Name: מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: חקור מודל תרבית נוירונים אנושיים לחקר טאופתיות באמצעות הנדסה לנטיווירלית של טאו מוטנטי. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של רעילות הטאו וסינון תרופות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד ר פיטר דייויס במכללת אלברט איינשטיין לרפואה בגין אספקת הנוגדנים PHF-1 ו-CP13 ו ד ר מארק דיאמונד באוניברסיטת טקסס, בדרום-מערב, למתן מבנים של הטאו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של האגודה לאלצהיימר (נירנברג g-14-322164) כדי S.H.Y. ומהמכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית (TB1-01193) ליחסי ציבור

1. הכנת מדיה וריאגנטים
<ol><li>הפשרת ציפוי מטריצות של קרום המרתף ללוחות התרבות ב-4 ° צ' (אל תאפשר למטריצת הממברנה להתחמם או שהיא תפדה). הפוך את 1 mL ואחסן אותם ב-20 ° c או-70 ° c.</li>
	<li>מהווה מחדש את גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ בסיסי (bFGF) ב מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS) ב 10 μg/mL ולעשות 10 μL aliquots. אחסן אותם ב-4 ° c.</li>
	<li>לבקבוק חדש, לא נפתח, 500 mL של DMEM/F12 עם גלוטמין, להוסיף (10 מ ל), N2 (5 מ ל), ו פניצילין-סטרפטומיצין (5 mL). מקום 50 mL של תא גזע זה (המועצה לבטחון לאומי) מדיה בצינור חרוט ולהוסיף 10 μL של 10 μg/μL (2 μg/mL סופי) bFGF. אחסן את המדיה לבטחון לאומי (+) bFGF ב-4 ° c.</li>
	<li>כדי לבצע (-) bFGF מדיה, להשתמש באותו מתכון כפי שמתואר בשלב 1.3, אבל לא להוסיף bFGF. מדיה זו ישמש כדי להבדיל NSCs לנוירונים ולשמור על תרבויות עצבי לאחר בידול.</li>
</ol>2. בנייה ויראלית
הערה: לפני תחילת העבודה עם מבנים לנטינגיניים, ודא שהמעבדה אושרה להשתמש בסוכני רמת בטיחות 2 (BSL-2). יתר על כן, BSL-2 ביגוד תרבות, ציוד הגנה אישית (PPE), ושיטות השמטה יש להשתמש כאשר עובדים עם וקטורים לעדשה.
<ol><li>השגת מבנה הטאו הארוזה לתוך וירוס ממקור מועדף (ראו "סנדרס et al.10 " לבניית מידע).</li>
</ol>3. האדם מתאים גזע עצבי האנושי
הערה: NSCs הם בדרך כלל נזרע ב-100,000 – 150000 תאים/cm2 והNSCs המסחרי הזמין ביותר נמכרים כמו 1 x 106 תאים/בקבוקון. פרוטוקול זה הותאם במיוחד עבור 10 ס מ מנות תרבות התא (אם כי בגדלים אחרים של מנות ניתן להשתמש); לכן, אם בשימוש NSCs מסחרית, הNSCs עשוי להיות מורחב על ידי להיות מתורבת בגיל שש-היטב מנות על מנת לגרום מספיק תאים לזרעים 10 ס"מ מנות. פרוטוקול זה ניתן להתאמה לחילופין עבור מגוון רחב של מידות התרבות תאים (אבל זה לא מכיל הוראות passaging NSCs כמו פרוטוקולים אלה זמינים במקומות אחרים11,12).
