Name: לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו הכנת דגימות לציטומטריית מסה לניתוח אוכלוסיות תאים הטרוגניות. השיטה משתמשת ב-Cisplatin ובצביעת נוגדנים עקבית כדי לחקור זהות תאים ואיתות במערכת העצבים ובביולוגיה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת ברטון נתמכה על ידי מענק מהמכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT RP110471). מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מלגת הכשרה לריאן ל. מקארתי מתוכנית ההכשרה של המכונים הלאומיים לבריאות בגנטיקה מולקולרית 5 T32 CA009299. מתקן הליבה שמתחזק ומפעיל את מכונת ציטומטריית המסה נתמך על ידי מענק CPRIT (RP121010) ומענק ליבה של NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המובא כאן הועסק בהצלחה לעיבוד של שורות תאים בתרבית שונות (H1 ו- H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) ודגימות רקמה עיקריות (מח עצם עכבר, כבד עוברי בעכבר, מבוגר עכבר כבד, גידולי עכבר). בלי קשר למקור, כל הרקמות שניתן ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על מצב הסלולר צריך להיות מקובל ניתוח על ידי המוני cytometry, אולם לעתים יש צורך אופטימיזציה בפרוטוקול. חשוב לציין כי חלק האפיטופים עשוי להיות מושפע ניתוק הספציפי, טיפולי קיבעון permeabilization מנוצלים ושיטות אלה י...

