ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים טכניקה להחדרת מיקרו-חלקיקים למערכת הדם של דג זברה בוגר על ידי הזרקה לכליות הדג. המיקרו-חלקיקים שהוכנסו מוצגים עוד יותר בכלי הדם על ידי טכניקה פשוטה של הדמיה תוך-חיונית בזימים של הדגים. ניתן להשתמש בהליך זה, למשל, לביצוע מדידות חוזרות ונשנות של pH בדם דגים in vivo על ידי הכנסת בדיקות פלואורסצנטיות מיקרו-קפסולות ל-pH.

לשם כך, בשלב הראשון, הצבע הרגיש ל-pH SNARF-1 המצומד עם דקסטרן עטוף במעטפת הפוליאלקטרוליט החדירה למחצה בגישה שכבה אחר שכבה. הצבע הפלואורסצנטי מוזרם יחד למיקרו-ליבות סידן פחמתי נקבוביות, והליבות מצופות בשכבות מרובות של פולימרים שאינם מתכלים טעונים הפוך ומצופים בפולימר תואם ביולוגית המכיל פוליאתילן גליקול. לאחר מכן, ליבות סידן פחמתי נפתרות כדי להשיג מיקרו-קפסולות שלמות הסוגרות את SNARF-1.

בשלב השני של ההרדמה והקיבוע של הדגים, מוזרקות מיקרו-קפסולות מוכנות ישירות לכליה של החיה כדי להעביר צבע עטוף למערכת הדם של הדגים. לאחר מכן, יש צורך בניתוח מינימלי להסרת כיסוי זימים והסרת נימים של זימים של דגים. לאחר מכן, הדמיה של מיקרו-קפסולות בדם ורישום הספקטרום הפלואורסצנטי יכולה להיעשות in vivo על ידי מיקרוסקופיה תוך-חיונית לניטור pH בדם.

כאשר ההזרקה בוצעה כהלכה, ניתן לצפות במיקרו-קפסולות פלואורסצנטיות בזימי הדגים מיד לאחר ההליך. ניתן לרשום את ספקטרום התפרחת של הגשושית העטופה באמצעות ספקטרומטר המחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי. ל-SNARF-1 יש שתי שיאי פליטה, והיחס בין שני אורכי גל המתאימים לפסגות אלה יכול לשמש למדידת pH.

ההליך המוצע מאפשר להעביר מיקרו-קפסולות פלואורסצנטיות למערכת הדם של הדגים ולנטר מרחוק את הקרינה בדם הדגים in vivo. במקרה של מחקר פיזיולוגי, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא מדידות חוזרות ונשנות של פרמטרי דם בחיות מעבדה קטנות, שבדרך כלל קשות לביצוע. אם משתמשים בבדיקה פלואורסצנטית רגישה לאור, רצוי לבצע את כל ההליך בחדר מופחת אור.

מערבבים כאן שני מיליליטר של תמיסה של צבע פלואורסצנטי נבחר הקשור לפולימר, SNARF-1-dextran, עם 0.6 מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד מולרית אחת ו-0.6 מיליליטר של תמיסת נתרן פחמתי מולרית אחת תוך ערבוב מהיר. בשלב זה מסונתזים מיקרו-ליבות נקבוביות של סידן פחמתי הסוגרות את הצבע הפלואורסצנטי. לאחר חמש, 10 שניות של תסיסה, העבירו את המתלים לשני מיקרו-צינורות מיליליטר וצנטריפוגה למשך 15 שניות למיקרו-ליבות סידן פחמתי.

השליכו סופרנטנט, שטפו את הליבות בכשני מיליליטר מים נטולי יונים ונערו את המתלים. חזור על הליך הצנטריפוגה והכביסה שלוש פעמים. דגרו את המתלה למשך דקה אחת באמבט קולי כדי להפחית את הצטברות המיקרו-ליבות.

השעו מחדש את מיקרו-ליבות הסידן הפחמתי בכשני מיליליטר של תמיסה של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של הפולימר הקטיוני PAH כדי להפקיד את השכבה הפולימרית הראשונה על התבניות. שמור את המיקרו-ליבות בתמיסת ה-pH למשך כחמש דקות עם ניעור מתמיד. לאחר צנטריפוגה של 15 שניות, השליכו את הסופרנטנט עם PAH לא קשור ושטפו את המיקרו-ליבות במים שלוש פעמים על ידי מספר שלבי צנטריפוגה ושטיפה.

