גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic
23 באוגוסט 2012
אנו מציגים גישת microfluidic לביטוי של מערכי חלבון. המכשיר מורכב מאלף תאי תגובה הנשלטים על ידי מייקרו שסתומים מכאניים. מכשיר microfluidic הוא הזדווגו לספריית גן microarray-מודפסת. גנים אלו אז מתועתקים ומתורגמים על שבב, וכתוצאה מכך מערך חלבון מוכן לשימוש ניסיוני.
המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור מערך חלבונים מודולרי שאינו דורש שלב של טיהור, ובכך להפוך אותו לתואם לכל ספריית חלבונים. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת גנים סינתטיים באמצעות assembly PCR, ולאחר מכן, הגנים הסינתטיים מסודרים במערך על נשאי זכוכית מצופים באפוקסי.
כדי לייצר את ההתקן המיקרופלואידי, השתמשו ב-PDMS עם תבניות בקרה וזרימה של סיליקון. לאחר מכן, יישרו את ההתקן המיקרופלואידי למערך ה-DNA המנוקד. לבסוף, העבירו זרימה של תמצית רטיקולוציטים של ארנב לתוך ההתקן המיקרופלואידי לצורך ביטוי חלבונים.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי של אלפי חלבונים באמצעות סימון בנוגדנים פלואורסצנטיים. לשימוש בטכניקה מבוססת מיקרופלואידיקה ישנם מספר יתרונות על פני שיטות קיימות, כגון מערכי מיקרו-חלבונים (protein microarrays). אנו מבצעים מערך מיקרו-DNA ולאחר מכן משתמשים בתאי cellis כדי לייצר חלבונים על גבי ההתקן.
לפיכך, איננו נדרשים לטיהור חלבונים והחלבונים אינם מתייבשים מעולם. הם נשארים טריים לאורך כל הניסוי. הטכניקה המיקרופלואידית מספקת גם רגישות גבוהה יותר. כדי לייצר את ההתקן המיקרופלואידי, יש לחשוף את תבניות הבקרה והזרימה מסיליקון לאדי chloro trimethyl silene למשך 10 דקות כדי לקדם את שחרור האלסטומר.
לאחר שלבי האפייה, הכין תערובת של אלסטומר מבוסס סיליקון וחומר מעבדה (curing agent) בשני יחסי ערבוב שונים: חמישה לאחד ועשרים לאחד עבור תבניות הביקורת ותבניות הזרימה, בהתאמה. שפוך את ה-PDMS ביחס של חמישה לאחד על שכבת הביקורת. בצע ניקוון (degassing) לשכבת הביקורת ואפה אותה למשך 30 דקות ב-80 °C.
בשלב הבא, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של תערובת ה-PDMS ביחס של 20:1 על שכבת הזרימה במהירות של 2,600 RPM למשך 60 שניות, ולאחר מכן אפו אותה בטמפרטורה של 80 °C למשך 30 דקות. הפרידו באיטיות את שכבת הבקרה מהתבנית, תוך הקפדה לא לקלף את תבנית ה-SU-8. לאחר מכן, בעזרת סקלפל, חתכו את ההתקן מסביב להיקפו והשתמשו במחט קהה כדי ליצור חורים לגישה לתעלות הבקרה תחת מיקרוסקופ.
בצעו יישור ידני של שכבות הזרימה והבקרה, החל מהפינה השמאלית העליונה, תוך מיקום שסתום הלחיצה בשכבת הבקרה במרכז תא התגובה. לאחר מכן, יישרו את השורה הראשונה ושחררו בעדינות את שכבת הבקרה שורה אחר שורה. ודאו שכל שסתומי הלחיצה נמצאים במרכז תאי התגובה וכי שסתומי הכתובת וההזנה חוצים את תעלות הזרימה במיקום הנכון.
חזור על התהליך באופן מקומי עד שכל השורות יהיו מיושרות. לאחר היישור המלא, שחרר כל מתח ב-PDMS על ידי הרמה זהירה של הצדדים והפינות. לאחר מכן, אפה את ההתקן למשך שעתיים בטמפרטורה של 80 °C.
חתוך מסביב להיקף וקלף את המכשיר הדו-שכבתי מחורי הניקור של תבנית הזרימה כדי לגשת לתעלות הזרימה לצורך יצירת מבני DNA עבור המכשיר. בצע PCR להפקת גנים סינתטיים המורכבים מקידמוני T7, אתר קישור לריבוזום, מסגרת קריאה פתוחה עם תגי Epitope שונים בכל קצה וטרמינטור T7. כדי להכין את הגנים הסינתטיים למערך, הכן תערובת של polyethylene glycol ו-D triose dihydrate. חלק 2 µL לכל תגובה לתוך הבארות של פלטת 384.