Cytometry מאפשרת מדידה בו זמנית של הנוגדן מכוון מרובים ברמה תא בודד באוכלוסיות גדולות של תאים. בשנת cytometry זרימת קרינה המבוססת מסורתית, מספר הפרמטרים שניתן לכמת מוגבל על ידי חפיפה ספקטרלית בין ספקטרום הפליטה של ​​fluorophores המרובה, אשר דורש חישובי פיצוי מורכבים יותר ויותר ככל שגדל מספר פרמטרים. מגבלות אלה מטופלות על ידי המוני cytometry, שבו נוגדנים כבדים מצומדות מתכת מזוהות לכמת ידי זמן של ספקטרומטריית מסת טיסה (TOF) כדי להרחיב את מספר הפרמטרים מאוד שנאספו בו זמנית להניב פרופיל חלבון-שפע ממדי גבוה עבור כל תא יחיד. הבנה בסיסית של פעולתו של המסה cytometry המכשיר מועילה המשתמש ועלולה להיות חיוני לפתרון בעיות. לקבלת תיאור מפורט יותר של כוונון והפעלה מכונית cytometry ההמונית,לראות את כתב יד 1 קשור. בקצרה, מדגם התא מסומן עם פאנל של נוגדנים מצומדות מתכת מיקוד סמנים פני התא, חלבונים ציטופלסמית, חלבונים גרעיניים, חלבונים או אפיטופים אחרים הנכנס הכרומטין של עניין (איור 1i). תאי שכותרתו נטענים על גבי המכונה, או אחד בכל פעם על ידי הזרקה ידנית או באמצעות autosampler כי דגימות צלחת 96-היטב. תאי טעון מוזרקים דרך nebulizer, אשר מייצר נתזי טיפות נוזל בבועה התאים (איור 1ii). ספריי זה ממוקמים כך התאים מיוננים על ידי לפיד פלזמת ארגון. יינון זה יוצר ענן חלקיקים מורכבים מכל אטומי המרכיבים של כל תא (1iii איור). כמו ענן החלקיקים הזה נוסע הגלאי, אטומי מסה אטומיים נמוכים מופרדים מן יוני מסה הגבוהים על ידי מסנן מונית quadrupole. יוני המסה הגבוהים הנותרים ממשיכים הגלאי, שבו abund<html> אהה של כל איזוטופ מכמתים (1iv איור). הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי הגלאי, מנותחים על ידי תוכנת מכשיר cytometry ההמונית לזהות אירועי תא. עבור כל אירוע התא מזוהה, האות זוהה בכל ערוץ כימות הציל לקובץ .fcs פלט. ערוצי המונית המשמשים לאיתור הנוגדנים כבד מתכת מצומדות להפגין חפיפה ספקטרלית מינימאלית, אשר נעה בין 0-4% עם רוב התרומות מתחת 1%. בגלל הצטלבות נמוכה זו בין ערוצים, זה בדרך כלל לא נחוץ להפוך את הנתונים עם מטריצת פיצויים לפני הניתוח 2. עם זאת, יש להיזהר בעת העיצוב של לוח ניסיוני של נוגדנים כדי להבטיח כי נוגדן עם אפיטופ גבוה שפע אינו מוקצה ערוץ מסה שתורם אות לערוץ מוקצה נוגדנים נמוך שפע, הכיוון שהדבר עלול ליצור אוכלוסייה גבוהה באופן מלאכותי באפיק קבלת תרומת האות. תחת = &quot;jove_content&quot;&gt; ההכנה המדויקת של דגימות עבור המוני cytometry ניתוח התלות גבוהה סוגי דגימות נאספות ואת ההשערה הניסיונית נבדקת. אנו מספקים דוגמאות של שני פרוטוקולי ניקיון סוגים שונים של תאים (תאי גזע עובריים אנושיים) תאים ראשוניים (לבודד תאי האפיתל גידול עכבר שד). כאשר מתחיל מחקר cytometry ההמוני, מומלץ לבצע תחילה ניסוי פיילוט קטן כדי להבטיח כי כל הפרוטוקולים והנוגדנים להיות מנוצלים פועלים כראוי בידי החוקר. הדבר נכון במיוחד כאשר חיוני נוגדנים מצומדות מותאם אישית כדי לשמש, כמו תגובת ההפחתה החלקית במהלך נטיית הנוגדן בעל הפוטנציאל לשבש זיקת נוגדן; ולכן, כל נוגדן מותאם אישית צריך להיות תוקף אמפירי כדי להבטיח דיוק הנתונים. שיקולים נוספים כוללים קביעה אם נוגדנים פני תא כדי להיות בשימוש assay יכירו האפיטופים שלהם לאחר קיבוע או אם הם neאד להיות מיושם לחיות תאים. חלק הקיבעון יכול למנוע צביעה נכונה עם נוגדנים פני תא כידוע להתרחש עם פפטיד-MHC מכתים 3, 4. Performing מכתים נוגדן תא השטח על תאים חיים עשוי להיות נחוץ עבור נוגדנים מסוימים, אבל זה מונע את האפשרות של barcoding לפני תיוג נוגדן כמו שיטות barcoding ביותר מבוצעות לאחר קיבוע 5 למרות barcoding מבוססי נוגדנים 6, 7 הוא חריג. בעת קביעת מספר התאים להיות מוכן לניתוח, חשוב לדעת כי רק חלק קטן של התאים הועמסו על המכונית יאותר ולהפיק נתונים. הפסד זה נובע בעיקר מחוסר יעילות כאשר nebulizer תרסיסים מדגם בבית לפיד. הפסד האחוז המדויק