ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום האוטואימוניות כגון זיהוי חריגות בתדר התאים והבדלים בתפקוד כגון ייצור ציטוקינים מרכזיים במסגרת מחלה אוטואימונית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא יכולה ללכוד רפרטואר רחב או סוגי תאים שונים והבדלי תפקוד מדגימת דם היקפית הניתנת להשגה בקלות. בדרך כלל, אנשים חדשים בתהליך זה עשויים להתקשות בתזמון נכון של שלבי עיבוד הדם, עיצוב לוח הנוגדנים, תהליך הברקוד עצמו וניתוח נתוני תא בודד בממדים גבוהים.

גישה זו של אימונולוגיה מערכתית מתאימה במיוחד למחלות אוטואימוניות כמו זאבת שבהן חוסר ויסות חיסוני נפוץ וניכר בדם היקפי. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה כדי להבהיר את תזמון השלבים וגם כדי להראות כיצד ניתן לברקוד ולאגד מספר דגימות לפני ניתוח ציטומטריית מסה. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את צינורות הפוליסטירן התחתונים העגולים המסומנים בחמישה תנאים שונים לעיבוד דם מלא על מתלה.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס RPMI לכל צינור. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של דם מלא לכל צינור ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב היטב עם RPMI. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של רוקסוליטיניב מדולל מראש לצינור המסומן T שש פלוס חמש R וערבב היטב.

הניחו את מתלה הצינורות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והתחילו לתזמן את הדגירה. כדי לעבד את דגימת T אפס, פיפטה את כל התוכן של צינור T zero לתוך צינור חרוטי מסומן המכיל 20 מיליליטר של מאגר ליז/תיקון של 37 מעלות צלזיוס בריכוז עבודה. כדי לייעל את התאוששות התאים, שטפו את הצינור עם מאגר ליז/תיקון וערבבו על ידי היפוך הצינור החרוטי.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאפשר ליזה וקיבוע. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב -500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח כדי לפרק את הגלולה.

לאחר מכן, מלאו את הצינור החרוטי לנפח של 15 מיליליטר עם PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של CSM כדי לפרק את הגלולה.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה מסומן לצביעה של נוגדנים. בעזרת מונה תאים אוטומטי, ספרו את התאים עם דגימה של 10 מיקרוליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -500 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשאירו את הכדור בכ-60 מיקרוליטר של שאריות. שמור את הכדור הזה על קרח עד להשלמת העיבוד של הדגימות מתנאים אחרים. ב-T שווה ל-30 דקות, העבירו את מתלה הצינור למכסה המנוע.

הוסף 10 מיקרוליטר של R848 ב-0.1 גרם למיקרוליטר לצינור T six plus R848 וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר LPS ב-0.01 מיקרוגרם למיקרוליטר לצינור ה-T שש פלוס LPS וערבב היטב. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של מעכב הובלת חלבון לצינורות המסומנים T 6, T 6 ועוד 5 R ו-T 6 בתוספת LPS והחזירו את הדגימות לחממה עד ש-T שווה לשש שעות.

מערבבים היטב את הדגימות עם פיפטה P1000 כל שעתיים. ב-T שווה לשעתיים, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של קוקטייל מעכב הובלת חלבון לשפופרת T שש פלוס R848. מערבבים את כל הדגימות ומחזירים את המדף לחממה עד ש- T שווה לשש שעות.

ב-T שווה לארבע שעות, ערבבו את הדגימות עם פיפטה P1000 פעם נוספת. ב-T שווה לשש שעות, עיבוד T שש, T שש פלוס LPS, T שש ועוד R848 ו-T שש ועוד חמש מבחנות דגימת דם R כמתואר עבור דגימת T אפס. לאחר מכן, אחסן את הכדורים בנפח CSM שיורי במינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר.

כדי לקודד את התאים הקבועים הליזים, הפשירו את הדגימות מהאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס לאט על קרח. יש לדלל את מאגר סלסול הברקוד פי 10 עם PBS באחד עד 10 וליצור מספיק מאגר לשלושה מיליליטר לדגימה. מלאו שוקת לא סטרילית אחת ב-CSM ואחת במאגר סלסול ברקוד X אחד.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של CSM קר כקרח לדגימות הטריות שהופשרו, ערבב היטב והעביר לצינורות אשכול הפוליפרופילן המסומנים מראש. כעת, קחו דגימה של 10 מיקרוליטר וספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. נרמל את ספירת התאים בכל צינור אשכול על ידי הסרת נפח התאים העודפים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מאגר סלסול ברקוד X אחד עם פיפטה רב ערוצית וצנטריפוגה ב-600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט.

