ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד כמותית את נדידת התאים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ וידאו. זה מושג על ידי ציפוי תחילה של צלחת תרבית של שש בארות בקולגן, ולאחר מכן זריעה דלילה של התאים המעניינים על הצלחת המצופה. כשלב שני, נוצר פצע בצלחת באמצעות קצה פיפטה, מה שמבטיח מרחב מספיק לנדידה.

לאחר מכן, המיקרוסקופ מוגדר והתמונות מצולמות במרווחי זמן קבועים באמצעות מערכת בקרת טמפרטורה כדי לאפשר ניטור רציף של תאים נודדים בזמן אמת. בסופו של דבר, פרוטוקול מעקב החלקיקים משמש להערכת ההבדלים במהירות הממוצעת ובתזוזה הכוללת של תאי בדיקה ובקרה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בדיקת הגירה של תא נמנע, הוא שהיא אינה מבוססת על מדידות הגירה כמותיות של נקודות קצה ב.

במקום זאת, הוא מאפשר ניטור וחישוב פרמטרים שונים ברציפות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון כיצד גנים או תרופות מסוימים משפיעים על נדידת תאי הגידול? יומיים לפני ההליך יש להוסיף 1.5 מיליליטר קולגן מדולל במדיה אופטית לכל באר של צלחת תרבית של שש בארות, ולאחר מכן לדגור את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס יום אחד לפני ההליך.

השעו מחדש את התאים המעניינים בשני מיליליטר של DMEM בתוספת FBS לכל באר והעבירו את התאים לכל באר של צלחת הקולגן המצופה ENC, תוך דגירה של התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. ביום ההליך. השתמש בקצה פיפטה כדי ליצור פצע בתאים המתורבתים למשך הלילה ושטוף כל באר עם PBS כדי להסיר כל פסולת שנוצרה כתוצאה מהפצע.

הוסף DMEM בתוספת FBS לבארות השטופות ולאחר מכן בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שנוצר חלל פצע נקי. לאחר הפעלת מצלמת המיקרוסקופ ומנגנון הדמיית תאים חיים, מקם את הצלחת מעל שלב המיקרוסקופ. כסה את הצלחת בתא הבקרה הסביבתי החדש של התא החי, והגדר את התרמוסטט ל-37 מעלות צלזיוס ואת הפחמן הדו-חמצני ל-5%כעת פתח את תוכנת ספר השקופיות בשורת התפריטים.

בחר פקד מיקוד על-ידי לחיצה על לחצן F בתוך עיגול. בתיבת המטרה, השתמש בחלון הנפתח כדי להגדיר את המטרה בתיבת ערכת המסננים, בחר הגדרות כדי לכוון את נתיב האור לחתיכת I. בחר את המסנן המתאים עבור תאורת שדה בהיר ולאחר מכן לחץ על פתח בהיר.

כדי לפתוח את תריס השדה הבהיר. כעת בחר את מסנן השדה הבהיר בצריח וצפה בדגימה דרך העינית כדי למצוא את השדות המתאימים ולהביא את הדגימה למיקוד. לאחר מכן הזז את צריח המסנן כדי לשנות את נתיב האור למצלמה לצילום תמונה בתוכנת ספר השקופיות, לחץ על פקד המיקוד בחר XY כדי לבחור מיקומים שונים דרך החלק I ולאחר מכן לחץ על הגדר נקודה כדי לנעול בכל מיקום.

עבור לכידת תמונה, כוונן באופן ידני את המיקוד של תמונת המצלמה המוצגת על המסך, ולאחר מכן השתמש בכלים בחלון פקדי המיקוד כדי להתאים את מיקום Z של הבמה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, התמקדו בבליטות תאיות שטוחות ליד המגע עם הצלחת כדי לסייע במיקוד. השתמש במחוון כדי לכוונן את זמני החשיפה כך שיהיו בטווח מתאים למיקוד.

אם נבחרו מספר מיקומי XY, התאם את המיקוד עבור כל מיקום בנפרד על-ידי בחירת בקרת מיקוד. ואז xy, ואז ביקור נקודה. בחוברת השקופיות, בחר את גרפיקת המצלמה משורת התפריטים, בחר סוג לכידה ולאחר מכן קיטועי זמן כדי לבחור את משך הזמן עבור הניסוי.

מהתפריט הנפתח, הקלד את ההשהיה הרצויה בין תחילת נקודת זמן אחת לתחילת הבאה. בשדות מרווחי הזמן, השדה השלישי יחושב באופן אוטומטי מהערכים שהוזנו ידנית. תחת לכידת XY מרובה, בחר רשימה מרובת נקודות עבור ניסויים עם יותר ממיקום XY אחד.

לבסוף, תן שם לקובץ לשמירת הקובץ, עבור אל לכידת שליטה ובחר מתקדם, ולאחר מכן סליל. לאחר מכן לכוד בזיכרון ושמור בקובץ סליל לאחר כל נקודת זמן. התחל בלחיצה על התמונה.

בשורת התפריטים של ספר השקופיות, בחר ייבוא מהתפריט הנפתח ולאחר מכן לחץ על סליל ספר השקופיות. בחר את קבצי חוברת השקופיות הרצויים שנוצרו מניסוי ההעברה עבור שדות ונקודות זמן שונות. פתח את הקובץ הראשון, ולאחר מכן בחר מסכה בשורת התפריטים ובחר פרוטוקול מעקב אחר חלקיקים מהתפריט הנפתח.

בתפריט מעקב אחר חלקיקים, בחר פרוטוקול מעקב חלקיקים ידני. יופיע חלון עם נקודות זמן התחלה וסיום כדי לנתח העברה אקראית, בחר מסכה ולאחר מכן פרוטוקול מעקב אחר חלקיקים. שוב, לקביעת הקואורדינטות של מרכז העצם, בחרו 'מרכז האזור'.

לאחר מכן לחץ על מעקב והמשך. כעת בחר את הנתונים הסטטיסטיים הרצויים עבור כל נתיב כגון תזוזה ומהירות ממוצעת. כפי שמוצג כאן, לחץ על חשב כדי להציג את הנתונים הסטטיסטיים.

דוגמה לניתוח הגירה אקראית כפי שכומתה במונחים של מהירות מוצגת בתיבה זו. בגרף שפם, בניסוי זה, הייתה עלייה במהירות הממוצעת בתאי M-D-A-M-B 2 31 עם גן מדכא גידול שהופל. בהשוואה לתאי הבקרה M-D-A-M-B 2 31 כאן, נותחה הנדידה האקראית של התאים מהאיור הראשון במונחים של תזוזה של תאים.

שוב, לקבוצת הפלת הגן מדכא הגידול הייתה תזוזה מוגברת של תאים בהשוואה לקבוצת הביקורת M-D-A-M-B 2 31. תאים במיקרוסקופ וידאו זה בקרת סרט MDA MB 2 31 תאים ישבו על קולגן בן לילה. לאחר מכן התמונות צולמו במרווחי זמן של שעה אחת במשך 18 שעות בסך הכל במהלך נדידה אקראית.

שים לב כיצד התאים מתרחקים ממיקומם המקורי עם הזמן. בסרטון זה, תועדה ונותחה נדידת תאי M-D-A-M-B 2 31 לאחר זריעה של לילה על קולגן. שימו לב שתאי הבדיקה נודדים יותר בהשוואה לתאי הבקרה בסרט הקודם.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פלישת תאים ודינאות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, מה תפקידם של תאים בגרורות סרטניות לאחר התפתחותה? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור נדידת תאים באמצעות קווי תאים סרטניים מבודדים.