גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic
23 באוגוסט 2012
אנו מציגים גישת microfluidic לביטוי של מערכי חלבון. המכשיר מורכב מאלף תאי תגובה הנשלטים על ידי מייקרו שסתומים מכאניים. מכשיר microfluidic הוא הזדווגו לספריית גן microarray-מודפסת. גנים אלו אז מתועתקים ומתורגמים על שבב, וכתוצאה מכך מערך חלבון מוכן לשימוש ניסיוני.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מערך חלבונים מודולרי שאינו דורש שלב טיהור, מה שהופך אותו לתואם לכל ספריית חלבונים. זה מושג על ידי יצירת גנים סינתטיים באמצעות הרכבה PCR. לאחר מכן, הגנים הסינתטיים מסודרים על שקופיות אפוקסי.
כדי לייצר את המכשיר המיקרופלואידי, השתמש ב-PDMS עם בקרת סיליקון ותבניות זרימה. ואז המכשיר המיקרופלואידי מיושר למערך ה-DNA המנוקד. לבסוף, ליזאט רטיקולוציטים של ארנב מוזרם למכשיר המיקרופלואידי ומתבטאים חלבונים.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי של אלפי חלבונים באמצעות תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים. ישנם מספר יתרונות לשימוש בטכניקה המבוססת על מיקרופלואידיקה על פני שיטות קיימות כגון מיקרו-מערכי חלבונים. אנו מעריכים את הדנ"א ואז משתמשים בצ'ליס כדי לייצר חלבונים במכשיר.
לפיכך, איננו זקוקים לטיהור חלבון והחלבונים לעולם אינם מתייבשים. הם נשארים טריים לאורך כל הניסוי. הטכניקה המיקרופלואידית מספקת גם רגישות גבוהה יותר כדי לייצר את המכשיר המיקרופלואידי, חשוף את תבניות בקרת הסיליקון והזרימה לאדי כלורו טרימתיל סילן למשך 10 דקות כדי לקדם שחרור אלסטומר.
לאחר שלבי האפייה, הכינו תערובת של אלסטומר על בסיס סיליקון וחומר ריפוי בשני יחסים שונים של חמישה לאחד ו-20 לאחד לתבניות הבקרה והזרימה בהתאמה. יוצקים את ה-PDMS של חמישה לאחד על שכבת הבקרה. מסירים את שכבת הבקרה ואופים אותה במשך 30 דקות בחום של 80 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יש לצפות את תערובת ה-PDMS של 20 ל-1 על שכבת הזרימה ב-2,600 סל"ד למשך 60 שניות, ולאחר מכן לאפות אותה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הפרד לאט את שכבת הבקרה מהתבנית, היזהר לא לקלף את תבנית SU 8. לאחר מכן בעזרת אזמל, חותכים את המכשיר סביב היקפו ומשתמשים במחט קהה כדי לנקב חורים כדי לגשת לתעלות הבקרה תחת מיקרוסקופ.
יישר ידנית את שכבות הזרימה והבקרה החל מהפינה השמאלית העליונה ומקם את שסתום הכפתור על שכבת הבקרה באמצע תא התגובה. לאחר מכן, יישר את השורה הראשונה ושחרר בעדינות את שכבת הבקרה שורה אחר שורה. ודא שכל שסתומי הכפתורים נמצאים באמצע תאי התגובה וששסתומי הכתובת והקלט חוצים את ערוצי הזרימה במיקום הנכון.
חזור על התהליך באופן מקומי עד שכל השורות מיושרות. כאשר הוא מיושר במלואו, שחרר כל מתח ב-PDMS על ידי הרמתו בזהירות מהצדדים והפינות. לאחר מכן אופים את המכשיר במשך שעתיים בחום של 80 מעלות צלזיוס לאחר האפייה.