חזור על אותו הליך עם תמיסה של ארבעה מיליגרם למיליליטר של פולימר אניוני PSS כדי להפקיד את השכבה הפולימרית השנייה על התבניות. ממש לפני הוספת השכבה הבאה, רצוי למרוח דגירה של דקה באמבט קולי. חזור ברצף על התצהיר של פולימרים קטיוניים ואניונים שש פעמים כדי לקבל מעטפת מיקרו-קפסולות בת 12 שכבות.

לאחר מכן, דגרו מיקרו-ליבות עם קליפות בפולי-L-ליזין המושתל בפוליאתילן גליקול למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן, שטפו את המיקרו-ליבות המכוסות פעם אחת במים על ידי צנטריפוגה רציפה והשעיה מחדש. לבסוף, ממיסים תבניות סידן פחמתי בשני מיליליטר של תמיסת EDTA מולרית של 0.1, המותאמת ל-pH כ-7.1, לקבלת מיקרו-קפסולות חלולות.

יש להשליך את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה של 45 שניות, ולחזור על הכביסה עם EDTA פעמיים. יש להשליך את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה של 45 שניות, ולהוסיף שני מיליליטר מי מלח. חזור על שלבי צנטריפוגה של שטיפת מי מלח שלוש פעמים.

חקור את התפלגות הגודל והריכוז של המיקרו-קפסולות המוכנות בהמוציטומטר תחת מיקרוסקופ פלורסנט. השתמש ב-ImageJ או בתוכנה מקבילה לניתוח גודל החלקיקים. אחסן את הגשושית במעטפת בחושך.

להכנת מערכת אופטית, הנח את הסט הנדרש של מסנני פלורסנט למיקרוסקופ הפלואורסצנטי בהתאם למאפייני הצבע הפלואורסצנטי המיושם, והפעל את מנורת הפלורסנט. משוך את הידית לעיניות. חבר את הסיב האופטי מקצה אחד לספקטרומטר ובקצה השני לקולימטור.

באמצעות מתאמים, הפעל את הקולימטור במוקד של צינור המצלמה או יציאה זמינה אחרת של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לכיול המיקרו-קפסולות המוכנות, הניחו כחמישה מיקרוליטר מתרחיף המיקרוקפסולה על שקופית מיקרוסקופ, וייבשו את הטיפה במקום חשוך. הפעל את הספקטרומטר.

הפעל את תוכנית בקרת הספקטרומטר והכן את הספקטרומטר למדידות. כדי לכייל את המאפיינים הספקטרליים של ה-SNARF-1 המיקרו-מכוסה, השתמש בסדרה של מאגרים עם pH שונה. זרוק כ-10 מיקרוליטר של מאגר נתרן על המיקרו-קפסולות המיובשות עם SNARF-1, וכסה אותו בכיסוי.

הנח שקופית זכוכית על במת המיקרוסקופ. אתר את המיקרו-קפסולות באמצעות הגדלה של כ-400. סובב את ידית המיקרוסקופ ליציאת המצלמה.

רשום את הקרינה עם הספקטרומטר. ודא שהאות הספקטרלי נמצא הרבה מעבר לרמת הרקע, ושים לב שהמיקרו-קפסולות אינן בבועה. הימנע מתאורה ממושכת של אותן מיקרו-קפסולות מכיוון ש-SNARF-1 רגיש לפוטו-הלבנה.

סובב את הידית בחזרה לעיניות. חשב את היחס בין עוצמת הקרינה של SNARF-1 עטוף באורך הגל המתאים לשיאי הפליטה של הצבע הפרוטוני והדה-פרוטונציה. בנה עקומת כיול של יחס התלות ב-pH של המדיום.

אוספים כ -10 מיקרוליטר דם מדגים שהורדמו. קבע את ה- pH שלו על ידי מד pH בעזרת מיקרואלקטרודה. לאחר מכן, זרוק דם על שקופית עם מיקרו-קפסולות מיובשות, ורשום את היחס בין עוצמת הקרינה כמתואר עבור מאגרי כיול.

מכיוון שעליך לקחת בחשבון את השפעת רכיבי הדם על קריאת SNARF-1 עטוף במעטפת, התאם את המקדם הליניארי של עקומת הכיול כדי שהעקומה תתאים למדידות בדם הדגים. להכנת מחט להזרקה, שחרר מחט פלדה מקצה מזרק האינסולין על ידי הסרת פלסטיק בעזרת לנצט חד. הכנס את המחט באמצע הדרך למיקרו-נימי הזכוכית.

הלחמו אותו במהירות ובעדינות באמצעות לפיד גז. חבר מיקרו-נימי זכוכית למיקרו-מזרק, ושטוף אותו במים סטריליים שלוש פעמים. ודא שהנוזל זורם דרך המחט.

