הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

המטרה הכוללת של בימוי וניתוח רקמות ריח פריפריאליות מתפתחות של אישונים ובוגרים במיני דרוזופילה היא ליצור דגימות לניתוחים מולקולריים והתפתחותיים של רקמות הריח ההיקפיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות והאבולוציה של מערכת הריח, כגון דינמיקת הביטוי, רמות ודפוסים של גנים ספציפיים ברקמות הריח ההיקפיות המתפתחות. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לקבל תובנות על מערכת הריח ההיקפית המתפתחת במיני דרוזופילה.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות חישה אחרות, כגון הטעם ההיקפי ומערכות הראייה. לניסוי ריצוף RNA, תכנן לאסוף בין 100 ל-200 דיסקים או אנטנות אנטנה לארבעה שלבי פיתוח שונים. עבור אימונוהיסטוכימיה, תכננו לנתח 10 עד 20 זבובים.

נקה את כל החומרים המעורבים בדיסקציה באמצעות 70% אתנול. לאחר מכן, נקו עוד יותר את החומרים עם מנטרלי RNase. וליצור את כל הפתרונות באמצעות מים נטולי נוקלאז או שטופלו ב-DEPC.

כדי לאסוף גלמים, עקוב אחר הזחלים במרווחים של 30 דקות. ולאסוף גולם בשלב טרום הגולם של APF בשעת האפס. הזחלים יהיו חסרי תנועה ומוקפים במארז גולם בהיר מאוד, כמעט בצבע לבן.

בשלב זה, העבירו את הזחלים לצלחת פטרי קטנה בגודל שני סנטימטרים עם נייר פילטר לח. עבור נתיחות שלב APF של שעת אפס, המשך מיד לקצור את דיסק האנטנה הקדם-גולמי. אחרת, מכסים את המנה בניילון פרפין ומאפשרים לבעלי החיים להתפתח ב -25 מעלות צלזיוס, עד שהם נמצאים בשלב ההתפתחותי של העניין.

כדי לשלב את התפתחות הגולם של מינים אחרים של דרוזופילה, אספו זחלי טרום גולם של אפס שעות ומינו אותם לבקבוקון טרי. לאחר מכן רשום את מספר הימים מלפני הגולם לבגרות. ופשוט התאימו את הפעם לציר הזמן של המלנוגסטר.

כדי להתחיל, יש לצנן 150 מיקרוליטר של תמיסת בידוד RNA בצינור 1.5 מילימטר נטול RNase. לאחר מכן, הפקידו מספר טיפות נפרדות של PBS על משטח הדיסקציה. לתוך כל טיפה של PBS, הניחו גולם אחד לניתוח.

עבור גלמים של אפס עד שעתיים, השתמשו במלקחיים כדי לאחוז בקרסי הפה ולמשוך את המבנים הללו כדי לקרוע ולחשוף את המוח והדיסקים הדמיוניים. במשך שמונה השעות של הגלמים, יש לקלף תחילה בעדינות את מארז הגולם מהרבע הקדמי ביותר של הגולם, כדי לחשוף את הראש המתפתח. לאחר מכן נתק את הראש במפרק הצוואר.

דיסקי האנטנות נמצאים בראש בשלב זה של ההתפתחות. כעת העבירו את הרקמות המכילות את דיסקי האנטנות לטיפה נוספת של PBS. לאחר מכן, זהה את דיסק אנטנת העין המחובר למוח באונות הראייה.

בעזרת מלקחיים, נתק את דיסק אנטנת העין והעבר אותו לטיפה חדשה. בגלמים של שמונה שעות, דיסקי העין מכסים את דיסקי האנטנות ושניהם קדמיים למוח. בטיפה הבאה, חלקו את העין ואת דיסקי האנטנות בעזרת מלקחיים.

לאחר מכן בעזרת קצה פיפט P20, אוספים בעדינות את הרקמה המנותחת בכמות מינימלית של נוזלים. הפקידו את הדיסק במגיב תמיסת בידוד ה-RNA והמשיכו לנתח דיסקי אנטנות עד לאיסוף של לפחות 100. עד 40 שעות לאחר היווצרות הגולם, האנטנה הבוגרת קיבלה את צורתה הסופית, אך היא עדיין שקופה.

