לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass
29 באפריל 2017
מאמר זה מתאר את האיסוף והעיבוד של דגימות לניתוח ציטומטריית מסה.
המטרה הכוללת של תהליך הכנת דגימה זה היא לייצר צביעת נוגדנים חזקה ועקבית של דגימות מגוונות כדי לאפשר חקירה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות לגבי זהות התא, איתות התא ותגובת התא באוכלוסיית תאים הטרוגנית מורכבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של רמות חלבון בפרמטרים גבוהים ברמת התא הבודד.
מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אונדריאטה דאנקן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. עבור כל דגימת תרחיף של תא בודד, השעו אותה מחדש בארבע פעמים 10 עד שישית התאים למיליליטר במדיום נטול סרום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 50 מיקרו-מולר ציספלטין טרי לכל 2/10 לתוך ששת התאים, ודגרו את הדגימות על שייקר אורביטלי עם ערבוב מתמיד בטמפרטורת החדר. לאחר דקה אחת, הרוו את הציספלטין בנפח שווה של מאגר כביסה וצנטריפוגה את התאים.
השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הדגימות פעמיים נוספות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה, צנטריפוגה של התאים ושפיכת מאגר הכביסה. לאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של PBS, צנטריפוגה דומה של הדגימות והשלכת הסופרנטנט. לאחר שטיפת ה-PBS השנייה, השעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר PBS טרי וקבעו את התאים ב-500 מיקרוליטר של 4% PFA.
פיפטה את התאים לערבב. לאחר מכן הניחו את הדגימות על שייקר המסלול תוך ערבוב מתמיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שטיפה ב-PBS טרי.
כדי לחדור לתאים, סובב שוב את התאים והשליך את הסופרנטנטים. השעו מחדש את הדגימות ב-PBS השיורי על ידי מערבולת עדינה, והוסיפו מיד מיליליטר אחד של 100% מתנול לכל 2/10 10 לתאים השישיים עם פיפטינג עדין. דגרו את הדגימות בארבע מעלות למשך שעה לפחות, ובסוף הדגירה צנטריפוגה את התאים.
לאחר מכן, שפכו את המתנול. לאחר מכן שטפו את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר כביסה עבור כל מיליליטר מתנול, ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה טרי. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר המוגדרת ל-50 מיקרוליטר, העבירו את מאגר הכביסה הנותר מכל כדור לצינור של קוקטייל הנוגדנים המתאים המתאים.
פיפטה מגבים את התמיסה המשולבת מבלי לשאוב אוויר לקצה על ידי שמירה על הבוכנה מדוכאת חלקית. לאחר מכן העבירו את קצה הפיפטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה מבלי לשחרר את הבוכנה. שחרר את הבוכנה, שרטט את מאגר הכביסה לנפח קוקטייל נוגדנים כולל של 50 מיקרוליטר וסמן את הדגימה המתאימה המתאימה עם קוקטייל הנוגדנים הנשאף על ידי פיפטינג עדין.
לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור מתמיד, שטפו את הדגימות ארבע פעמים, ושפכו את מאגר הכביסה בכל פעם. כדי לתייג את התאים באירידיום, השעו מחדש את הכדורים הסופיים ב-500 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של ארבעה אחוז PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של אירידיום 62.5 ננו-מולרי טרי ו-PFA לדגימות למשך 15 דקות נוספות של ניעור בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים, שפכו את הסופרנטנט, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של 0.1 אחוז BSA ומים מסוננים. נתח את הדגימות על ידי הוספת חרוזי נורמליזציה לבארות של לוחות דגימה, פיפטינג תאים לבארות אלה ולאחר מכן ביצוע ציטומטריית מסה תוך 24 שעות. לאחר נורמליזציה של עוצמת האות, ניתן להסיר את חרוזי הכיול מהנתונים על ידי שער על האוכלוסייה השלילית של חרוזי אירידיום 191.
לאחר מכן ניתן לסגור את אירועי התא הבודד כדי להסיר את הפסולת והכפלת התאים באמצעות תרשים דו-צירי של ביטוי שלילי של אירידיום 193 לעומת אורך האירוע. ניתן להשתמש בתיוג ציספלטין כדי למדוד את כמות עומק התא. לדוגמה, כאן מוצגות דגימות עם כמויות נמוכות וגבוהות יותר של תאים מתים.
ניתן להסיר את התאים המתים על ידי הרחקת האוכלוסייה החיובית לפלטינה 198, ברקוד מביא להפרדה ברורה של הדגימות בתוך פרמטרי הברקוד, מה שמאפשר להקצות את התאים לזהות הדגימה המקורית שלהם. ניתן להשתמש בתיוג IDU כדי לזהות תאי פנים בארה"ב שנצפו כאן. לאחר הנורמליזציה הראשונית, דה-ברקוד ושער, ניתן לנתח את הנתונים בממדים גבוהים באמצעות אלגוריתם SPADE כדי ליצור ייצוג ממדי נמוך יותר של הנתונים המתאים יותר לפרשנות חזותית.
לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את אובדן הדגימה בזמן ביצוע שלב הכביסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות לניתוח ציטומטריה המונית.
אל תשכח שעבודה עם נתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת, לכן עליך לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר את איסוף ועיבוד הדגימות לניתוח ציטומטריה המונית. השיטה מכוונת לייצר צביעת נוגדנים עקבית כדי לחקור אוכלוסיות תאים הטרוגניות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריה מונית
רקע
- ציטומטריה מונית מאפשרת מדידה של רמות חלבון בפרמטרים גבוהים ברמת תא בודד.
- היא שימושית להבנת זהות התא והעברת האותות שלו.
- הטכניקה חלה על אוכלוסיות תאים הטרוגניות מורכבות.
- הכנת הדגימה היא חיונית לתוצאות אמינות.
מטרת המחקר
- להדגים תהליך הכנת דגימות לציטומטריה מונית.
- לאפשר חקירה של אוכלוסיות תאים מגוונות.
- לספק תובנות לגבי תגובות ושיתופי פעולה של תאים.
שיטות בשימוש
- השעיה מחדש של דגימות השעיה של תא בודד במדיום נטול סרום.
- שימוש ב-Cisplatin טרי להכנה לטיפול בתאים.
- דגירה על מנעד מסלולי להתערבול עקבי.
- צנטריפוגה ושטיפת תאים לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקת הכנת דגימות יעילה.
- השגת צביעת נוגדנים עקבית בין הדגימות.
- ניתוח בפרמטרים גבוהים מתאפשר ברמת תא בודד.
- השגת תובנות לגבי אוכלוסיות תאים הטרוגניות.
מסקנות
- השיטה משפרת את היכולת לנתח אוכלוסיות תאים מורכבות.
- הכנת דגימות חזקה היא חיונית לתוצאות מדויקות של ציטומטריה מונית.
- טכניקה זו יכולה לקדם מחקר בביולוגיה של התא ובמדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
