למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה
26 באפריל 2018
אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדמיין הליכים צעדיים המעורבים בבדיקת המוטציה Lambda Select cII בתאים מתורבתים של מכרסמים טרנסגניים או בעלי חיים מקבילים שטופלו בחומרים כימיים ופיזיקליים מעניינים. שיטת בדיקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר המוטציות כגון, האם תרכובת בדיקה היא מוטגנית? ואם כן, עד כמה הוא חזק של מוטגן?
האם זה גורם למוטציות ספציפיות לרצף? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בתרכובת בדיקה מינימלית עד כמעט כל תרכובת בדיקה. ניתן להשתמש בשיטה לבדיקת מוטגניות בתאי יונקים באמצעות גן מדווח משולב כרומוזומלי.
כדי ליצור תגובת אריזה אחת, הוסף חמישה מיקרוגרם של DNA גנומי בצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את תערובת התגובה הראשונה. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים לצינור 12 מיקרו-ליטר מתערובת התגובה השנייה ומשאירים למשך 90 דקות נוספות בחום של 30 מעלות צלזיוס.
לאחר 90 דקות, הוסף 1.1 מיליליטר של מאגר SM לצינור. לאחר מכן מערבב במרץ את הצינור עם ה-DNA הארוז בטמפרטורת החדר למשך כ-10 שניות. תן במהירות סיבוב דופק במיקרו-צנטריפוגה.
לאחר מכן השאירו את הצינור על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר כלורופורם לכל מיליליטר של DNA ארוז. אם הדגימה לא תעובד באותו יום, יש לערבב את הדגימה בעדינות ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים.
הכן 16 צינורות תחתונים עגולים סטריליים ו-16 צלחות אגר TB1 לדגימת DNA ארוזה אחת. השתמש בעשרה צינורות להקרנה ושישה לטיטרציה. לאחר מכן יש להוסיף 300 מיקרוליטר של תרבית ציפוי G1250 בכל צינור תחתון עגול.
לאחר מכן, כדי לטיטר, הוסף 10 מיקרוליטר של DNA ארוז ל-990 מיקרוליטר של מאגר SM ודילול של 1:100. ואז מערבול את הדגימה. הוסף 20 או 100 מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA של 1:100 לכל אחד משלושת צינורות הטיטר 20 או טיטר 100 בהתאמה.
לצורך סינון, הוסף 100 מיקרוליטר של דגימת ה-DNA הארוזה הלא מדוללת לכל אחת מ-10 צינורות ההקרנה. עבד את כל 16 צינורות הטיטרינג והסינון. מערבל את הצינורות למשך 10 שניות כדי לערבב את הרכיבים.
לאחר מכן דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהמארח E.coli יספוג את הפאג'ים. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיליליטר אגר עליון TB1 מותך. שמור על 55 מעלות צלזיוס לצינורות הטיטרציה וההקרנה המתאימים.
לאחר ההוספה, מערבל מיד את הצינורות בעדינות. כעת, שפכו את אגר TB1 לטיטר המתאים או לצלחת אגר TB1. הניחו לצלחות לעמוד 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שהאגר התמצק, הפוך והשאיר את כל 10 לוחות ההקרנה בחממה הנייחת בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך 46 עד 48 שעות. השאירו את שש צלחות הטיטר הנותרות באינקובטור נייח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או היום. לאחר הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס, ספרו את מספר הפלאקים שנוצרו בכל 3 לוחות הטיטר 20 והטיטר 100
.לאחר הדגירה ב-24 מעלות צלזיוס, ספרו את מספר הפלאקים שנוצרו ב-10 לוחות ההקרנה. כדי לאמת את הלוחות המוטנטיים הפוטטיביים, גרעין את הלוח עם קצה פיפטה סטרילי רחב. לאחר מכן העבירו את הלוח לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי מלא ב-500 מיקרוליטר של מאגר SM סטרילי.
לאחר מכן דגרו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מערבבים מיקרוליטר אחד של תמיסת הפאג 'עם 200 מיקרוליטר של תרבית הציפוי G1250 בצינור תחתון עגול סטרילי. לאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר 30 דקות, צלחו את תמיסת הפאג'ים עם הליבה ב-2.5 מיליליטר של אגר עליון TB1 מותך ודגרו בחום של 24 מעלות צלזיוס למשך 46 עד 48 שעות. לאחר שהפלאקים המשניים נראים לעין, השתמש בקצה פיפטה כדי לבחור רובד מוטנטי יחיד מבודד היטב של Lambda cII. העבירו את הלוח לצינור מיקרו-צנטריפוגה מלא ב -25 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים בפיפטה מספר פעמים.
השאירו את הצינור על מים רותחים למשך חמש דקות. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 18, 000 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מיד לאחר הצנטריפוגה, העבירו 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש המכיל 40 מיקרוליטר מתערובת המאסטר PCR.
לאחר הגברת PCR, טהר את המוצר המוגבר הבסיסי 432 עם הגן cII ואזורי האגף שלו המשולבים באמצעות ערכת טיהור ה-PCR. לאחר מכן רצף את הטרנסגן cII באמצעות מנתח DNA כדי לזהות את המוטציות. הלוחות המתקבלים הן בלוחות טיטר 20 והן בטיטר 100 נראים בבירור על ידי החזקתם ליד קופסת אור לבנה ועל רקע כהה.