פלטת בארות. העבירו את הגנים הסינתטיים לפלטת 384 בארות. לאחר מכן, הוסיפו מים מזוקקים עד לנפח סופי של 20 µL.
בשלב הבא, השתמשו בנקודת מיקרומערך (microarray spot) כדי להניח סדרה של גנים סינתטיים על מצעי זכוכית מצופים באפוקסי. תחת סטריאוסקופ, יישרו ידנית את ההתקן המיקרופלואידי למערך הגנים, כך שנקודת ה-DNA תמוקם במרכז תאי ה-DNA. לאחר מכן, יישרו את שאר השורות.
סיום באמצעות כיוון עדין של המכשיר כולו כדי להפחית כל מאמץ על ה-PDMS ולהבטיח הצמדה טובה למערך המיקרו (microarray). הרם אותו באופן מקומי. לבסוף, הצמד את המכשיר ללבישת הזכוכית על ידי דגירה למשך לילה על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C.
צבעי מאכל משמשים בחלק זה למטרות ויזואליזציה. השסתומים בשכבת הבקרה מופעלים מהמחשב באמצעות lab view. סקריפט ה-lab view שולט בסדרה של מיקרו-שסתומים סולנואידיים באמצעות קופסת בקרה אלקטרונית.
סבב שסתומי הסולנואיד מחובר לאוויר דחוס, השולט בזרימת האוויר ובלחץ הנכנס לשסתומי הבקרה במכשיר. באמצעות צינור פלסטיק גמיש בעל קוטר פנימי של 0.02 inches וסיכת פלדת אל חלון, חברו את המכשיר לסבב שסתומי הסולנואיד. מלאו את הצינורות במים מזוקקים פעמיים והחדירו את הסיכה לחורי הגישה של שכבת הבקרה.
וודאו שכל מבחנה מחוברת לערוץ הבקרה המתאים לה. כדי להפעיל את ערוצי הבקרה, הפעילו את אפליקציית ה-LabVIEW, הגדירו את לחץ האוויר ל-five PS.I, ולאחר מכן גרמו להפעלת לחץ אוויר על ידי הפעלת השסתום מתוך סקריפט ה-LabVIEW. פעולה זו תדחף מים אל תוך ערוצי הבקרה של ה-PDMS כדי לזהות crosstalk פוטנציאלי בין ערוצי הבקרה של התקנים פגומים.
מלאו תחילה את שסתומי ה-sandwich והכתובת. לאחר שכל ערוצי הבקרה והשסתומים מלאים במים, בצעו הילוכ (prime) לשסתומים כדי לחסום את ערוצי הזרימה שמתחתיהם. פעולה זו תבוצע תחילה על ידי העלאת לחץ האוויר ל-15 PSI, ולאחר מכן באמצעות תוכנת lab view דרך מערכת של מפסקי הפעלה/כיבוי המחוברים לשסתומי סולנואיד בודדים.
הפעילו את כל השסתומים על ידי לחיצה על כל כפתורי המתגים כדי לוודא שכל השסתומים פתוחים. חברו צינור לאחד מכניסות הזרימה, והזרים אוויר למכשיר בלחץ של 4 עד 5 PSI. פעולה זו תשחרר שסתומים דביקים מהמסלייה הזכוכית.
המכשיר מוכן כעת ומוכן לצורכי ויזואליזציה. צבע מאכל צהוב משמש להצגת הריאגנטים בסעיף זה, והתמיסה חסרת הצבע מייצגת את ה-hippies. כדי להקל על ההרכבה העצמית של מערך חלבונים על פני השטח ולמנוע ספיחה לא ספציפית בתוך המכשיר המיקרופלואידי, יש לבצע מודיפיקציה כימית של פני השטח על ידי חיבור צינור חדש עם התמיסה הדרושה לאחד מערוצי הזרימה במכשיר. לאחר מכן, חבר את הצד החופשי של הצינור לסעפת הידנית ופתח את זרימת לחץ האוויר.