חותכים סביב ההיקף ומקלפים את המכשיר הדו-שכבתי מחורי ניקוב תבנית הזרימה כדי לגשת לתעלות הזרימה כדי ליצור מבני DNA למכשיר. בצע PCR כדי לייצר גנים סינתטיים המורכבים ממקדם T 7, אתר קשירת ריבוזום, מסגרת קריאה פתוחה עם תגי אפיטופ שונים בשני קצותיו וסיום T 7. כדי להכין את הגנים הסינתטיים לסידור, הכינו תערובת של פוליאתילן גליקול ו-D triose dihydrate הוצאו שני מיקרוליטר לכל תגובה לבארות של 384.
ובכן צלחת. הוסף את הגנים הסינתטיים לצלחת באר 384. לאחר מכן הוסף מים מזוקקים לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.
לאחר מכן, באמצעות נקודת מיקרו-מערך, סדרה של גנים סינתטיים על מצעי זכוכית מצופים אפוקסי. תחת סטריאוסקופ, יישר ידנית את המכשיר המיקרופלואידי למערך הגנים עם נקודת ה-DNA הממוקמת באמצע תאי ה-DNA. ואז הביאו ליישר קו את שאר השורות.
גימור עם כוונון עדין של המכשיר כולו כדי להקל על כל לחץ על ה-PDMS ולהבטיח שהוא נקשר היטב למיקרו-מערך. הרם אותו באופן מקומי. לבסוף, הצמידו את המכשיר למגלשת הזכוכית על ידי דגירה למשך הלילה על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
צבעי מאכל משמשים בחלק זה למטרות הדמיה. השסתומים בשכבת הבקרה מופעלים מהמחשב באמצעות תצוגת מעבדה. תסריט תצוגת המעבדה שולט בסדרה של מיקרו שסתומי סולנואיד באמצעות תיבת בקרה אלקטרונית.
סעפת שסתום הסולנואיד מחוברת לאוויר דחוס, השולט על זרימת האוויר והלחץ לשסתומי הבקרה במכשיר. בעזרת צינור פלסטיק גמיש בקוטר פנימי של 0.02 אינץ' וסיכת נירוסטה, חבר את המכשיר לסעפת שסתומי הסולנואיד. מלאו את הצינורות במים מזוקקים כפולים והכניסו את הסיכה לחורי הגישה של שכבת הבקרה.
ודא שכל צינור מחובר לתעלת הבקרה המתאימה לו. כדי להפעיל את ערוצי הבקרה, הפעל את אפליקציית תצוגת המעבדה, הגדר את לחץ האוויר לחמישה PS. לאחר מכן אני מפעיל לחץ אוויר על ידי הפעלת השסתום מתסריט תצוגת המעבדה. זה ידחוף מים לתוך תעלות הבקרה של PDMS כדי לזהות דיבור צולב פוטנציאלי בין ערוצי בקרה של מכשירים פגומים.
מלאו תחילה את הכריך ואת שסתומי הכתובת. אחרי הכל, תעלות הבקרה והשסתומים מלאים במים, מפעילים את השסתומים כדי לחסום את תעלות הזרימה שמתחתיהם. על ידי הגדלת לחץ האוויר ל-15 PSI ולאחר מכן בתוכנית תצוגת המעבדה באמצעות סט מתגי כיבוי המחוברים לשסתומי סולנואיד בודדים.
הפעל את כל השסתומים על ידי הפעלת כל לחצני המתג כדי להבטיח שכל השסתומים פתוחים. חבר צינור לאחת מכניסות הזרימה, ובארבע עד חמש PSI הזרים אוויר לתוך המכשיר. זה ישחרר את כל השסתומים הדביקים ממגלשת הזכוכית.
המכשיר מוכן כעת ומוכן למטרות הדמיה. צבע מאכל צהוב משמש להמחשת הריאגנטים בחלק זה והתמיסה חסרת הצבע מייצגת את ההיפים כדי להקל על ההרכבה העצמית של מערך חלבונים על פני השטח ולמנוע ספיגה לא ספציפית בתוך המכשיר המיקרופלואידי, לשנות כימית את פני השטח על ידי חיבור תחילה של צינור חדש עם התמיסה הנדרשת לאחד מתעלות הזרימה במכשיר. לאחר מכן חבר את הצד החופשי של הצינור לסעפת הידנית ופתח את זרימת לחץ האוויר.