מלאו את המערכת במים. ודא שאין בועות במערכת. ביום הניסוי, קח את ההשעיה המוכנה של מיקרו-קפסולות במי מלח סטריליים המכילים בין חצי לשישה מיליון מיקרו-כמוסות למיקרוליטר.

השעו אותו מחדש ליד האמבטיה האולטראסונית למשך דקה אחת. במהלך ההזרקה הבאה, יש לנער את הבקבוקון מעת לעת כדי להשהות מחדש את המיקרו-קפסולות ולמנוע את הצטברותן. בעזרת כף, הוציאו את הדג מההרדמה, והניחו אותו בעדינות על ספוג לח במצב רוחבי כשהראש פונה לשמאל אם אתם ימניים או לכיוון ימין אם אתם שמאליים.

רגע לפני ההזרקה, יש לשאוב מילימטר עד שניים של אוויר לתוך נימי הזכוכית המחוברים למיקרו-מזרק. לאחר מכן, טען אותו בכשני מיקרוליטר של המיקרו-קפסולות המפוזרות. ייצב בעדינות את גוף הדג על הספוג ביד הלא דומיננטית שלך.

מצא את הקו הרוחבי של הדגים. שים את המחט מיליליטר אחד מתחת לנקודת האמצע של קטע בטן של הקו הרוחבי. לאחר מכן, בתנועת גירוד, הזיזו את קשקש הדג הצידה ובצעו ניקוב.

הכנס את המחט לגוף בזווית של 45 מעלות למשטח השולחן. דחוף את המחט לכיוון עמוד השדרה עד שהיא מונחת בזהירות על עמוד השדרה. לאחר מכן, שחררו לאט כמיקרוליטר אחד של תרחיף המיקרו-קפסולה לתוך הכליה, ומשכו לאט את המחט.

שוטפים את הדג מכף רגל ועד ראש בזרם מים כדי להסיר מיקרו-קפסולות שנשפכו באתר ההזרקה. השתמש במספריים לדיסקציה כדי להסיר את כיסוי הזימים מראש הדג ולהוציא את זימי הדגים. שוטפים זימים במים.

בעזרת כף מעבירים את הדג לשקופית מיקרוסקופ, ומניחים אותו על הבמה של מיקרוסקופ פלורסנט. כאשר אתה מבצע את ההליכים הבאים, וודא שזימי הדג לא יתייבשו. לשם כך, יש להרטיב אותם מעת לעת במים באמצעות פיפטה פסטר.

החשיכו את החדר והשתמשו בהגדלה נמוכה בדקו את הזימים כדי למצוא מיקרו-קפסולות פלואורסצנטיות. כאשר אתה מוצא אותה, העבר את העדשה לגודל גבוה יותר, ומקם אותה במרכז שדה הראייה. סובב את הידית ליציאה בעזרת ספקטרומטר מחובר.

רשום את האות הספקטרלי. סובב את הידית בחזרה לעיניות. חזור על המדידות עבור מיקרו-קפסולות שונות מספר פעמים.

העבירו את הדגים לאקווריום עם אוורור מתאים להתאוששות. ניתן לחזור על הליך המדידה עבור אדם אחד מספר פעמים באמצעות הרדמה חוזרת או שיטת קיבוע אחרת. התמונה מציגה דוגמה מייצגת למדידות in vivo של דם דג הזברה וההיפרקפניה על ידי צבע פלואורסצנטי עטוף SNARF-1.

בתנאי ביקורת, ה-pH בדם נשאר יציב במשך ארבע שעות לאחר הזרקת מיקרו-קפסולות, בעוד שחשיפה של חמש דקות תחת פחמן דו חמצני גבוה גורמת להחמצת דם הדגים. בעת ביצוע ההליך, חשוב למזער את הלחץ של בעלי החיים הנגרם כתוצאה מטיפול וניתוח. עם תרגול מסוים, גם ההזרקה וגם רישום האותות לוקחים בממוצע כשתיים-שלוש דקות, כך שהפרוטוקול הזה מאפשר להשלים מניפולציות לפני שהדג מתעורר מהרדמה קלה.

במהלך ההליך, וודאו שזימי הדג תמיד לחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע השתלה פשוטה ויעילה של מיקרו-חלקיקים במערכת הדם של דגים קטנים. כפי שהודגם, טכניקה זו נוחה מאוד להקלטות חוזרות ונשנות של pH בדם בדגי זברה בוגרים באמצעות מיקרו-קפסולות מלאות בבדיקה פלואורסצנטית.