Name: למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למד את שיטת Lambda Select cII לאיתור מוטציות בתאים מתורבתים ממכרסמים טרנסגניים. שיטה זו מאפשרת הערכת פוטנציאל מוטגני של תרכובות כימיות ופיזיות במחקר מוטציות וגנוטוקסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות התרומות של כל עמיתיו ושותפיו ללימודים המקורי שלנו, אשר התוצאות כבר התייחסו בכתב היד (להמחשה). העבודה של המחברים נתמך על ידי מענקים הלאומית המכון של שיניים, מחקר ואסטתיים של מכוני הבריאות הלאומיים (1R01DE026043) ל AB ו מן האוניברסיטה של מחלת California Tobacco-Related מחקר לתוכנית AB ( TRDRP-26IR-0015) סטריט (TRDRP-25IP-0001). נותני החסות של המחקר שהיה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, נתונים לפרשנות, כתיבת הדו ח, או ההחלטה להגיש לפרסום.

כל המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Λ cII בחירה וזמינותו משמש לצורך זיהוי של מוטציות transgene cII התאוששה הדנ א הגנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות של BB מכרסמים3. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכילה עותקים של וקטור הסעות λLIZ chromosomally משולב, אשר נושאת את cII טנדם (294 bp) ו לצי (1,080 bp) transgenes, כמו גנים כתב mutational1, 2 , 25. λ cII בחירה וזמינותו מבוסס על האחזור של הווקטורים הסע...

מגוון רחב של מודלים בבעלי חיים מהונדס ומערכות איתור מוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים Big Blue (המכונים להלן BB), בחר λ cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצה זו רבים אחרים מחקר קבוצות ברחבי העולם1,2, 3,4,5,6,7,8,9. במשך 16 השנים האחרונות, חקרנו את ההשפעות המוטגניות של סוכנים כימי ו/או גופניים שונים באמצעות בעלי חיים אלה הטרנסגניים או שלהם תרביות תאים עובריים פיברובלסט המקביל שטופלו תרכובת המבחן ולאחר לאחר מכן ניתח גן # מושגים בסיסיים, גנוטיפ של transgene cII מאת λ cII בחירה וזמינותו של רצפי DNA, בהתאמה10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכיל bacteriophage λ הסעות וקטור (λLIZ) משולב על כרומוזום 4 כמו2,1,concatemer ראש זנב מרובת עותקים25. הווקטור הסעות λLIZ נושאת שני גנים כתב mutational, כלומר לצי של cII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ cII בחירה וזמינותו מבוססת על החזרתה של הווקטורים הסעות λLIZ של ה-DNA גנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות חיות הטרנסגניים1,2,25 . הווקטורים הסעות λLIZ התאושש ארוזים ואז לתוך ראשי phage λ מסוגל להדביק מארח מחוון Escherichia coli. לאחר מכן, נגוע החיידקים גדלים בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר את הניקוד וניתוח של מוטציות של cII transgene1,3.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור וזמינותו בחר cII λ, אשר מורכב של בידוד של דנ א גנומי של תאים/איברים של חיות הטרנסגניים מטופלים במבחנה/ויוו עם החזרה במתחם, בדיקה של λLIZ מעבורת וקטורים מן ה-DNA גנומי, אריזה של הווקטורים לתוך phages λ זיהומיות, זיהום של החיידק המארח עם bacteriophages, זיהוי cII-המוטציות בתנאים סלקטיבית כדי לקבוע את תדירות מוטציה של cII , ו ניתוח רצף הדנ א להקים cII מוטציה הספקטרום. הפרוטוקול ניתן להחיל על העכבר הטרנסגניים/חולדה תא תרבויות מטופלים במבחנה עם סוכן כימי/פיזי של עניין, או רקמות/איברים מבעלי החיים המתאים שטופל ויוו עם בדיקה כימית/סוכן1, 2,4,48,49,50,51,52. מצגת סכמטי של λ cII בחירה וזמינותו מוצג באיור1.

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>MO מעבדות ביו, בע"מ</td><td>12112-05</td> כיתה <td>בקטריולוגית</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 ערכת ריצוף מחזור</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>ללא</td></tr><tr><td>קזאין פפטון</td><td>אלפא Aesar</td><td>H26557</td><td>ללא</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>ללא</td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP 9724-500</td><td>ללא</td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 תגובות טיהור PCR</td></tr><tr><td>נתרן אצטט טריהידרט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>Taq5000 DNA פולימראז&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>מקרון Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack אריזת תמצית</td><td>Stratagene Corp., נרכשה על ידי BioReliance | חברת סיגמא-אולדריץ'</td><td>200223</td><td>50 תגובות אריזה</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