טען 40 מיקרוליטר של BSA מרומם ביוטין בצינור חדש והזרם כמחצית ממנו דרך המכשיר למשך 20 דקות. השתמש ב-50 מילי-מולרי היפי כדי לשטוף כל מצע לא מגיב בין כל אחד מהשלבים. לאחר מכן, הזרימו 25 מיקרוליטר סטרפטווידין למשך 20 דקות.
על גבי הביוטין יש לשטוף עם hees במשך חמש דקות כדי לאכול את המשטח המקיף את הכפתור, לסגור את שסתום הכפתור ולהזרים את שאר ה-BSA הביוטיניל, ואז לשטוף שוב עם האפונה למשך חמש דקות. לבסוף, כדי ליצור מערך תגים נגד שריקה מתחת לכפתור, שחרר את שסתום הכפתור והזרם 30 מיקרוליטר של ביוטין פנטה היס למשך 20 דקות כדי ליצור מערך חלבונים במכשיר. פתח את שסתומי הצוואר וזרם את רשתית הארנב.
פתרון תגובת שעתוק ותרגום מהיר בשילוב דרך המכשיר לתוך תא ה-DNA. לאחר מכן, סגור את שסתומי הסנדוויץ' כדי להפריד כל גן מסביבתו ודגר את המכשיר על פלטה חמה למשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן סמן את הקצה הסופי של החלבונים עם נוגדן C mix SI שלוש.
לבסוף, שימוש בסורק מיקרו-מערך עם לייזר 532 ננומטר ומסנן פליטה של 575 ננומטר. קבע את רמות החלבון. איור זה מציג את הרמות המשתנות של ביטוי חלבון במערך חלבונים.
בדרך כלל 20% מספריית הגנים לא מצליחה להתבטא ברמות הניתנות לזיהוי. רמות הרקע נקבעו באמצעות חדרים שלא זוהו ב-DNA. לפיכך, אותות מתאי החלבון המתאימים נובעים מרעש או מספיגה לא ספציפית של נוגדנים לתיוג.
אם הוא מבוצע כראוי, אימות המכשיר לוקח ארבע שעות וניסוי השבב לוקח חמש שעות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
המחקר הזה מציג גישה מיקרופלואידית לביטוי מערכי חלבונים, תוך שימוש במכשיר עם אלפי תאי תגובה הנשלטים על ידי שסתומים מיקרו-מכניים. שילוב של ספריית גנים מודפסת במערך מיקרו מאפשרת תעתוק ותרגום על השבב, ומביא למערך חלבונים מוכן לשימוש.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביטוי חלבונים
- ספריות גנים
רקע
- מערכי חלבונים חיוניים למבחנים ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות דורשות לעתים קרובות צעדי טיהור, מה שמגביל את התאימות.
- מכשירים מיקרופלואידיים יכולים לייעל את תהליך ביטוי החלבונים.
- PCR בהרכבה משמשת ליצירת גנים סינתטיים לסידור.
מטרת המחקר
- ליצור מערך חלבונים מודולרי ללא צעדי טיהור.
- לשפר את התאימות עם כל ספריית חלבונים.
- לשפר את יעילות ביטוי החלבונים באמצעות מיקרופלואידיקה.
שיטות ששימשו
- ייצור גנים סינתטיים באמצעות PCR בהרכבה.
- סידור גנים סינתטיים על שקופיות אפוקסי.
- ייצור מכשיר מיקרופלואידי באמצעות PDMS.
- הזרמת תמצית רטיקולוציטים של ארנב לתוך המכשיר לביטוי חלבונים.
תוצאות עיקריות
- נוצר בהצלחה מכשיר מיקרופלואידי פונקציונלי.
- חלבונים בוטאו על השבב ללא טיהור.
- השיטה הדגימה תאימות עם ספריות חלבונים שונות.
- תעתוק ותרגום על השבב הושגו ביעילות.
מסקנות
- גישה מיקרופלואידית זו מפשטת את יצירת מערכי חלבונים.
- היא מבטלת את הצורך בטיהור, ומגדילה את השימושיות.
- הטכניקה יכולה לשמש לספריות חלבונים שונות למחקר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
