הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבטא ולטהר חלבונים דמויי אלסטין שמקורם רקומביננטי לשימוש כהידרוג'ל מתכוונן למעטפת תאים תלת מימדית. בנוסף, פרוטוקול זה מציג את המתודולוגיה לתיוג פלואורסצנטי במורד הזרם במיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים עטופים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביו-חומרים, הרפואה הרגנרטיבית והביולוגיה של התא, כגון הבנת התפקיד של אינטראקציות מטריצה חוץ-תאיות בתלת מימד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת פלטפורמת חומר ניתנת לשחזור, מתכווננת ומודולרית הניתנת למחקר של סוגי תאים מרובים. בסך הכל, יישום טכניקה זו יכול לשפר את הבנתנו את פרמטרי האיתות הקריטיים של ECM התאים שעשויים להכתיב את הצלחתם של טיפולים רגנרטיביים מבוססי תאים עתידיים. פס צלחת אגר אמפיצילין וכלורמפניקול עם מלאי חיידקים מוכן מראש המכיל וקטור המקודד עבור ה-ELP המעניין.

לאחר מכן דגרו את הצלחת המפוספסת הפוכה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר צמיחת חיידקים. למחרת, בחרו מושבה אחת מהצלחת וחסנו את תרבית המתנע שחוממה מראש. דגרו את התרבית בשייקר בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

לאחר תקופת הדגירה, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר 20 מיליליטר מתרבית המתנע לכל בקבוק ביטוי. השאירו את בקבוק הביטוי רועד למשך שעה. לאחר שעה, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של אליקוט מבקבוק הביטוי.

ברגע שהקריאה מגיעה ל-0.6, הפחיתו את טמפרטורת השייקר ל-32 מעלות צלזיוס. כאשר הקריאה מגיעה ל-0.8, הוסף מיליליטר אחד של IPTG סטרילי מולארי אחד כדי לגרום לביטוי ELP בבקבוק הביטוי. תנו לתרבות להתבטא במשך שבע שעות.

לאחר שבע שעות, צנטריפוגה את מדיית הביטוי ב-12,000 x g למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה רצפה. לאחר הצנטריפוגה, השתמש במרית כדי לאסוף את כדור התא ממיכל הצנטריפוגה ולהניח בשקית זיפלוק שקולה מראש. לאחר מכן, ממיסים את כדור התא במאגר TEN מסונן סטרילי.

עסו את כדור התא ליצירת תמיסה הומוגנית. הקפיאו את שקית הזיפלוק עם כדור תא תלוי במיכל משני בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. לגלולת התא המופשרת, הוסף כ-30 עד 40 מיליגרם של דאוקסיריבונוקלאז ומיליליטר אחד של 100 מילי-מולרי PMSF לכל 100 מיליליטר של ליזאט תאים.

דגרו את הליזאט בארבע מעלות צלזיוס על שייקר למשך הלילה. לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה השלישי, צנטריפוגה את הדגימות לפחות 15,000 x g למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ממיכל הצנטריפוגה והעבירו את התמיסה למיכל צנטריפוגה חדש.

לכל 100 מיליליטר של סופרנטנט, הוסף 5.84 גרם נתרן כלורי בשלושה חלקים לריכוז מולארי אחרון. דגרו את התרחיף באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות לפחות 15,000 x גרם למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט ממיכל הצנטריפוגה והעלו את הגלולה. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר מים אולטרה-טהורים שעברו חיטוי לכל גרם גלולה המתקבלת לאחר צנטריפוגה. כדי להבטיח שהחלבון יתמוסס לחלוטין, השתמש במרית מתכת כדי לרסק ולהשעות את הגלולה.

דגרו את הכדור התלוי בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי. חזור על שלבי הצנטריפוגה הקרה והחמה בסך הכל שלושה מחזורים כדי לטהר עוד יותר את ה-ELP. לאחר מכן, חייגו את שאריות הסופרנטנט בקרום דיאליזה של 3.5 קילודלטון כנגד ארבעה ליטרים של מים טהורים במיוחד מקוררים מראש בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים כדי להפיל את תמיסת החלבון.

צנטריפוגה התמיסה הסופית בדיאליזה בצנטריפוגה מקוררת מראש. הקפיאו את הסופרנטנט בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי ששוקל מראש. לבסוף, ליופיליזציה של התמיסה הקפואה למשך שלושה ימים ולאחר מכן שקלו את המוצר הסופי שעבר ליופיל כדי לקבוע את תפוקת החלבון.

בעזרת אגרוף ביופסיה יוצרים חורים ביריעת סיליקון בעובי 0.5 מילימטר. ואז חותכים ריבוע סביב כל חור. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להסיר את הניילון בכל צד של התבניות הבודדות.

