Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה
8 בדצמבר 2017
Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להפוך את המיקרו-הזרקה של זחלי דג זרברה לקלה ומדויקת יותר. שיטה זו מסייעת לחוקרים המשתמשים במערכות מודל דג זברה כדי לשתק זחלי דג זברה בכיוונים ספציפיים במערכים גדולים. הטכניקה מאפשרת גישה קלה יותר לרקמות ספציפיות להזרקת מיקרו והדמיה, והיא יעילה מאוד כאשר נדרשים מספר גדול של זחלים ליישומים כמו זיהום או מודלים של סרטן קסנוגרפטים.
אסטרטגיות הייצור שלי בדגמי דג הזברה משלימות מאוד. האחת היא מעשה ידי אדם ופשוטה. השני חי ומורכב.
שניהם חולקים את אותו סולם גודל. שניהם שקופים. ושניהם מאפשרים תצפיות ברזולוציה של תא בודד.
כפי שאתה מראה כאן, ניתן לשלב אותם בקלות, ויכולים להיות להם יישומים לחקר כמעט כל מחלה רצינית. לאחר הכנת בלוק PDMS בצלחת פטרי מכוסה בסרט דק של E-3, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בצינור העברה כדי להעביר את המספר הנדרש של עוברים על פני בלוק ה-PDMS. בעזרת לולאת שיער או כלי דומה, דחפו את העוברים לתוך שקעי המיקרו-מבנה, במיוחד עבור כיווני גב וגחון.
בעת העמסת זחלים לתוך הדיוות, חשוב שיהיו מספיק מים המכסים את בלוק ה-PDMS כדי לאפשר מניפולציה קלה. חשוב גם לדחוף אותם לתוך החריצים כך שיישארו במקומם במהלך ההזרקה. כדי לכוון את דג הזברה על תעלות מיקרו-מבנה שהוכנו בעבר על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בצינור העברה כדי למשוך E-3 מבלוק ה-PDMS המעוצב.
מפלס E-3 אמור לרדת מתחת לקצה הבלוק, אך עדיין להיות נוכח במאגר ובתעלות, ושכבה דקה נשארת על ה-PDMS. בעזרת צינור העברה, העבירו 10 עוברים מורדמים למאגר, והקפידו לא לעלות על הקצוות. בעזרת לולאת שיער, תפעל כל עובר לראש המשפך, תחילה בכניסה לתעלה המתאימה, וודא שלעובר יש את הכיוון המתאים כשהוא נכנס לתעלה.
לאחר מכן, השתמש בלולאת שיער כדי להחליק כל עובר במורד התעלה, עד שהוא מגיע למיקרו-תכונות הכיוון בדפנות התעלה השומרות אותו במקומו. לאחר הכנת מחטי מיקרו-הזרקה ותמיסת מיקרו-הזרקה, השתמש בקצה פיפט מחודד דק כדי להעמיס חמישה מיקרוליטר מהתמיסה לתוך המחט. התקן את המחט למיקרומניפולטור המותקן על מעמד מגנטי, וחבר אותה למיקרו-מזרק משאבת PICO.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לשבור את קצה המחט בזווית של 45 מעלות על ידי צביטה של הקצה המחודד. התאם את גודל בולוס ההזרקה לננוליטר אחד על ידי התאמת זמן ההזרקה בבקר משאבת PICO. התאם את זווית מחט המיקרו-הזרקה בבקר המיקרומניפולציה, החל מ-45 מעלות כשהמחט מקבילה לאורך העובר.
ניתן להשתמש בזווית תלולה יותר כדי למזער את התנועה הרוחבית של העובר במהלך המיקרו-הזרקה. שליטה בצלחת הפטרי ביד שמאל, והמיקרומניפולטור הדרוש ביד ימין, מביאים את המחט קרוב ככל האפשר לאתר המיקרו-הזרקה המיועד, כגון השלפוחית האוטית. באמצעות בקר המיקרומניפולציה, הכנס את המחט לרקמת המטרה, והשתמש במתג הרגל של משאבת PICO כדי להזריק את הנפח שנקבע מראש.