כאן, עלילת העמודות מתארת את העוצמה המוטגנית של כימיקלים שונים בתרכובות הפיזיקליות שנבדקו. זה נעשה על ידי ניתוח מידת העלייה בתדירות המוטנטית היחסית של cII המבודד מפיצוצי הסיבים העובריים של העכבר. תרשים העמודות מתאר את כל ריאגנטי הבדיקה הללו המראים עלייה מובהקת סטטיסטית בקיפול בתדירות המוטנטית cII.
לאחר מכן, מודגם ספקטרום המוטציות של הטרנסגן cII בבלסטי הסיבים העובריים של העכבר המוקרנים ב-UVB. תרשים העוגה מראה עלייה משמעותית בתדירות היחסית של מעבר ציטידין יחיד או טנדם לתימידין בפירימידין דינוקלאוטידים בהשוואה לביקורת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה עד עשר שעות אם היא מבוצעת כראוי, למעט זמני הכנה לצלחת פס חיידקים בתרבות.
בריצוף DNA, לאחר ניקוד המוטציות cII. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח מוטציות של תרכובת בדיקה במערכת מודל במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את מבחן המוטציה של Lambda Select cII, המשמש להערכת מוטגניות בתאים מתורבתים של מכרסמים או בעלי חיים מהונדסים גנטית שנחשפו לסוכנים שונים. שיטה זו חיונית להבנת הפוטנציאל המוטגני של תרכובות נבדקות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מחקר מוטציות
- בדיקת גנוטוקסיות
- הערכת מסרטנים
רקע
- מבחן המוטציה של Lambda Select cII הוא שיטה מוכרת ומקובלת.
- הוא מעריך את ההשפעות המוטגניות של סוכנים כימיים ופיזיים.
- מבחן זה משתמש בגן דיווח משולב כרומוזומלי.
- הוא מספק תובנות לגבי העוצמה והספציפיות של מוטגנים.
מטרת המחקר
- להמחיש את ההליכים הצעד-אחר-צעד של מבחן המוטציה של Lambda Select cII.
- לקבוע אם תרכובת נבדקת היא מוטגנית והעוצמה שלה.
- לחקור את השראת מוטציות ספציפיות לרצף.
שיטות בשימוש
- שימוש בתאים מתורבתים ממכרסמים מהונדסים גנטית.
- חשיפה לסוכנים כימיים ופיזיים של עניין.
- הערכת מוטגניות באמצעות גן דיווח.
- המחשה צעד-אחר-צעד של הליכי המבחן.
תוצאות עיקריות
- המבחן מזהה ביעילות תרכובות מוטגניות.
- הוא מדגים את העוצמה של סוכני בדיקה שונים.
- ניתן לנתח מוטציות ספציפיות לרצף.
- השיטה מתאימה למגוון רחב של תרכובות נבדקות.
מסקנות
- מבחן המוטציה של Lambda Select cII הוא כלי חשוב במחקר מוטציות.
- הוא מספק נתונים קריטיים על המוטגניות של תרכובות.
- פרוטוקול זה משפר את ההבנה של מנגנונים מוטגניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The Lambda Select cII mutation detection system enables quantitative assessment of mutagenic potential in mammalian cells, supporting early-stage genotoxicity screening in drug discovery. By measuring mutant frequency and spectrum, it provides mechanistic insights that help de-risk lead compounds before significant investment. This assay supports data-driven go/no-go decisions in preclinical development by identifying DNA-reactive agents with statistical confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA damage mechanisms and functional validation of genotoxic risk in lead candidates.
- Operational Value: Provides a chromosomally integrated reporter system for consistent, reproducible mutation detection across cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mutant frequency data to rank-order mutagenic potency of test compounds.
- Operational Value: Delivers standardized plaque-based readouts compatible with high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes mutation spectra (e.g., UVB-induced C→T transitions) to link mechanism to structural alerts.
- Operational Value: Supports cross-species extrapolation from transgenic rodent models to human relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the genotoxicity testing cascade, informing early discovery through lead optimization by providing quantitative mutagenicity data prior to traditional assays like Ames or micronucleus.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on DNA repair pathways and mutagenic mechanism elucidation.
- Screening: Enables reproducible, quantitative scoring of mutant plaques for compound prioritization.
- Analytics: Delivers mutant frequency and spectrum data for structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo mutagenicity via transgenic rodent models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mutagenicity profiling across therapeutic areas and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genotoxic risk assessment through mutation spectrum analysis.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized phage rescue and plating protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering mutagenic leads early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mutagenicity thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, phage techniques, and DNA sequence analysis.
- Dependent on lambda phage packaging systems, bacterial host strains, and selective agar media.
- Necessitates cross-team standardization between discovery toxicology and analytical genomics groups.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies across primary and immortalized cell lines.
- Practical limitations include multi-day workflow duration and sensitivity to genomic DNA quality and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
In Vitro Packaging Reaction
1:51
Plating the Packaged DNA Samples
3:36
Examination of the Titer and the Screening Plates to Determine the Putative cll Mutants, Verification of Mutant Plaques, PCR Amplification, and DNA Sequencing
5:31
Results: Use of λ Select cll Assay to Detect Mutations in the cll Transgenes from the Genomic DNA
6:31
Conclusion