למדא בחר cii מערכת איתור מוטציה

The Lambda Select cII Mutation Detection System

מספר מודלים בבעלי חיים מהונדס, מערכות זיהוי המוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים, בחר למבדה (λ) cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור למדא בחר cII מוטציה וזמינותו, אשר ניתן להחיל על תאים בתרבית של העכברים הטרנסגניים/חולדות או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: (1) בידוד של דנ א גנומי מתאי או איברים/רקמות חיות הטרנסגניים שטופלו חוץ גופית או ויוו, בהתאמה, תרכובת מבחן; (2) שחזור של וקטור הסעות למדא נושא גן כתב mutational (כלומר, cII transgene) של ה-DNA גנומי; (3) אריזה של הווקטורים שניצלו לתוך bacteriophages זיהומיות; (4) להדביק חיידקים המארח ו culturing בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר הפצת מוטציות המושרה cII ; (5) הקלפים של cII-מוטציות ו- DNA רצף ניתוח כדי לקבוע את תדירות מוטציה cII ואת הספקטרום מוטציה, בהתאמה.

בהתאם לנתונים הפצה, בדיקות פרמטרית או שאינם פרמטרי משמשים כדי לקבוע את המשמעות של הבדל בשכיחות מוטציה cII בין קבוצות הטיפול ושליטה (קרי, המושרה לעומת תדרים מוטציה ספונטנית) . השוואה של התדרים מוטציה המושרה cII קבוצות טיפול שונה נעשית על ידי שונים (pairwise) בדיקות סטטיסטיות, לפי הצורך. המבחן ההיפר-גיאומטרית של אדמס ו- Skopek משמש בדרך כלל כדי להשוות את ספקטרום מוטציה המושרה, ספונטני הכולל57, למרות בדיקות אחרות, כגון χ2 המבחן או...

אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.

למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לדמיין הליכים צעדיים המעורבים בבדיקת המוטציה Lambda Select cII בתאים מתורבתים של מכרסמים טרנסגניים או בעלי חיים מקבילים שטופלו בחומרים כימיים ופיזיקליים מעניינים. שיטת בדיקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר המוטציות כגון, האם תרכובת בדיקה היא מוטגנית? ואם כן, עד כמה הוא חזק של מוטגן?האם זה גורם למוטציות ספציפיות לרצף? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בתרכובת בדיקה מינימלית עד כמעט כל תרכובת בדיקה. ניתן להשתמש בשיטה לבדיקת מוטגניות בתאי יונקים באמצעות גן מדווח משולב כרומוזומלי.כדי ליצור תגובת אריזה אחת, הוסף חמישה מיקרוגרם של DNA גנומי בצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את תערובת התגובה הראשונה. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים לצינור 12 מיקרו-ליטר מתערובת התגובה השנייה ומשאירים למשך 90 דקות נוספות בחום של 30 מעלות צלזיוס.לאחר 90 דקות, הוסף 1.1 מיליליטר של מאגר SM לצינור. לאחר מכן מערבב במרץ את הצינור עם ה-DNA הארוז בטמפרטורת החדר למשך כ-10 שניות. תן במהירות סיבוב דופק במיקרו-צנטריפוגה.לאחר מכן השאירו את הצינור על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר כלורופורם לכל מיליליטר של DNA ארוז. אם הדגימה לא תעובד באותו יום, יש לערבב את הדגימה בעדינות ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים.הכן 16 צינורות תחתונים עגולים סטריליים ו-16 צלחות אגר TB1 לדגימת DNA ארוזה אחת. השתמש בעשרה צינורות להקרנה ושישה לטיטרציה. לאחר מכן יש להוסיף 300 מיקרוליטר של תרבית ציפוי G1250 בכל צינור תחתון עגול.לאחר מכן, כדי לטיטר, הוסף 10 מיקרוליטר של DNA ארוז ל-990 מיקרוליטר של מאגר SM ודילול של 1:100. ואז מערבול את הדגימה. הוסף 20 או 100 מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA של 1:100 לכל אחד משלושת צינורות הטיטר 20 או טיטר 100 בהתאמה.לצורך סינון, הוסף 100 מיקרוליטר של דגימת ה-DNA הארוזה הלא מדוללת לכל אחת מ-10 צינורות ההקרנה. עבד את כל 16 צינורות הטיטרינג והסינון. מערבל את הצינורות למשך 10 שניות כדי לערבב את הרכיבים.לאחר מכן דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהמארח E.coli יספוג את הפאג'ים. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיליליטר אגר עליון TB1 מותך. שמור על 55 מעלות צלזיוס לצינורות הטיטרציה וההקרנה המתאימים.לאחר ההוספה, מערבל מיד את הצינורות בעדינות. כעת, שפכו את אגר TB1 לטיטר המתאים או לצלחת אגר TB1. הניחו לצלחות לעמוד 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שהאגר התמצק, הפוך והשאיר את כל 10 לוחות ההקרנה בחממה הנייחת בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך 46 עד 48 שעות. השאירו את שש צלחות הטיטר הנותרות באינקובטור נייח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או היום. לאחר הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס, ספרו את מספר הפלאקים שנוצרו בכל 3 לוחות הטיטר 20 והטיטר 100.לאחר הדגירה ב-24 מעלות צלזיוס, ספרו את מספר הפלאקים שנוצרו ב-10 לוחות ההקרנה. כדי לאמת את הלוחות המוטנטיים הפוטטיביים, גרעין את הלוח עם קצה פיפטה סטרילי רחב. לאחר מכן העבירו את הלוח לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי מלא ב-500 מיקרוליטר של מאגר SM סטרילי.לאחר מכן דגרו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מערבבים מיקרוליטר אחד של תמיסת הפאג 'עם 200 מיקרוליטר של תרבית הציפוי G1250 בצינור תחתון עגול סטרילי. לאחר מכן דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, צלחו את תמיסת הפאג'ים עם הליבה ב-2.5 מיליליטר של אגר עליון TB1 מותך ודגרו בחום של 24 מעלות צלזיוס למשך 46 עד 48 שעות. לאחר שהפלאקים המשניים נראים לעין, השתמש בקצה פיפטה כדי לבחור רובד מוטנטי יחיד מבודד היטב של Lambda cII. העבירו את הלוח לצינור מיקרו-צנטריפוגה מלא ב -25 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים בפיפטה מספר פעמים.השאירו את הצינור על מים רותחים למשך חמש דקות. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 18, 000 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מיד לאחר הצנטריפוגה, העבירו 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש המכיל 40 מיקרוליטר מתערובת המאסטר PCR.לאחר הגברת PCR, טהר את המוצר המוגבר הבסיסי 432 עם הגן cII ואזורי האגף שלו המשולבים באמצעות ערכת טיהור ה-PCR. לאחר מכן רצף את הטרנסגן cII באמצעות מנתח DNA כדי לזהות את המוטציות. הלוחות המתקבלים הן בלוחות טיטר 20 והן בטיטר 100 נראים בבירור על ידי החזקתם ליד קופסת אור לבנה ועל רקע כהה.כאן, עלילת העמודות מתארת את העוצמה המוטגנית של כימיקלים שונים בתרכובות הפיזיקליות שנבדקו. זה נעשה על ידי ניתוח מידת העלייה בתדירות המוטנטית היחסית של cII המבודד מפיצוצי הסיבים העובריים של העכבר. תרשים העמודות מתאר את כל ריאגנטי הבדיקה הללו המראים עלייה מובהקת סטטיסטית בקיפול בתדירות המוטנטית cII.לאחר מכן, מודגם ספקטרום המוטציות של הטרנסגן cII בבלסטי הסיבים העובריים של העכבר המוקרנים ב-UVB. תרשים העוגה מראה עלייה משמעותית בתדירות היחסית של מעבר ציטידין יחיד או טנדם לתימידין בפירימידין דינוקלאוטידים בהשוואה לביקורת. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שמונה עד עשר שעות אם היא מבוצעת כראוי, למעט זמני הכנה לצלחת פס חיידקים בתרבות.בריצוף DNA, לאחר ניקוד המוטציות cII. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח מוטציות של תרכובת בדיקה במערכת מודל במבחנה.

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

סרטון זה מדגים את תפקידה של תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית בזיהוי מוטציה אינדל בדגימת DNA. הדיוק והרגישות הגבוהים של ddPCR מאפשרים זיהוי מדויק ועקבי של מוטציות נדירות הקיימות בדגימה, גם ברמות נמוכות. הוא יכול לזהות ולכמת מוטציות אינדל באזורים שונים של הגנום, ומספק תובנות חשובות על מנגנוני המוטציה וההשלכות התפקודיות של מוטציות אלה.

תגובת שרשרת דיגיטלית של פולימראז טיפתי לזיהוי מוטציות אינדל בגני מטרה

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים "קיר" סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.

qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

מאמר זה מציג את היישום של שיטת זיהוי בתדר נמוך המבוססת על ריצוף Sanger בלימפומה אנגיואימונובלסטית. לספק בסיס ליישום שיטה זו על מחלות אחרות.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

למד את שיטת Lambda Select cII לאיתור מוטציות בתאים מתורבתים ממכרסמים טרנסגניים. שיטה זו מאפשרת הערכת פוטנציאל מוטגני של תרכובות כימיות ופיזיות במחקר מוטציות וגנוטוקסיות.

למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

גלה סרטונים נוספים