אם הרקמה מתנגדת לחדירה, הקש בעדינות על כפתור בקר המיקרומניפולציה. כדי לשחרר את העוברים, השתמשו בצינור העברה כדי להזרים E-3 על פני השטח מלמעלה למטה, או על ידי סיבוב הצלחת כך שהעוברים ישוחררו לתוך ה-E-3 שמסביב. העבירו את העוברים לצלחת התאוששות של E-3 ללא MS-222.
כדי לסנן את העוברים באמצעות מכשיר ה-PDMS בבארות של צלחת שש בארות, השתמש בצינור של 1,000 מיקרוליטר או בצינור העברה צר כדי לטשטש את המכשיר על ידי הזרמת E-3 דרך היציאה. השתמש ב-E-3 וב-MS-222 כדי למלא את הבאר עד לכיסוי המכשיר. לאחר מכן, השתמש בצינור העברה כדי להעביר ארבעה עוברים שהוזרקו בעבר לכל באר.
בעזרת לולאת שיער או כלי דומה, מקמו את העוברים בכניסות תעלות ההדמיה בכיוון הרצוי, ודחפו אותם חלקית לתוך המכשיר. זה יעזור למשוך אותם למכשיר באופן שווה. בעזרת פיפט של 1,000 מיקרוליטר או פיפט העברה, משוך E-3 דרך המכשיר מהיציאה עד שהעוברים נמשכים לתעלות בכיוון הנכון להדמיה.
העבירו את צלחת הבאר למיקרוסקופ פלורסנט הפוך. כדי לצלם את העוברים, התאם את ההגדלה על ידי בחירת העדשה המתאימה, כגון פי 10 להדמיית נדידת הנטוראוהיל של דג הזברה. התאם את עוצמת מקור האור וזמן החשיפה עבור כל ערוץ, כך שכל אות יהיה ברור, אך לא רווי.
לבסוף, צלם תמונות עבור כל ערוץ פלואורסצנטי ומשודר. באמצעות מכשיר התעלה המיקרו-מובנה לייצוב עוברים בכיוון הרוחבי, נבדקה יכולתם של נויטרופילים להגיב לחומרים הכימותרפיים הסטנדרטיים fMLP ו-LTB4 שהוזרקו למיקרו-שלפוחיות האוטיות, של יומיים לאחר ההפריה עוברי דג הזברה. כדי לדמיין גיוס נויטרופילים, הזריקות אותרו עם דקסטרן רודמין במשקל מולקולרי גבוה, ובוצעו בעוברים טרנסגניים עם נויטרופילים פלואורסצנטיים ירוקים.
עוברים שלא הוזרקו ועוברים שהוזרקו עם רודמין בלבד שימשו כבקרות שליליות. לאחר המיקרו-הזרקה, העוברים הועברו למכשיר תעלת ההדמיה וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS לאחר 30 דקות וחמש שעות לאחר ההזרקה. כצפוי, מספר קטן של נויטרופילים פלואורסצנטיים גויסו לשלפוחית האוטית המוזרקת בנקודת הזמן המוקדמת, ככל הנראה עקב גיוס מתווך פגום.
מעניין לציין כי עוקב הדקסטרן רודמין נצפה מצטבר באוטוליטים במהלך הניסוי. עבור שני המושכים הכימיים, נויטרופילים גויסו במספרים גבוהים יותר, במיוחד בתגובה ל-LTB4. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לשפר מאוד את המהירות והדיוק של מיקרו-הזרקת דג הזברה.