<ol><li>
להכנת לוחיות התרבות התא, להסיר אחד סדרת מחלקים של מטריצה קפואה ממברנה ציפוי מטריקס עבור לוחות תרבות התא ולאפשר לו להפשיר ב 4 ° צ' (האליבטים ניתן למקם ב 4 ° c לילה ביום לפני התאים הם להיות הזרע). הוסף 385 μL של ציפוי מטריצה מרתף ממברנה 5 מ ל של DMEM/F12 מדיה + פניצילין-. הערה: 5 מ ל של dmem/F12 מדיה + פניצילין-הוא מספיק כדי מעיל אחד 10 ס מ צלחת (1 מ ל של המרתף הזה ממברנה ציפוי מטריצה מספיקה לעיל אחד טוב של מאכל שש-טוב). לחילופין, אם התאים הם להיות קבועים ומוכתם חיסוני, או מוכתם thioflavin, התרבות תאים על שמיכות זכוכית ב 24-היטב תרבות מנות.<ol>
<li>השאר את המדיה ואת ציפוי המטריקס קרים לפני ובזמן הוספתם למנות תרבות. הוסיפו את ציפוי מטריצת הממברנה למנות תרבות והניחו את המנות בחממה (ב37 ° c) במשך 1 h. לציפוי אופטימלי, לא מודתיאת מטריצת קרום המרתף עבור יותר או פחות מ 1 h. אחרי 1 שעות, משמסת את ציפוי מטריקס ממברנה מתוך מנות התרבויות תאים. ודא כי זה בסדר עם NSCs להיות מוכן להיות מצופה. הערה: אם התאים אינם מופשרים ממניות קפוא, לדלג על שלב 3.2 ולהמשיך עם שלב 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם התאים מופקרים ממניות המועצה לבטחון לאומי קפואים, לקחת בקבוקון של תאים קפואים ולחמם אותו באמבט מים מחומם 37 ° c על ידי הזזת הבקבוקון הלוך ושוב במים. לאחר הסדר, לרסס את המבחנה עם 70% אתנול ולמקם אותו לתוך המכסה התרבותי של התאים. העבר את התאים ~ 10 מ ל של Dמאמ/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין מדיה ו צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר ב 1,000 x g עבור 5 דקות. משלחים את התקשורת ומעבירים מחדש את התאים במדיה של המועצה לבטחון לאומי.</li>
	<li>דלל את התאים במדיית המועצה לבטחון לאומי כדי לקבל את צפיפות הזריעה המתאימה לכלי התרבות של התאים הנמצאים בשימוש. הערה: לדוגמה, אם NSCs מצופה על צלחת שש-היטב-אחת היטב על צלחת התרבות שש-היטב יש שטח שטח של 9 ס מ2-900,000 כדי 1,350,000 תאים נדרשים זרע. כך, בקבוקון אחד המכיל 1,000,000 תאים ניתן להשעות מחדש 2 מ ל של מדיה והוסיף לבאר אחת של שישה היטב צלחת.</li>
	<li>הוסף מספיק תאים הושעו בתקשורת המועצה לבטחון לאומי כדי לזרע את מנות המרתף מצופה מטריקס מלאי התרבות (100,000 תאים/cm2) ולשנות את המדיה בכל יום אחר (אם באמצעות מלאי קפוא, לשנות את התקשורת יום לאחר הציפוי ובכל יום אחר לאחר מכן). לגדל את התאים עד שהם 75% – 80% שוטפת. הערה: התאים צפויים להגיע 75% – 80% המפגש זמן קצר לאחר הציפוי, אבל זה עשוי להימשך זמן רב יותר אם מניות קפואות משמשות.</li>
	<li>לאחר שNSCs הינם 75% – 80%, התחילו בידול עצבי על-ידי הסרת המדיה ההמועצה לבטחון לאומי (+) bFGF והחלפתו במדיית המועצה לבטחון לאומי (-) bFGF. תרבות התאים במדיה זו (החלפת המדיה בכל יום אחר) למשך 4 שבועות לפחות. הערה: התאים ימשיכו להתחלק כמה ימים לאחר הנסיגה של bFGF; לפיכך, תאים עשויים להגיע ל-90-100% זרימה. לאחר culturing במשך 4 שבועות, התאים יהיו השיגו גורל עצבי יהיה מוכן לטיפול של הנגיף.</li>
</ol>4. התמרה ואחזקה של תרבויות נירואליות
<ol><li>כדי לשנות את הנוירונים עם וירוס, להשתמש בספירה סיכוייו של 3.4 x 105 יחידות הגלגול/תא (a 100% confluent 10 התבשיל ס"מ יכיל ~ 10,000,000 נוירונים). יש לדלל את היחידות הנוספות לריכוז הדרוש במדיית התרבות התאית ולהוסיפם לתאים (להשתמש בנפח המדיה הרגיל לצלחת תרבות התא). יומיים לאחר הוספת הווירוס, לשטוף את התאים 1x עם טרי (-) bFGF מדיה (ללא וירוס) ולהמשיך culturing ב (-) bFGF מדיה כרגיל.</li>
	<li>לטיפול פוסט-לנטינגיל, האכילו את הנוירונים באמצעות שינוי מדיה לתרבות התא ([-] bFGF מדיה) בכל יום אחר. שמור על התאים במשך ~ 8 שבועות לאחר התמרה. להמחיש באופן שגרתי את התאים תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח קיום. הערה: השבירה Sparseness או הדנדריטים הם סימנים כי התאים הם כבר לא קיימא.</li>
</ol>5. הדמיה של תאים
<ol><li>
הדמיה של תא חי
	<ol>
