ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ליצור, לכייל ולהשתמש במיקרו-אלקטרודות סלקטיביות של יוני אשלגן חד-קוטביות. שימוש באלקטרודות כאלה מאפשר הערכה כמותית של דינמיקת ריכוז יוני אשלגן מעוררים בפרוסות מוח של מבוגרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה, כגון זיהוי המנגנונים התאיים והמולקולריים להומאוסטזיס של יוני אשלגן במערכת העצבים המרכזית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבנוסף להיותם שיטת ייצור קלה ופשוטה, חיישני מיקרו-אלקטרודות מייצגים את תקן הזהב למדידת ריכוז יוני אשלגן. להכנת נימי הזכוכית בורוסיליקט לסילניזציה, הניחו אותם בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. מלאו את הצינור החרוטי בחומצה הידרוכלורית מולרית אחת, ודגרו על נימי הזכוכית בחומצה הידרוכלורית בתסיסה עדינה למשך הלילה למשך שש שעות לפחות.

לאחר מכן, שטפו לזמן קצר את הנימים באתנול 70% ולאחר מכן יבשו אותם לחלוטין בטמפרטורה של 100 עד 120 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות. אחסן את הנימים השטופים במיכלים עם חומר ייבוש סידן גופרתי נטול מים עד ארבעה שבועות לפני שימוש נוסף. לפני הסילניזציה, משוך את הנימים לקצה דק באמצעות מושך מיקרואלקטרודות.

לאחר מכן, הניחו את המיקרו-אלקטרודות במיכל זכוכית באמצעות סרט הדבקה הניתן לחיטוי, כך שהאלקטרודות יהיו מוגבהות מלמטה כדי למנוע שבירת קצה. לאחר מכן, הסר כ- 0.5 מיליליטר של תמיסת סילאניזציה של 5% DDS מהמיכל שלו בשיטת החלפת החנקן. מלאו בלון בגז חנקן והצמידו מזרק או צינור ומחט לבלון.

לאחר מכן, הכנס את המחט למיכל ה-DDS תוך כדי משיכת DDS למזרק נפרד באמצעות מחט ארוכה יותר. לאחר מכן, יש למרוח את תמיסת הסילניזציה בטיפה על קצות הפיפטות ולכסות מיד את המיכל. הכניסו את המיכל המכיל את המיקרואלקטרודות עם תמיסת סילניזציה לתנור מעבדה שחומם מראש בחום של 170 עד 180 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 12 שעות או בטמפרטורה של 200 עד 220 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה מוציאים את הצלחת מהתנור. הניחו את הצלחת על ספסל בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר לכלי הזכוכית להתקרר. הוציאו את המיקרו-אלקטרודות מהצלחת והניחו אותן בכלי אטום מלא בחומר ייבוש.

ניתן להשתמש במיקרואלקטרודות סילניות שנשמרות ללא לחות עד שבוע לאחר הסילניזציה. כדי לטשטש את האלקטרודות, הכינו תמיסת מלאי של קוקטייל אשלגן יונופור ושמרו אותו בכלי אטום ואטום בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי של נתרן כלורי 300 מילי-מולרי HEPES עם חוצץ HEPES ב-pH 7.4.

תקן את האלקטרודה במהדק. לאחר מכן, בעזרת מכשיר קהה, גרפו את קצה האלקטרודה לרוחב של כ-10 עד 20 מיקרומטר, ולאחר מכן, מלאו מחדש את האלקטרודה בנתרן כלורי חוצץ HEPES באמצעות קצה MicroFil בגודל 28 המחובר למזרק. שימו לב שתמיסת המלח הגיעה לקצה קצה המיקרואלקטרודה וודאו שהמיקרואלקטרודה נקייה מבועות גדולות שעלולות להפריע לזרימת הזרם.

בעזרת מיקרופיפטה, מרחו טיפה קטנה של יונופור האשלגן ליד קצה המיקרואלקטרודה. אם האלקטרודה עברה סילן כהלכה, הטיפה תיספג בקצה השבור. מלאו את האלקטרודה עד כ-1 מילימטר עם יונופור האשלגן והסר את העודפים באמצעות נייר טישו.

כדי לכייל את המיקרואלקטרודות, בועות את כל תמיסות הכיול והחיץ של הפרוסות עם 95% חמצן/5% פחמן דו חמצני למשך 20 דקות לפחות לפני תחילת הניסוי. התחל לחלחל את האמבטיה עם ACSF המכיל יון אשלגן בגודל 4.5 מילי-מולרי בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. הנח את האלקטרודה הסלקטיבית של יוני האשלגן לתוך מחזיק האלקטרודה המחובר לראש האלקטרודה על המניפולטור.

לאחר מכן, הכנס את קצה האלקטרודה לתוך פרפוסאט האמבטיה. ודא שהאלקטרודה הטחונה של כסף/כסף כלוריד שטופה באותה תמיסה והזרימה יציבה. החל פתרונות כיול בצורה צעדית ורשום את השינויים הפוטנציאליים במילי-וולט על פני קצה האלקטרודה.

המתן עד שהפוטנציאל בקצה האלקטרודה יגיע לערך יציב לפני שתעבור לתמיסה הבאה. לאחר מכן, מדוד את שינוי המתח במצב יציב בתגובה ליישום תמיסות הכיול על קצה האלקטרודה. ודא כי שיפוע תגובת מתח האלקטרודה הוא לפחות 52 ולא יותר מ-59 מילי-וולט לכל שינוי של פי עשרה בריכוז האשלגן.

