הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של mRNA כגון, האם מטרת mRNA חזויה בסיליקו יכולה לקיים אינטראקציה ישירה עם מיקרו-RNA תאי מסוים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת בחיקויים ביוטיניים כדי למשוך את ה-mRNA המטרה. ולחיקויים הביוטיניליים הללו יש חומצות גרעין נעולות או כימיה חיקוי מבוססת LNA המסייעת ביצירת אוליגונוקלאוטידים יציבים מאוד עם זיקה גבוהה מאוד שיכולה לשפר את הספציפיות של התגובה.

ההשלכות של מתודולוגיה זו הן שהיא יכולה להרחיק מהבנת הביולוגיה של המיקרו-רנ"א לטיפולים מבוססי מיקרו-רנ"א. הסיבה העיקרית לכך היא שכולנו יודעים שמיקרו-רנ"א ממלאים תפקידים קריטיים בכל היבט של הביולוגיה התאית. אז על ידי זיהוי המטרות של המיקרו-רנ"א, אלה הם ה-mRNA, אנחנו בהחלט יכולים לספק ידע קריטי שיהיה חשוב לגילוי ולטיפול.

מי שידגים את הפרוטוקול יהיה סביאסאצ'י דאש, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי לצפות את החרוזים המגנטיים בסטרפטווידין, ראשית, מערבב את החרוזים ביסודיות כדי להשעות מחדש. לאחר מכן, העבירו 30 מיקרוליטר של החרוזים התלויים בצינור מיקרופוגה נטול נוקלאז של שני מילימטרים.

השאר את הצינור מלא במתלה החרוז המגנטי על המגנט למשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, הסר את הסופרנטנט בעזרת מיקרופיפט כאשר החרוזים נמשכים לצד הצינור במגע עם המגנט. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה לחרוזים.

לאחר הוספת מאגר הכביסה, הסר את הצינור מהמגנט. לאחר מכן, מערבל את החרוזים למשך 15 שניות כדי לשטוף אותם. לאחר מכן, העבירו את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים על המגנט למשך שתי דקות.

לאחר סיום הדגירה, הוציאו את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת שחרור RNase לחרוזים. מערבול את החרוזים למשך 15 שניות כדי לערבב את תמיסת ה-RNase.

לאחר מכן, דגרו את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות של דגירה, העבירו את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים על המגנט למשך שתי דקות. לאחר הדגירה, הוציאו את הסופרנטנט והשליכו אותו.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת השעיה לחרוזים, ומערבולת למשך 15 שניות. לאחר המערבולת, דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו את הצינור עם החרוזים המגנטיים על המגנט למשך שתי דקות.

לאחר שתי דקות, הוציאו את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימת חרוזים לחרוזים. כדי להשעות מחדש את החרוזים בתמיסת החסימה, מערבל אותו היטב בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות.

לאחר מכן, השאירו את הצינור על מסובב רב צינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. להכנת הליזאט, השתמש במגרד תאים וגרד את תאי HEK293T הטרנספטציה מתחת למכסה המנוע הלמינר. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרופוגה של שני מיליליטר.

לאחר מכן, הכניסו את תרחיף התא לצנטריפוגה ב-1, 500 גרם למשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, ממיסים את גלולת התא במי מלח 1x פוספט חוצץ שנשמר ב-pH 7.2. חזור על תהליך הצנטריפוגה, כדי לקבל כדור שיורי ללא בינוני.

לאחר סיום הצנטריפוגה, העבירו במהירות את הכדור על הקרח. לאחר מכן, הכינו מאגר ליזה טרי של תאים. לאחר הכנת המאגר, הוסף 260 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים שלם לדגימה בצינור המיקרופוגה.

פינט את כדור התא מספר פעמים להשעיה הומוגנית. כדי ליז את התאים, דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, השאירו את התאים על קרח.

חזור על תהליך הצנטריפוגה בחום של 16, 000 גרם למשך חמש דקות בצנטריפוגה ספסל בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט המכיל ליזאט בצינור מיקרופוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר על קרח והוציאו את הגלולה. לסופרנטנט, הוסף חמש נתרן כלורי מולארי כדי להשיג ריכוז סופי של טוחנת אחת.