לפחות 50 טרום-גלמים בשלב זה דרושים לאיסוף רצף RNA. ראשית הכינו 150 מיקרוליטר של תמיסת בידוד RNA צוננת. על משטח הדיסקציה, הניחו גלמים לתוך טיפה של PBS.

לאחר מכן ייצב את הגוף עם זוג מלקחיים אחד, וקילף בעדינות את מארז הגולם מהרבע הקדמי ביותר כדי לחשוף את הראש. לאחר מכן, הסר בזהירות את הראש במפרק הצוואר. כעת העבירו בעדינות את הראש לטיפה נקייה של PBS.

שם כדי להסיר את הממברנה המקיפה את הראש, צנרת את הראש למעלה ולמטה ב- PBS. עם ניקוי זה, האנטנה אמורה להיות גלויה. כעת נתק את האנטנה מהממברנה בין הקטע השני והשלישי במפרק הסגמנטלי.

הקטע השלישי מכיל את קולטני הריח של האנטנה. לאחר מכן השתמש בפיפט כדי להעביר בעדינות את הרקמה המנותחת לתמיסת בידוד ה-RNA ולמזער את כמות הנוזל המועברת. למיצוי RNA, נתחו מבוגרים בזמן שהם מורדמים על כרית CO2.

ראשית, טפלו בכרית ה-CO2 והמלקחיים עם מעכבי RNase. לאחר מכן הרדימו את המבוגרים וצפו במשטח תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בעזרת שני זוגות מלקחיים, ייצב את הגוף ומשוך או צבט בעדינות את מקטע האנטנה השלישי ממקטע האנטנה השני כדי לאסוף את הרקמות.

העבר את האנטנות לתוך צינור של תמיסת בידוד RNA על ידי טבילת המלקחיים בנוזל ושחרור. האנטנה חייבת להיות שקועה. אם האנטנה נדבקת לקיר הצדדי, ה-RNA יתפרק בטרם עת.

לאחר איסוף מספיק אנטנות, המשך במיצוי ה- RNA. או אחסן את צינור האיסוף בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן. אם האנטנה מיועדת לאימונוהיסטוכימיה, בצע דיסקציה זו על משטח דיסקציה כשהזבוב שקוע ב-PBS עם או בלי טריטון.

רקמת הריח המתפתחת המנותחת יכולה לשמש למיצוי RNA ואחריו RT-PCR להערכת ביטוי גנים. לדוגמה, ניתן ללמוד את הביטוי של תעתיקי קולטני פני השטח ותעתיקי קולטני הריח באופן זה. לחלופין, ניתן להשתמש ברקמות לאימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את דפוס הביטוי ואת הלוקליזציה התת-תאית של גנים מעניינים.

לדוגמה, זבובים טרנסגניים Rn-EGFP יכולים להיות מוכתמים בנוגדנים אנטי-GFP ואנטי-למינין. הניתוח מראה כי 40 שעות לאחר היווצרות הגולם, הגן Or67d פעיל בתאים ספציפיים באנטנה, ומניע ביטוי של GFP תחת מערכת GAL4-UAS. לאחר השליטה, ניתן לבצע נתיחות תוך שעה אחת אם הן מבוצעות כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על זמן ומתוזמן כראוי לקטיף, הזדקנות וניתוח, בהתבסס על מסגרת הזמן להתפתחות הגולם עבור כל מין דרוזופילה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו qRT-PCR, אימונוהיסטוכימיה, כמו גם טכניקות אחרות של צביעה in vivo ופרופיל שעתוק על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לדפוס ופרופילים של שעתוק ברמת המערכות בתוך רקמה מתפתחת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האבולוציה והפיתוח של מערכות חישה לחקור דינמיקת שעתוק וגילוי גנים חדשים במערכות חישה אחרות במיני דרוזופילה.

אל תשכח שעבודה עם מלקחיים חדים, כמה פתרונות מיצוי RNA ופורמלדהיד יכולים להיות מסוכנים ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון תרגול קודם עם דיסקציות, לפיתוח מוטוריקה עדינה, קשב גבוה ולבישת בגדי מעבדה מתאימים בעת ביצוע הליך זה.