להכנת פרוסות היפוקמפוס, בצע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים מהחלק הזנבי של הגולגולת כדי לחתוך את הקרקפת לאורך קו האמצע. תוך כדי נסיגה ידנית של הקרקפת, בצע שני חתכים אופקיים של סנטימטר אחד מהנקב מגנום לאורך צידי הגולגולת. לאחר מכן, בעזרת מספריים עדינות, בצע חתך לאורך קו האמצע מהחלק האחורי של הגולגולת לאף.

לאחר מכן, הכנס מלקחיים עדינים ליד קו האמצע ומשוך את הגולגולת החתוכה בשני חלקים. חלץ את מוח העכבר מהגולגולת והשתמש בלהב כדי להסיר את המוח הקטן, קליפת המוח הקדם-מצחית ופקעות הריח, הממוקמים בהתאמה בחלקים הזנביים והרוסטרליים של המוח. לאחר מכן, הרכיבו את בלוק המוח על מגש הוויברטום באמצעות Super Glue.

מלאו את מגש הוויברטום בתמיסת חיתוך קרה כקרח. לאחר מכן, חותכים קטעי רקמה במישור העטרה בעובי של 300 מיקרומטר. בדרך כלל ניתן לאסוף ארבע עד שש פרוסות היפוקמפוס קורונליות.

לאחר חיתוך כל חלק, העבירו מיד את הפרוסה לכוס המחזיקה את הפרוסה המחוממת ל -32 עד 34 מעלות צלזיוס. שמור את החלקים בטמפרטורה זו למשך 20 דקות לפני העברת הכוס עם החלקים לטמפרטורת החדר לפחות 20 עד 30 דקות לפני ההקלטה. כדי למדוד את הדינמיקה של יוני האשלגן, הניחו בעדינות את פרוסת המוח באמבטיה באמצעות פיפטת פסטר והחזיקו אותה בעדינות במקומה עם נבל פלטינה עם מיתרי ניילון.

ודא שקצות האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית מקבילים זה לזה בקירוב ונמצאים בגובה מישור הפרוסה. במהלך חמש עד שבע שניות, הכנס לאט את האלקטרודות לשכבה רדיאטום CA3 בעומק של כ-40 עד 50 מיקרומטר כדי לעורר את הבטחונות של שפר. לאחר מכן, הכנס בזהירות את האלקטרודה הסלקטיבית של יוני אשלגן לשכבה רדיאטום CA1 לעומק של כ-50 מיקרומטר על ידי הורדה איטית של האלקטרודה במשך כשלוש עד ארבע שניות.

אפשר לפוטנציאל להתייצב על פני האלקטרודה לפני הפעלת גירויים על הפרוסה, מה שבדרך כלל לוקח חמש עד 10 דקות. אם הפרוסה מציגה שינויים ספונטניים מוגזמים בריכוזי יוני אשלגן חוץ-תאיים, השליכו וחזרו על התהליך עם פרוסה חדשה. כדי למדוד שחרור יוני אשלגן מעוררים, הפעל רכבות של גירוי חשמלי דרך מבודד הגירוי תוך רישום דיגיטלי של תגובות.

הפעל גירוי ב-10 הרץ ואלפית שנייה אחת לכל דופק החל מ-10 מיקרו-אמפר משרעת גירוי. הפעל אמפליטודות גירוי הולכות וגדלות בפקטור של שניים עד לזיהוי משרעת תגובת אשלגן מקסימלית. אם לא נצפתה תגובה, קרב את מיקום האלקטרודה הסלקטיבית של יוני האשלגן לאתר הגירוי במרווחים של 100 מיקרומטר.

כדי לאשר ששינויים בריכוז יוני האשלגן מתווכים על ידי ירי פוטנציאלי פעולה של ביטחונות שאפר המופעלים חשמלית, יש למרוח 0.5 מיקרומולר TTX ב-ACSF למשך 10 דקות ולחזור על פרוטוקול הגירוי. אין להבחין בתגובות מעוררות. לאחר הכנה של האלקטרודות עם תמיסת המלח הממולאת במילוי HEPES ויונופור האשלגן, ניתן לבדוק את האלקטרודות על תגובתן המהירה לשינויים הדרגתיים בריכוזי יוני האשלגן באמבט ועל התגובה הליניארית לשינויים ביוני אשלגן באמבטיה בטווח הכיול של 0.1 עד 100 מילי-מולרית באופן שנחזה על ידי משוואת נרנסט.

ניתן לשרטט את פוטנציאל המצב היציב כנגד ריכוז יוני האשלגן באמבטיה על מנת לקבוע את שיפוע הקו, שאמור להיות בערך V 58.2 מילי-וולט ולא פחות מ-52 מילי-וולט לכל שינוי של פי עשרה בריכוז יוני האשלגן. ההיענות של האלקטרודות הסלקטיביות לאשלגן נבדקה עוד יותר והתגובה לעלייה של 5.5 מילי-מולרית באשלגן נצפתה עם קבועי זמן עלייה ודעיכה של כ-85 אלפיות השנייה. לאחר שהאלקטרודות המגרות והאלקטרודות הסלקטיביות של יוני האשלגן הוכנסו לרקמה וההקלטה הגיעה לקו בסיס יציב, ניתן ליישם פולסים של משרעת זרם הולכת וגדלה.

צורת הגל של פעילות זו מופיעה כעלייה מהירה באשלגן עם קצב דעיכה אקספוננציאלי, אשר מתבטל עם יישום TTX. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת בזהירות ובדייקנות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על קצה האלקטרודה קטן ככל האפשר כדי לאפשר הקלטות מדויקות אך גדול מספיק כדי לאפשר רעש נמוך.