לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

המטרה הכוללת של תהליך הכנת דגימה זה היא לייצר צביעת נוגדנים חזקה ועקבית של דגימות מגוונות כדי לאפשר חקירה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות לגבי זהות התא, איתות התא ותגובת התא באוכלוסיית תאים הטרוגנית מורכבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של רמות חלבון בפרמטרים גבוהים ברמת התא הבודד.

מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אונדריאטה דאנקן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. עבור כל דגימת תרחיף של תא בודד, השעו אותה מחדש בארבע פעמים 10 עד שישית התאים למיליליטר במדיום נטול סרום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 50 מיקרו-מולר ציספלטין טרי לכל 2/10 לתוך ששת התאים, ודגרו את הדגימות על שייקר אורביטלי עם ערבוב מתמיד בטמפרטורת החדר. לאחר דקה אחת, הרוו את הציספלטין בנפח שווה של מאגר כביסה וצנטריפוגה את התאים.

השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הדגימות פעמיים נוספות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה, צנטריפוגה של התאים ושפיכת מאגר הכביסה. לאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של PBS, צנטריפוגה דומה של הדגימות והשלכת הסופרנטנט. לאחר שטיפת ה-PBS השנייה, השעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר PBS טרי וקבעו את התאים ב-500 מיקרוליטר של 4% PFA.

פיפטה את התאים לערבב. לאחר מכן הניחו את הדגימות על שייקר המסלול תוך ערבוב מתמיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שטיפה ב-PBS טרי.

כדי לחדור לתאים, סובב שוב את התאים והשליך את הסופרנטנטים. השעו מחדש את הדגימות ב-PBS השיורי על ידי מערבולת עדינה, והוסיפו מיד מיליליטר אחד של 100% מתנול לכל 2/10 10 לתאים השישיים עם פיפטינג עדין. דגרו את הדגימות בארבע מעלות למשך שעה לפחות, ובסוף הדגירה צנטריפוגה את התאים.

לאחר מכן, שפכו את המתנול. לאחר מכן שטפו את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר כביסה עבור כל מיליליטר מתנול, ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה טרי. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר המוגדרת ל-50 מיקרוליטר, העבירו את מאגר הכביסה הנותר מכל כדור לצינור של קוקטייל הנוגדנים המתאים המתאים.

פיפטה מגבים את התמיסה המשולבת מבלי לשאוב אוויר לקצה על ידי שמירה על הבוכנה מדוכאת חלקית. לאחר מכן העבירו את קצה הפיפטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה מבלי לשחרר את הבוכנה. שחרר את הבוכנה, שרטט את מאגר הכביסה לנפח קוקטייל נוגדנים כולל של 50 מיקרוליטר וסמן את הדגימה המתאימה המתאימה עם קוקטייל הנוגדנים הנשאף על ידי פיפטינג עדין.

לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור מתמיד, שטפו את הדגימות ארבע פעמים, ושפכו את מאגר הכביסה בכל פעם. כדי לתייג את התאים באירידיום, השעו מחדש את הכדורים הסופיים ב-500 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של ארבעה אחוז PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של אירידיום 62.5 ננו-מולרי טרי ו-PFA לדגימות למשך 15 דקות נוספות של ניעור בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים, שפכו את הסופרנטנט, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של 0.1 אחוז BSA ומים מסוננים. נתח את הדגימות על ידי הוספת חרוזי נורמליזציה לבארות של לוחות דגימה, פיפטינג תאים לבארות אלה ולאחר מכן ביצוע ציטומטריית מסה תוך 24 שעות. לאחר נורמליזציה של עוצמת האות, ניתן להסיר את חרוזי הכיול מהנתונים על ידי שער על האוכלוסייה השלילית של חרוזי אירידיום 191.

לאחר מכן ניתן לסגור את אירועי התא הבודד כדי להסיר את הפסולת והכפלת התאים באמצעות תרשים דו-צירי של ביטוי שלילי של אירידיום 193 לעומת אורך האירוע. ניתן להשתמש בתיוג ציספלטין כדי למדוד את כמות עומק התא. לדוגמה, כאן מוצגות דגימות עם כמויות נמוכות וגבוהות יותר של תאים מתים.

ניתן להסיר את התאים המתים על ידי הרחקת האוכלוסייה החיובית לפלטינה 198, ברקוד מביא להפרדה ברורה של הדגימות בתוך פרמטרי הברקוד, מה שמאפשר להקצות את התאים לזהות הדגימה המקורית שלהם. ניתן להשתמש בתיוג IDU כדי לזהות תאי פנים בארה"ב שנצפו כאן. לאחר הנורמליזציה הראשונית, דה-ברקוד ושער, ניתן לנתח את הנתונים בממדים גבוהים באמצעות אלגוריתם SPADE כדי ליצור ייצוג ממדי נמוך יותר של הנתונים המתאים יותר לפרשנות חזותית.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את אובדן הדגימה בזמן ביצוע שלב הכביסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות לניתוח ציטומטריה המונית.

אל תשכח שעבודה עם נתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת, לכן עליך לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.