<li>לאחר התמרה (4 ימים לאחר התוספת של הנגיף), להתבונן אותות YFP תחת מיקרוסקופ פלורסנט המסוגל הדמיה בשידור חי. קחו את מנות התרבות הסלולרית אל מחוץ לחממה וודאו שבארות התרבות נשארות סטריליות על ידי שמירה על מכסה המטבח העליון. המחש את התאים באמצעות מטרה 10x עם אורך גל עירור של ~ 514 ננומטר ו מסנן פליטה של ~ 527 nm. הערה: אגרגטים נראים בדרך כלל בתרבויות תאים מותמרים 6 – 8 ימים לאחר היישום של הנגיף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תא קבוע צביעת (β-טובולין III תיוג ו thioflavin כתמים)
	<ol>
<li>כדי לתקן את התאים של פאראפורמלדהיד (בתוך הקופה), להסיר את התקשורת התרבותית מפני מתאי נוירונים גדלו על כיסוי זכוכית. לשטוף את התאים 1x עם PBS, להסיר את הכביסה, ולהוסיף 300 – 500 μL (אם באמצעות הצלחות 24-טוב) של 4% בתחתית (מדולל ב-PBS) כדי כיסוי עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את הה, ולשטוף את הכיסויים 2x עם PBS.</li>
		<li>הכנת פתרון חסימה המורכב של PBS, 3% בסרום שור (BSA), ו 0.3% טריטון X-100. הוסף 300 – 500 μL של הפתרון לבארות והדגירה את הכיסויים עבור 2 h ב 4 ° c. לאחר 2 h, לדלל נוגדנים ראשוניים (בריכוז נוגדן של 1:500) בפתרון חסימה ולהוסיף 300 – 500 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל טוב. מניחים את הצלחת על רציף נדנדה או מסתובב (במהירות נמוכה) לילה ב 4 ° c.</li>
		<li>למחרת, להסיר את הפתרון העיקרי נוגדן ולשטוף את 3x שמיכות עבור 5 דקות כל אחד עם PBS. לדלל נוגדנים משניים בפתרון מאגר חוסם (בריכוז של 1:1000) ולהוסיף פתרון נוגדן משני כל טוב. בחר את הנוגדן המשני המתאים באמצעות תג פלורסנט שאינו חופף לאות YFP (CY-3, לדוגמה). דגירה את התאים בטמפרטורת החדר עבור 2 על על הנדנדה או פלטפורמת מסתובבת. לאחר 2 h, להסיר את הפתרון נוגדן משני ולשטוף את 3x שמיכות עבור 10 דקות כל אחד עם PBS.</li>
		<li>שטוף את הכיסויים במים כפולים (DDW) עבור 10 דקות. הסר את DDW ולהוסיף 300 μL/טוב של 0.015% thioflavin-S מדולל ב 50% אתנול עבור 10 דקות. הסר את הפתרון thioflavin ולשטוף את שמיכות 2x עבור 4 דקות כל אחד עם 50% אתנול, ואחריו 1 4 דקות לשטוף עם 30% אתנול ושני שטיפת עבור 5 דקות כל אחד עם 30% אתנול. לשטוף את שמיכות 1x עם DDW לפני הרכבה. הערה: הצביעת העצמי המתואר בשלב 5.2.4 היא אופציונלית.</li>
		<li>כדי לטעון את הכיסויים לשקופיות זכוכית, הנח טיפה יחידה של מדיה המתקנת בצידו "+" של שקופית זכוכית. להסיר את כל הנוזל מן הבאר המכילה את שמיכות זכוכית, באמצעות מלקחיים עדינים, בזהירות להסיר את שמיכות זכוכית, שמירה על מסלול של איזה צד יש תאים מתורבתים.</li>
		<li>לחץ בעדינות על הקצה של הכיסויים כנגד Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת. עדיין מרתק את coverslip עם מלקחיים עדינים, לגעת בקצה (עם צד התא פונה לכיוון טיפת מדיה הרכבה) של coverslip למדיה הרכבה, ולאחר מכן, בעדינות למקם את coverslip על מדיה הרכבה (הצבת תאים מתורבתים לתוך הרכבה תקשורת וsandwiching אותם בין הכיסויים לבין שקופית הזכוכית). הניחו למדיה המתקנת להיות הבשלה למשך 30 דקות לפני ההדמיה. ניתן לאחסן את השקופיות ב-20 ° c לשימוש עתידי.</li>
		<li>התמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט ואת מגוון עירור/פליטה המתאים (YFP = ~ 514/527 ננומטר, CY-3 = ~ 555/568 nm, ו thioflavin S = ~ 390/426 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. שיטות אופציונליות
<ol><li>כל יומיים, לאסוף מדיה ממוזג מן התרבויות ולאחסן אותו ב-20 ° c לניתוח עתידי של מינים טאו שפורסמו על ידי תרבויות.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל בלתי מתורבת של טאונופתיה האנושית שמוצגים כסף-כתם חיובי אגרגטים ו thioflavin-חיובי נוירופיבריליאן סבך. יתר על כן, תאים התמרה להציג הפתולוגית המושרה טאו כגון פגמים מורפולוגיים, synaptogenesis מופחתת, ונפח ליסוזוממוגבר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק מודל נגיש וחסכוני של טאונופתיה עצבית, שניתן להשתמש בו ללימודי סינון סמים, כמו גם לניתוח רעילות של הטאו. מודל זה ממלא את הצורך החומרי במחקר ניווניות כמו קווי התאים של טאונופתיה אנושיים עדיין לא זמין באופן נרחב והשימוש של הטאו טרנסגניי...