תלוי המסה cytometry התקנת מכונית וסוג התא אבל יכול לנוע בין 50-85% וצריך להיותבחשבון בעת ​​תכנון הניסוי. פרוטוקול זה ממוטב עבור 2x10 6 תאים לדגימה אך ניתן להתאים לעיבוד גודל מדגם קטן או גדול. פרוטוקול זה יכול לשמש עם שינויים מינימליים עבור גודל מדגם מ 1 x 10 6 4 x 10 6, אולם חשוב כי גודל המדגם להישמר עקבי במסגרת ניסוי. שינויים במספר תאים יכולים להשפיע על עוצמת מכתים barcoding נוגדנים צריך להישמר עקבי בערך ברחבי דגימות כדי להשוות ישירות. כמה נהלים, כגון תיוג תא מת תיוג DNA, צריכות להתבצע הרוב המכריע, אם כל העיצובים הניסיונות לא. התיוג של תאים מתים בניסויי ניתוח רק סמני משטח יכול להיות מושג באמצעות Rh103, אבל Rh103 יש להימנע עבור ניסויים שבם permeabilization נדרש כפי שהיא גורמת להפסד מכתים. בניסויים מעורבים permeabilization, מומלץ לנצל cisplatin <sעד class = &quot;Xref&quot;&gt; 8 ו, במידת האפשר, נוגדן הכרה PARP ביקע או ביקע caspase לזהות תאים אפופטוטיים מת. דגימות ברקודים יכולות להפחית את צריכת נוגדן, להקטין זמן רכישה ולחסל מדגם ל-מדגם 9 השתנות. תהליך barcoding כרוך החלת דוגמת קוד ספציפי וייחודי לכל התאים, אשר משמש להקצות לכל התא מדגם של מקורו. לאחר barcoding דגימות עשוי להיות ונקווה לפני מכתים נוגדן, תהליך המבטיח את כל דגימות מגואלות באותה מידה. כדי למזער שגיאות ניסיון, זה נבון ברקוד ומכניס כל דגימות כי יש להשוות ישירות זה לזה. נכון לעכשיו קיימות מספר שיטות barcoding דגימות עבור המוני ניתוח cytometry 5, 6, 7, שניים מהם מוצגים כאן (ראו להלן). עם Reagen זמין כרגעTS אפשר לכמת את השפע של 38 הנוגדן מכוון, לזהות תאים S-שלב 10, להבחין בין תאים חיים ומתים 8 ולמדוד רמות הסלולר של היפוקסיה 11 בניסוי מרובב של דגימות מרובות. יכולת זו כדי לאסוף נתונים סלולריים גבוה פרמטר אחד עבור אוכלוסיות תאים גדולות מאפשרת פרופיל משופר של אוכלוסיות תאים הטרוגנית מאוד וכבר הפיקה מספר תובנה ביולוגיות רומן 12, 13, 14, 15, 16. זיקוק הנתונים מורכבים והתוצאה למידע לפירוש דרש שימוש באלגוריתמים חישוביים כולל עץ פורש מהלך האירועים מנורמל צפיפות (ספייד) 17 ו viSNE 18. מאמר זה מציג נגישסקירה של איך לעצב ולבצע מסה cytometry הניסוי ומציג ניתוח בסיסי של המוני cytometry נתונים.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 ערכה בינונית</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>05850</td><td>חם בטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>חם ב-37&nbsp; &deg; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>Accutase</td><td>07920</td><td>חם ב-37&nbsp; &deg; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>מסופק ב 1&nbsp; מזהה תא mM</td></tr><tr><td>Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>מסופק ב- 1&nbsp; מזהה תא mM</td></tr><tr><td>Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>מסופק ב-1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>ציספלטין</td><td>אנזו מדעי החיים</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>מסיס עד 25&nbsp; mg/mL ב-DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>מסיס עד 74&nbsp; מ"ג/מ"ל ב-0.2&nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 חומר אינטרקלציה</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>BP1105-4</td><td>צמרמורת ב -20&nbsp; &deg; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות תחתונים עגולים</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל 35 & #956; m צינורות כובע מסנן</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ חרוזי כיול ארבעה אלמנטים</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase סוג I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מ- Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

