה מיוחדת בשעתוק.

מספר חלבונים קטנים יותר לטיהור משותף זוהו גם על ידי LCMS שלא נראו על הג'ל, כולל תת-היחידה של RNA פולימראז אומגה וגורמי שעתוק, סיום וקביעה ו-USA ו-NUSD. לעומת זאת, בניסוי עצמאי שתויג גיוס של מכונות גופרית, S-U-F-B-S-U-F-C ו-SUFD טיהרו זה עם זה, מה שמצביע על השתתפות משותפת בביוסינתזה של אשכול גופרית ברזל כקומפלקס פיגומים יחיד. דוגמה מייצגת זו מדגישה את העובדה שמתחמי MultiPro חיידקיים שנחקרו היטב בעבר והשתתפו בתהליכים ביולוגיים חיוניים כוללים לעתים קרובות רכיבים קשורים חדשים שניתן לזהות ביעילות.

באמצעות גישה זו, מספר העותקים הנמוך של חלבון ה-SUFB עשוי לגרום לעוצמת אות חלשה ביחס לעוצמה החזקה שנצפתה מניסויי המשיכה של SUFC ו-SUFD כדי להגדיר את ההרכב של קומפלקסים יציבים של חלבונים מרובי יחידות, ציוני טיהור משותף הוקצו לאינטראקציות בביטחון גבוה על ידי התחשבות בייחודיות של טרף הפיתיון, פיתיון פיתיון ויחסי טרף טרף. לאחר מכן שימוש בהליכי אשכולות גרפים כמו אלגוריתם אשכולות הסימון. אשכולות חלבונים בדידים מזוהים מרשת ה-PPI ההסתברותית המחולקת.

ניתן לדמיין רשתות אינטראקציה משוערות באמצעות cyto scape. ניתן להשתמש בשילוב נתוני פרוטאומיקה עם ראיות אסוציאציות פונקציונליות נוספות שהוסקו על ידי שיטות גנומיקה כדי לחקור תפקידים מכניסטיים חדשים של חלבוני אי קולי שהוערו בעבר. כאן, רשתות משנה של קומפלקסי חלבונים ומודולים פונקציונליים המשתתפים כשכונות פונקציונליות רחבות יותר הוגדרו ב-e coli.

האשכול ההיררכי העיקרי גרהאם מציג את דפוסי התחזיות הפונקציונליות וההערות הקיימות עבור הגנים היתומים והמאופיינים מבחינה תפקודית של אי קולי, צבעי צהוב וכחול מייצגים פונקציות קיימות ומוסקות בהתאמה בעוד שעוצמות הגוון משקפות ציוני ביטחון. תהליכים ביולוגיים הקשורים לשכונות שונות מצוינים בכניסות הימניות, מציגים את המרכיבים הבודדים של שכונה מייצגת על סמך ציוני הדמיון של רשת האינטראקציה הפיזית והתפקודית המשולבת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן לבודד קומפלקסים חלבונים יציבים מאסתיה קולי באמצעות טיהור הזיקה יחד עם גישת ספקטרומטריית מסה.

באופן עקרוני, ניתן ליישם טכניקה זו כדי לאפיין קומפלקסים של חלבון ממברנה או קומפלקסים של חלבונים מכל מין אחר לצורך שילוב מחדש ככל האפשר.