לאחר הסרת הניילון, השתמש בפינצטה כדי למקם את המספר הזהה של תבניות סיליקון חשופות והחלקות כיסוי זכוכית בשורות לסירוגין על מכסה צלחת 48 בארות להדבקת פלזמה לאחר מכן. לאחר ייצור כל חומרי תרבית התאים, הכנת סוג התא המעניין לאנקפסולציה של הידרוג'ל במורד הזרם עשויה להתחיל. לאחר פירוק התאים לתרחיף תא בודד, יש לחלק את מספר התאים הרצוי לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של כ-200 x גרם למשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט ואחסנו את הכדור על קרח. השעו מחדש את גלולת התא בתמיסת מלאי ELP ל-80% מהנפח הסופי.

לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לערבב את התמיסה לתרחיף הומוגני של תאים ב-ELP. עבור 20% הנפח הסופי הנותר, הוסף תמיסת מלאי THPC לתרחיף ELP התא. פיפטה מספר פעמים כדי להבטיח היווצרות תערובת הומוגנית, תוך הימנעות מהיווצרות בועות אוויר.

לאחר מכן, בתנועה סיבובית, פיפטה את תערובת התא ELP THPC לכל תבנית בצלחת של 24 בארות. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.

לאחר סיום הדגירה, הוסף בזהירות 750 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים חם לכל באר בצלחת של 24 בארות. השאירו את ההידרוג'ל על 37 מעלות צלזיוס למשך התרבות הרצויה. ראשית, שאפו את המדיום מכל באר.

לאחר מכן שטפו את הבארות עם מיליליטר אחד של DPBS חם. לאחר סיום הכביסה, הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר. לאחר מכן, דגרו על צלחת 24 הבארות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת הקיבוע מכל אחת מהבארות ולהשליך את הקיבוע למיכל פסולת מסוכנת. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DPBS לדגימה והשליך מיד את ה-DPBS למיכל פסולת מסוכנת. לאחר מכן, הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת חדירות כדי לחדור את הדגימה למשך שעה בטמפרטורת החדר על הנדנדה ב-15 סיבובים לדקה.

לאחר שעה, שאפו את תמיסת החדירות והוסיפו לדגימה 750 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. השאירו את הדגימה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר מכן יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים הרצויים בתמיסת דילול הנוגדנים.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים לכל דגימה. דגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית, ולאחר מכן שטפו את הדגימות עם PBST במשך שעה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר ב-15 סיבובים לדקה.

לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים בחמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת מלאי DAPI כדי להשיג ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר מהתמיסה לכל דגימה. לאחר מכן, השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את צלחת 24 הבארות ולדגור את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את הדגימות עם PBST שלוש פעמים כל אחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה. לאחר מכן, מקם טיפה של אמצעי הרכבה קשיח על פני מגלשת זכוכית והנח את הדגימה על מדיום ההרכבה. לבסוף, השתמש בלק כדי לאטום את הדגימות לשקופית כיסוי הזכוכית כדי למנוע זיהום או תנועת דגימה.

כאן, ביטוי של חלבון המטרה עם ELP באורך מלא בתנאים מבוקרים מאומת על ידי נוכחות של רצועות ב-37 קילודלטון הן בניתוח SDS-PAGE והן בניתוח כתמים מערביים. עם זאת, בתנאים בלתי מבוקרים, ניתן לראות גם כמה רצועות במשקל מולקולרי נמוך באמצעות כתם מערבי. רצועות המשקל המולקולרי הנמוכות יותר תואמות לחלבונים עם פחות מארבע חזרות על תחום דמוי אלסטין, מה שמצביע על כך שהחלבון אינו מתורגם במלואו במהלך הביטוי.

תוצאה זו נפוצה כאשר מוליכים את הביטוי מעל 32 מעלות צלזיוס. כדי לשנות את ריכוז הליגנד של דבק התא תוך שמירה על התכונות המכניות של ההידרוג'ל קבועות, מכוונים את היחס בין וריאנט ELP המכיל את דבק התא שמקורו בפיברונקטין לבין רצפי הדבק שאינם תאים. יתר על כן, תאי אב עצביים של עכברים הם גם ברי קיימא לאורך תקופה של שבעה ימים כאשר הם עטופים בהידרוג'ל 3% ELP.

התאים החיים מזוהים בירוק בשל כתם הקלצין AM, ואילו האתידיום האדום הומודימר נקלט באופן מועדף על ידי התאים המתים. כדי לאמת את הפנוטיפ של תאי גזע של תאי אב עצביים, ביטוי של סמנים קנוניים כגון Sox2 ונסטין מודגם גם על ידי צביעה חיסונית כאשר התאים עטופים בהידרוג'לים ELP תלת מימדיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא ולטהר חלבון דמוי אלסטין לאנקפסולציה במורד הזרם של סוגי תאים שונים, ובנוסף, לחקור את תפקידה של המיקרו-סביבה התלת מימדית בוויסות הפנוטיפ התאי.