סדר את צינורות האשכול על מתלה באותו סדר כפי שמצוין במקש הברקוד כך שהדגימה תתאים לברקוד שלה. הוסף 800 מיקרוליטר של מאגר סלסול ברקוד X אחד על ידי פיפטה רב-ערוצית לכל הדגימות בצינורות האשכול מבלי לגעת בגלולת התא כדי להפחית את אובדן התאים. לאחר מכן, הניחו בצד את המתלה עם צינורות האשכול.

הסר את רצועות הצינור של ערכת ברקוד פלדיום 20 פלדיום ממינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר בטמפרטורת החדר. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר סלסול ברקוד X אחד, ערבב היטב והעביר 120 מיקרוליטר מתערובת הברקוד המושעה מחדש לדגימות התאים המתאימות בצינורות האשכול. מערבבים היטב על ידי פיפטה רב-ערוצית כך שלא יהיה זיהום צולב בין דגימות ברקוד בנפרד.

דגרו צינורות אשכול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לברקודים לתייג את התאים. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הדגימות ב 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט, ואז השעו אותם מחדש במיליליטר אחד של CSM.

לאחר מכן, צנטריפוגה והשעיה מחדש במעשן הסיגריות שוב. לאחר מכן, צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושואבת את הסופרנטנט. בעזרת פיפטה בודדת ובאמצעות אותו קצה, העבירו את כל כדורי התא בכ-70 עד 80 מיקרוליטר של נפח שיורי לצינור פוליסטירן אחד.

אין להוציא את קצה הפיפטה. הניחו בצד את הפיפטה הבודדת עם הקצה הזה. עם פיפטה רב-ערוצית וקצוות חדשים, הוסף 100 מיקרוליטר של CSM לכל צינור אשכול מקורי כדי למקסם את התאוששות התאים.

בעזרת הפיפטה הבודדת עם הקצה שהונח בצד, העבירו את כל כדורי התא בנפח שיורי של 100 מיקרוליטר לאותו צינור פוליסטירן. הוסף CSM כדי למלא את צינור הפוליסטירן לכשלושה מיליליטר. ספור ורשום את מספר התא של ערכת הברקודים במאגר.

לאחר מכן, צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושואבים את הסופרנטנט. המשך להכתים את הדגימות הברקודיות באותו יום. סכימה זו מדגימה את זרימת העבודה לגירוי ועיבוד דגימות הדם ההיקפי, כולל הקצאת כמות דגימות דם, תזמון הוספת חומרי גירוי, קוקטייל מעכבי הובלת חלבון וזמני הדגירה עד לליזה וקיבוע כדוריות הדם האדומות.

הבחירה בחומרים מעוררים תהיה תלויה במסלולי האיתות והציטוקינים המיועדים להערכה. לאחר קיבוע וליזיס RBC, דגימות התאים הבודדות שעברו ליזה וקבועות מתורם בריא קיבלו ברקוד, סומנו ב-26 נוגדנים כנגד סמנים על פני השטח, חדירו וצבועים ב-14 נוגדנים נגד ציטוקינים. אסטרטגיית השער המוגבלת המייצגת את הזיהוי של מונוציטים גבוהים CD14 מוצגת כאן.

משמאל לימין, כל חלקה דו-ממדית המיוצגת היא תת-קבוצה של אוכלוסייה מאוכלוסיית האב המגודרת מהתרשים הדו-ממדי מיד משמאל. תוך שימוש במונוציטים גבוהים של CD14 כמייצגים בשמונה תת-קבוצות של תאים חיסוניים, בוצע ניתוח ציטומטריה מסה על דגימות דם היקפיות מתורם בריא בזמן אפס ללא גירוי ובעקבות גירוי עם אגוניסט TLR LPS ו-R848 ומפעיל תאי T PMA יונומיצין. מוצגת דוגמה לאינדוקציה של ציטוקינים במונוציטים גבוהים CD14 ומתוארים ציטוקינים נבחרים עם ספציפיות לחומר המגרה בו נעשה שימוש.

R848 גורם באופן סלקטיבי לתת-יחידה IL-12p40 ו-MCP1 במונוציטים גבוהים CD14 בעוד ש-LPS לא. לעומת זאת, יונומיצין PMA אינו גורם לציטוקינים במונוציטים גבוהים CD14. לאחר השליטה, ניתן לבצע את גירוי הדם תוך כשבע שעות ושלב הברקוד יכול להסתיים תוך כשעה בלבד.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לשים לב לתזמון השלבים ולתכנן קדימה בהתאם. לאחר ביצוע הליך זה, תוכל לשקול לשנות את תנאי גירוי הדם בפאנל ציטומטריית המסה על מנת להעריך את תגובות תאי החיסון הספציפיות למטרות המחקר שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעורר תגובות ציטוקינים מדגימות דם מלאות וכיצד לאגד דגימות מרובות לסט ברקוד לניתוח ציטומטריית מסה.