ראשית, הכינו את מאגר הכביסה הנשלף. לאחר חסימת חרוזים לאחר הדגירה למשך הלילה, העבירו את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים על המגנט למשך שתי דקות. השליכו את הסופרנטנט לאחר תקופת הדגירה.

לחרוזים מוסיפים 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה נשלף קר כקרח. לאחר מכן, מערבל את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות. ומיד לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 שניות.

לאחר דקה, העבירו את הצינור המכיל את החרוזים המגנטיים על המגנט למשך שתי דקות. השליכו את הסופרנטנט לאחר תקופת הדגירה. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר כביסה נשלף מלא.

לאחר הוספת נתרן כלורי, העבירו 300 מיקרוליטר של ליזט התא לצינור מיקרופוגה מלא ב-300 מיקרוליטר חרוזים. לאחר מכן, השאירו את התערובת על מערבל האגוזים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, העבירו את הצינור על המגנט למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט לאחר תקופת הדגירה. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה נשלף מלא קר כקרח לחרוזים. לאחר הוספת המאגר, מערבלים את החרוזים למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הנח את הצינור על המגנט למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט לאחר תקופת הדגירה. לאחר מכן, ממיסים את החרוזים ב-100 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, ומאחסנים על קרח.

בודד את ה-RNA הכולל מהחרוזים. לאחר מכן, ממיסים את ה-RNA המבודד ב-25 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, מדוד את ריכוז ה- RNA בספקטרופוטומטר.

לבסוף, הכינו את תמיסת ה-RNA ב-50 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, השתמש ב-50 ננוגרם מסך ה-RNA המבודד כדי לסנתז DNA משלים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף פריימרים של אוליגו לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.

הנח את צינור ה-PCR על התרמו-סייקלר והתחל בריצה. לאחר השלמת ה-qPCR, העבירו תשעה מיקרוליטרים מתערובת תגובת ה-PCR בכל באר של הצלחת. לכל באר, הוסף מיקרוליטר אחד של DNA משלים כדי להשיג נפח סופי של 10 מיקרוליטר.

לאחר מכן, השתמש באיטום צלחות PCR עמיד בחום כדי לאטום את לוחית ה-PCR ולהעמיס על התרמו-סייקלר לאחר מכן, התחל את התוכנית ב-thermocycler. על מנת לאמת את המטרות של miR-125b, נחקרות רמות הביטוי של mRNAs מטרה של PARP-1 ו-p53.

מעניין שרמות הביטוי של mRNA PARP-1 ו-p53 גבוהות יחסית ל-mRNA של אקטין, שהוא הביקורת השלילית. בקרות שליליות אחרות ששימשו בניסוי אינן תבנית, ושלושה רצפים מקושקשים ביוטיניים ראשוניים. בנוסף, שלושת האזורים העיקריים הלא מתורגמים של PARP-1 ו-p53 שכמתו, מראים גם רמות שונות של הגברה.

זאת בהשוואה לבקרות השליליות, כגון אקטין, ללא תבנית, ושלושה רצפים מקושקשים ביוטיניים ראשוניים. הגברה זו של PARP-1 ו-p53 מצביעה על כך שמדובר במטרות חזקות של miR-125b תאי. לאחר שליטה, טכניקה זו מתחילה בציפוי התאים, לטרנספקציה של חיקויי ה-LNA המתויגים בביוטין ומסתיימת בניתוח ה-PCR יכולה להיעשות תוך שבוע, אם מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לאמת את מטרות ה-mRNA המשוערות בתאי יונקים. ניתן להשיג זאת עם יחס ספציפיות גבוה לרעש נמוך על ידי הכנסת שלושת חיקויי חומצות הגרעין הנעולים המתויגים בביוטין בתאי היונקים. אל תשכח שעבודה עם RNA, במיוחד RNA קטן, כגון מיקרו RNAs, יכולה להיות רגישה מאוד ונוטה להתפרקות.

לכן, יש לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת ביצוע בדיקה זו, כגון שימוש במים נטולי נוקלאז, צינורות מיקרופוגה נטולי נוקלאז ומאגרים סטריליים, ויש לשקול מאגרים וריאגנטים טריים שהוכנו בעת ביצוע בדיקה זו כדי לקבל רגישות טובה יותר ותוצאות טובות יותר.