פיתוח טכניקה זו הונע על ידי אתגרים ספציפיים במעבדה שלנו. חידדנו גישה זו כך שתתאים לצרכי הפרויקטים שלנו בנושא זיהום פטרייתי והשתלות גידול במודלים של דג זברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכי משטח מיקרו-מובנים להזרקת מיקרו דג זברה ולהדמיה חיה מורחבת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה למיקרו-הזרקה של זחלי דג-זברה, שמטרתה לשפר את הקלות והדיוק של התהליך. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לייצב את זחלי הדג-זברה בכיוונים ספציפיים, מה שמקל על הגישה לרקמות ממוקדות להזרקה מיקרוסקופית ולצילום.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
רקע
- מיקרו-הזרקה היא טכניקה קריטית במחקר דג-זברה.
- קיימים אתגרים בייצוב ובכיוון זחלי דג-זברה.
- יש צורך בשיטות יעילות ליישומים בקנה מידה גדול.
- המחקר כרוך לעיתים קרובות במודלים של זיהום או סרטן.
מטרת המחקר
- לפשט את תהליך המיקרו-הזרקה עבור זחלי דג-זברה.
- לשפר את הדיוק של מיקוד רקמות במהלך ההזרקות.
- להקל על השימוש בדג-זברה במגוון מודלים ניסויים.
שיטות ששימשו
- פיתוח כלים מיקרוסקופיים לייצוב.
- טכניקות לייצוב זחלים במערכים.
- אסטרטגיות לגישה לרקמות ספציפיות.
- יישום של שיטות במחקרים בקנה מידה גדול.
תוצאות עיקריות
- ייצוב משופר של זחלי דג-זברה במהלך הליכים.
- כיוון משופר להזרקה מיקרוסקופית ממוקדת.
- יעיל ליישומים בתפוקה גבוהה.
- הקלה על הגישה לרקמות לצורך צילום והזרקה.
מסקנות
- המתודולוגיה מסייעת משמעותית במחקר דג-זברה.
- היא מספקת גישה אמינה לצרכים ניסויים שונים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למערכות מודל אחרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microstructured devices for zebrafish larval microinjection address throughput and precision bottlenecks in phenotypic screening and target validation workflows. By enabling standardized embryo orientation and immobilization, the method supports reproducible compound testing in disease-relevant systems. This improves predictive confidence in early discovery for infection and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise tissue targeting for microinjection of pathogens or tumor cells, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardizes larval positioning across large arrays, reducing variability in infection or xenograft model initiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative imaging readouts of neutrophil recruitment in response to chemoattractants like fMLP and LTB4, enabling dose-response assessment.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of larvae in microfluidic channels, increasing throughput for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal imaging of immune cell dynamics post-injection, aligning with translational biomarker studies in inflammation and metastasis.
- Operational Value: Integrates with fluorescent microscopy platforms for standardized readout across preclinical validation stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges early discovery and preclinical evaluation by enabling standardized microinjection and live imaging in zebrafish larvae, a disease-relevant system for target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through controlled delivery of agents to specific tissues such as the otic vesicle.
- Screening: Enables assay-ready preparation of larvae in consistent orientations for reproducible compound exposure.
- Analytics: Generates fluorescent and transmitted light imaging outputs for quantifying cellular recruitment and tracer distribution.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via standardized imaging of neutrophil responses relevant to human inflammation and cancer models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology adaptable across multiple larval stages and experimental endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing technical variability in microinjection and imaging procedures.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of larval handling in multi-well formats.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing data quality in early-stage phenotypic screens.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on robust zebrafish model data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and zebrafish larval manipulation.
- Depends on access to PDMS fabrication, micromanipulators, and fluorescent microscopy systems.
- Necessitates standardization of embryo staging and anesthetic protocols across teams.
- Adaptation considerations include channel dimensions for different larval sizes and orientation requirements.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for careful fluidic priming to ensure consistent larval loading.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Orientation of Zebrafish on Divot Arrays and Microstructured Channels
2:39
Microinjection of Zebrafish
4:20
Screening of Embryos Using the PDMS Imaging Device
5:45
Results: Microinjection and Imagingof Zebrafish Larvae Using Microstructured Devices
7:04
Conclusion