לדוגמא הכנה לניתוח cytometry mass

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry מנצל נוגדנים מצומדות עם תוויות מתכת כבדה, גישה הגדילה את מספר הפרמטרים וההזדמנויות לניתוח עמוק הרבה מעבר למה שאפשר להשיג עם זרימת קרינה המבוססת קונבנציונלית cytometry. כמו בכל טכנולוגיה חדשה, ישנם צעדים קריטיים המסייעים להבטיח את הדור האמין של נתונים איכותיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימיזציה המשלב טכניקות מרובות לעיבוד דגימות תאים לניתוח cytometry ההמוני. השיטות שתוארו כאן תעזורנה למשתמש להימנע ממכשולים נפוצים להשיג תוצאות עקביות על ידי מזעור השתנות, מה שעלול להוביל נתונים לא מדויקים. כדי ליידע עיצוב ניסיוני, את הרציונל מאחורי צעדים אופציונליים או חלופה בפרוטוקול והיעילות שלהם בחשיפת ממצאים חדשים בתחום הביולוגיה של מערכת נחקרת מכוסית. לבסוף, הוא הציג נתוני נציג כדי להמחיש את תוצאות צפויות מן presente הטכניקותד כאן.

הפרוטוקול המובא כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב במגוון רחב של דגימות תאים בתרבית ראשוניות עם שינויים קלים בלבד. בהתאם לדרישות של הניסוי, זה יכול להתבצע באופן מודולרי כאשר אלמנטים מסוימים, כגון מכתים barcoding או תא שטח, אינם נחוצים. מנוצל במלואו פרוטוקול זה מאפשר הכנת ההמונית מרובבת cytometry הדגימות שכותרתו עבור הדרת תאים מתה, זיהוי אוכלוסיית S-שלב ומוכתם עבור כימות של עד 38 נוגדן מכוון. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

מאמר זה מתאר את האיסוף והעיבוד של דגימות לניתוח ציטומטריית מסה.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

המטרה הכוללת של תהליך הכנת דגימה זה היא לייצר צביעת נוגדנים חזקה ועקבית של דגימות מגוונות כדי לאפשר חקירה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות לגבי זהות התא, איתות התא ותגובת התא באוכלוסיית תאים הטרוגנית מורכבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של רמות חלבון בפרמטרים גבוהים ברמת התא הבודד.מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אונדריאטה דאנקן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. עבור כל דגימת תרחיף של תא בודד, השעו אותה מחדש בארבע פעמים 10 עד שישית התאים למיליליטר במדיום נטול סרום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 50 מיקרו-מולר ציספלטין טרי לכל 2/10 לתוך ששת התאים, ודגרו את הדגימות על שייקר אורביטלי עם ערבוב מתמיד בטמפרטורת החדר. לאחר דקה אחת, הרוו את הציספלטין בנפח שווה של מאגר כביסה וצנטריפוגה את התאים.השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הדגימות פעמיים נוספות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה, צנטריפוגה של התאים ושפיכת מאגר הכביסה. לאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של PBS, צנטריפוגה דומה של הדגימות והשלכת הסופרנטנט. לאחר שטיפת ה-PBS השנייה, השעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר PBS טרי וקבעו את התאים ב-500 מיקרוליטר של 4% PFA.פיפטה את התאים לערבב. לאחר מכן הניחו את הדגימות על שייקר המסלול תוך ערבוב מתמיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שטיפה ב-PBS טרי.כדי לחדור לתאים, סובב שוב את התאים והשליך את הסופרנטנטים. השעו מחדש את הדגימות ב-PBS השיורי על ידי מערבולת עדינה, והוסיפו מיד מיליליטר אחד של 100% מתנול לכל 2/10 10 לתאים השישיים עם פיפטינג עדין. דגרו את הדגימות בארבע מעלות למשך שעה לפחות, ובסוף הדגירה צנטריפוגה את התאים.לאחר מכן, שפכו את המתנול. לאחר מכן שטפו את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר כביסה עבור כל מיליליטר מתנול, ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה טרי. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר המוגדרת ל-50 מיקרוליטר, העבירו את מאגר הכביסה הנותר מכל כדור לצינור של קוקטייל הנוגדנים המתאים המתאים.פיפטה מגבים את התמיסה המשולבת מבלי לשאוב אוויר לקצה על ידי שמירה על הבוכנה מדוכאת חלקית. לאחר מכן העבירו את קצה הפיפטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה מבלי לשחרר את הבוכנה. שחרר את הבוכנה, שרטט את מאגר הכביסה לנפח קוקטייל נוגדנים כולל של 50 מיקרוליטר וסמן את הדגימה המתאימה המתאימה עם קוקטייל הנוגדנים הנשאף על ידי פיפטינג עדין.לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור מתמיד, שטפו את הדגימות ארבע פעמים, ושפכו את מאגר הכביסה בכל פעם. כדי לתייג את התאים באירידיום, השעו מחדש את הכדורים הסופיים ב-500 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של ארבעה אחוז PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של אירידיום 62.5 ננו-מולרי טרי ו-PFA לדגימות למשך 15 דקות נוספות של ניעור בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים, שפכו את הסופרנטנט, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-500 מיקרוליטר של 0.1 אחוז BSA ומים מסוננים. נתח את הדגימות על ידי הוספת חרוזי נורמליזציה לבארות של לוחות דגימה, פיפטינג תאים לבארות אלה ולאחר מכן ביצוע ציטומטריית מסה תוך 24 שעות. לאחר נורמליזציה של עוצמת האות, ניתן להסיר את חרוזי הכיול מהנתונים על ידי שער על האוכלוסייה השלילית של חרוזי אירידיום 191.לאחר מכן ניתן לסגור את אירועי התא הבודד כדי להסיר את הפסולת והכפלת התאים באמצעות תרשים דו-צירי של ביטוי שלילי של אירידיום 193 לעומת אורך האירוע. ניתן להשתמש בתיוג ציספלטין כדי למדוד את כמות עומק התא. לדוגמה, כאן מוצגות דגימות עם כמויות נמוכות וגבוהות יותר של תאים מתים.ניתן להסיר את התאים המתים על ידי הרחקת האוכלוסייה החיובית לפלטינה 198, ברקוד מביא להפרדה ברורה של הדגימות בתוך פרמטרי הברקוד, מה שמאפשר להקצות את התאים לזהות הדגימה המקורית שלהם. ניתן להשתמש בתיוג IDU כדי לזהות תאי פנים בארה"ב שנצפו כאן. לאחר הנורמליזציה הראשונית, דה-ברקוד ושער, ניתן לנתח את הנתונים בממדים גבוהים באמצעות אלגוריתם SPADE כדי ליצור ייצוג ממדי נמוך יותר של הנתונים המתאים יותר לפרשנות חזותית.לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את אובדן הדגימה בזמן ביצוע שלב הכביסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות לניתוח ציטומטריה המונית.אל תשכח שעבודה עם נתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת, לכן עליך לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה...