העבר 40 µL של BSA המקושר לביוטין למבחנה חדשה והזרם כמחצית מהנפח דרך המכשיר למשך 20 דקות. השתמש ב-50 mM HEPES כדי לשטוף שאריות של סובסטרט שאינו תגובתי בין כל אחד מהשלבים. לאחר מכן, הזרם 25 µL של סטרפטאווידין למשך 20 דקות.
מעל ה-BSA הביוטינילי, שטפו ב-HEPES למשך חמש דקות כדי להכין את הפני השטח סביב הכפתור, סגרו את שסתום הכפתור והזרימו את שאר ה-BSA הביוטינילי, ולאחר מכן שטפו שוב ב-HEPES למשך חמש דקות. לבסוף, כדי ליצור מערך anti-His tag תחת הכפתור, שחררו את שסתום הכפתור והזרימו 30 µL של Penta-His biotin למשך 20 דקות ליצירת מערך של חלבונים על ההתקן. פתחו את שסתומי הצוואר והזרימו תמצית רטיקולוציטים של ארנב.
הזרק את תמיסת התגובה של תמלול ותרגום מצומדים במהירות דרך המכשיר אל תוך תא ה-DNA. לאחר מכן, סגור את שסתומי הסנדוויץ' כדי להפריד כל גן מסביבתו והדגר את המכשיר על פלטה חמה למשך 2.5 שעות ב-30 degrees Celsius. לאחר מכן, סמן את הקצה הטרמינלי של החלבונים באמצעות נוגדן C mix SI three.
לבסוף, השתמשו בסורק מיקרו-מערך (microarray scanner) עם לייזר של 532 ננומטר ומסנן פליטה של 575 ננומטר. קבעו את רמות החלבון. איור זה מציג את הרמות המשתנות של ביטוי חלבונים במערך חלבונים.
בדרך כלל 20% מספריית הגנים אינם מתבטאים לרמות שניתן לזהות. רמות הרקע נקבעו באמצעות תאים שלא הוכתמו ב-DNA. לפיכך, אותות מהתאים של החלבון התואם נובעים מרעש או מספיגה לא ספציפית של הנוגדנים המסומנים.
אם הפעולה תבוצע כראוי, אימות המכשיר יארך ארבע שעות והניסוי בשבב יארך חמש שעות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה מיקרופלואידית להבעה של מערכי חלבונים, תוך שימוש במכשיר בעל אלפי תאי תגובה הנשלטים על ידי שסתומים מיקרו-מכניים. השילוב של ספריית גנים המודפסת בשיטת מיקרו-מערך מאפשר תמלול ותרגום על השבב, מה שמוביל למערך חלבונים מוכן לשימוש.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביטוי חלבונים
- ספריות גנים
רקע
- מערכי חלבונים (Protein arrays) חיוניים למגוון של בדיקות ביולוגיות.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות שלבי טיהור, דבר המגביל את התאימות.
- התקני מיקרופלואידיקה יכולים לייעל את תהליך הביטוי של חלבונים.
- PCR הרכבה (Assembly PCR) משמש ליצירת גנים סינתטיים עבור מערכים.
מטרת המחקר
- ליצירת מערך חלבונים מודולרי ללא שלבי טהרה.
- לשיפור התאימות לכל ספריית חלבונים.
- להגברת יעילות ביטוי החלבונים באמצעות מיקרופלואידיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפקה של גנים סינתטיים באמצעות PCR של הרכבה (assembly PCR).
- סידור גנים סינתטיים במערכים על שקופיות אפוקסי.
- ייצור של התקן מיקרופלואידי באמצעות PDMS.
- הזרמה של ליזט רטיקולוציטים של ארנב אל תוך ההתקן לצורך ביטוי חלבונים.
תוצאות עיקריות
- הוכשרו בהצלחה התקן מיקרופלואידי תפקודי.
- חלבונים בוטאו על השבב ללא צורך בטיהור.
- השיטה הדגימה תאימות לספריות חלבונים שונות.
- שעתוק ותרגום על השבב הושגו ביעילות.
מסקנות
- גישה מיקרופלואידית זו מפשטת את יצירתם של מערכי חלבונים.
- היא מבטלת את הצורך בטיהור, ובכך משפרת את השמישות.