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

סרטון זה מדגיש שיטה פרוטאומית חד-תאית המשתמשת בנוגדנים מצומדים במתכת כבדה לברקוד תאים מובחן. לאחר מכן, immunostaining ו cytometry המסה מוחלים כדי להעריך שינויים פנוטיפיים חיסוניים ותפקודיים בתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם שלם.

בדיקת ברקוד לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי מערכת החיסון

השימוש בדגימת ציטומברשת לאיסוף לימפוציטים ומונוציטים מהאנדו-צוואר הרחם הוא טכניקה זעיר פולשנית המספקת דגימות לניתוח חסינות דרכי המין הנשיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את איסוף דגימות הציטו-מברשת ובידוד תאי החיסון עבור מבחני זרימה ציטומטרית.

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידה מדויקת ואמינה של מטבוליטים בסוגי תאים נדירים. שיפורים טכניים, כולל נוזל מעטפת שונה למיון תאים ויצירת דגימות ריקות רלוונטיות, מאפשרים כימות מקיף של מטבוליטים עם קלט של 5000 תאים בלבד לדגימה.

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת לבידוד תליות חד-תאיות איכותיות הן מרקמת ריאות עכברית בריאה והן מגידולים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על scRNA-seq, ניתוח ציטומטריית זרימה, ובידוד תאים ראשוניים.

הכנה אופטימלית של רקמת ריאה נושאת גידול עכברוניים שלמים לצורך ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי

למדו הכנת דגימות לציטומטריית מסה לניתוח אוכלוסיות תאים הטרוגניות. השיטה משתמשת ב-Cisplatin ובצביעת נוגדנים עקבית כדי לחקור זהות תאים ואיתות במערכת העצבים ובביולוגיה התאית.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

גלה סרטונים נוספים