- ניתן להחיל את הטכניקה על ספריות חלבונים מגוונות לצורכי מחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמכים רשמיים
פלטפורמה מיקרופלואידית זו לביטוי חלבונים מאפשרת יצירה בשפיעת גבוהה של מערכי חלבונים פונקציונליים ללא צורך בטיהור, ובכך פותרת צוואר בקבוק מרכזי באימות מטרות ובסריקת אינטראקציות. על ידי שמירה על חלבונים במצב טבעי ולא דנטורטי על גבי השבב, השיטה תומכת בזיהוי מהימן של אינטראקציות בין חלבון לחלבון, חלבון ל-DNA וחלבון ל-RNA. יכולת זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפחתת מספר התוצאות השליליות השגויות הנובעות מאובדן חלבונים או מקיפול שגוי במהלך הטיהור.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ביטוי של חלבונים באורכם המלא עם קיפול תקין ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות.
- ערך תפעולי: מבטל את שלבי הניקוי, ובכך מפחית את אובדן הדגימות ומגביר את התפוקה עבור סריקת ספריות בקנה מידה גדול.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתוני ביטוי כמותיים עבור אלפי וריאנטים במקביל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מערכי חלבונים סטנדרטיים ישירות מתבניות DNA, ובכך מבטיח עקביות בין סדרות עבור בדיקות אינטראקציה הדירות.
- ערך תפעולי: משלב סידור גנים וביטוי חלבונים על גבי התקן מיקרופלואידי יחיד, ובכך מצמצם את זמן העבודה הידנית ואת הסיכון לזיהום צולב.
- מוכנות לבדיקה: מייצר קריאות פלואורסצנטיות כמותיות התואמות לסורקי מיקרו-מערכים עבור מיפוי אינטראקציות בצפיפות גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת פרופיל מהיר של אינטראקציות חלבונים על פני מטרות רלוונטיות למחלה שזוהו במחקרי omics מקדימים.
- התאמה של סממנים ביולוגיים: תומך בסריקה של נוגדנים עצמיים או אירועי קישור תרפויטיים באמצעות דגימות מטופלים על מערכי אנטיגנים מובעים.
- הפחתת סיכונים פרה-קלינית: מאפשר הערכה מוקדמת של קישור שאינו למטרה (off-target) או פרופילי תגובה צולבת לפני קידום מועמדים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מהכנת ספריות גנים סינתטיות ועד לסריקת אינטראקציות, ובכך היא מאפשרת מעבר חלק מזיהוי המטרה לתיקוף המולקולות המובילות (lead validation).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי ביטוי של גנים במערך (arrayed genes) להערכת פעילות חלבון פונקציונלית ללא הטיות הנובעות מתהליכי טיהור.
- סריקה: מספקת מערכי חלבון טריים וסטנדרטיים המוכנים לשימוש מיידי בבדיקות אינטראקציה ביוכימיות או ביו-פיזיקליות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה המאפשרות השוואה של רמות ביטוי וזיקה (binding affinities) על פני אלפי תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין וריאנטים גנטיים לתוצרי חלבון פונקציונליים, ומאפשרת התאמה לנתונים פנוטיפיים או קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן לתכנת מחדש את הפלטפורמה המיקרופלואידית עם מערכי DNA חדשים, דבר התומך במערכות סריקה איטרטיביות לאורך מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי ביטוי חלבונים במצב טבעי, ובכך מפחית ארטיפקטים הנובעים מניקוי או דנטורציה.
- ערך תפעולי: מאפשר עיבוד מקבילי של אלפי תגובות בשטח קומפקטי, מה שמשפר את יעילות הריאגנטים ואת תפוקת העבודה.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות המשך (go/no-go) על ידי יצירה מהירה של נתוני אינטראקציה עבור ספריות וריאנטים גדולות.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעוד וסדירת עדיפויות של מטרות בהתאם לסיכון, בהתבסס על פרופילי אינטראקציה מקיפים ודיוק הביטוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקני מיקרופלואידיקה, כולל יציקה של PDMS ויישור שכבות.
- תלוי בגישה לציוד נקודות (spotting) עבור מערכי מיקרו-מערכים ליצירת מערכי DNA ומערכות בקרה מיקרופלואידיות (למשל, LabVIEW עם שסתומים סולנואידיים).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת ספריות גנים, כולל assembly PCR ותיוג אפיתופים לצורך זיהוי.
- כולל אופטימיזציה של זמני דגירה וריכוזי ריאגנטים (למשל, rabbit reticulocyte lysate, ריאגנטים ביוטיניליים) להשגת יעדי ביטוי חלבון ספציפיים.
- מוגבל על ידי הנגישות למתקני ייצור מיקרופלואידיים והמיומנות הטכנית הנדרשת ליישור והדבקה מדויקים של השכבות.