צבירה פתולוגית של המיקרו-מחלות החלבון המקושר היא תכונה מוגדרת של הרבה במחלות ניווניות, כולל לספירה, דמנציה מתקדמת (ftd), מחלת ברים, ושיתוק מוחין גרעיני (PSP)1. במדינה שאינה חולה, מאוגד הטאו ומייצב את החוטים המיקרוסיבים העצביים ב-2. עם זאת, היפרזילציה הקשורים למחלות של הטאו מקדמת את צבירת הטאו, דיסוציאציה ממיקרוטובולים ורעילות עצבית3. ההשפעות הרעילות של הטאו הצבור עשוי להיות כרוך הפעלה חריגה של cholinergic4 ו glutamatergic קולטנים5 וכתוצאה מכך דיסתקנה של סידן תאיים ובסופו של דבר, מוות תאים. במודלים של בעלי חיים, הפחתת המוח המוחי משפרת את הפתולוגיה בעכברי לספירה6 ובדגמי העכבר של פגיעה מוחית טראומטית מתונה וחוזרת7.
ראיות הרכבה מעידות על כך שהמבנה והזיקה המחייבים של הטאו הנגזר מהעכבר נבדלים מטאו שנגזר על ידי האדם והעכבר טאו אינו מתאים לדוגמנות האדם tauopathies8. עם זאת, מודלים של תאי תאים אנושיים אינם זמינים מבחינה מסחרית. המטרה הכוללת של עבודה זו היא לתאר מודל בלתי מתורבת של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים המכילים מוטציה האדם בונה9. טאו הצבירה גרימת בנייה ויראלי מקודד לתחום החוזר של טאו מחסה P301L ו V337M מוטציות התמזגו כתבת YFP (טאו-RDLM-YFP) תוך שליטה בונה קוד עבור מסוג פראי (Wt) טאו לחזור התחום התמזגו לכתב YFP (טאו-Wt-YFP). התרבויות הנוירואליות משדיקות בשיטה זו מבטאות כתשע פעמים יותר טאו מאשר תרבויות שאינן מנתמרים. למרות שכמות הביטוי של הטאו מתבטאת במידה רבה בין התאים של טאו-RDLM-YFP-ובין טאו-אווט-יfp, רק נוירונים מותמרים ביחידות התצוגה של הטאו-RDLM. התרבויות התמרה את האור בעזרת טאו-rdlm-yfp באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג הנחות באורך סיבי וצפיפות סינפטית. לכן, המודל התאי הזה עשוי להיות כלי שימושי לחקר הצבירה של הטאו בתוך מבחנה.

<table><tbody><tr><td>צלחות תרבית 10 ס"מ</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות תרבית באר</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול בבקבוק</td> <td>ריסוסמקורות שונים</td> תוסף <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנת הבסיס (מטריג'ל)</td><td>קורנינג</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>בסיסי FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 מדיה תרבית עם גלוטמין</td><td>תרמופישר</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (ריכוז 50% ומעלה)</td> <td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים המסומנים באופן פלואורסצנטי</td><td>מקורות שונים, תלוי ניסוי</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע עצביים אנושיים</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>וקטורים לנטיוויראלים</td><td>מקורות שונים</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>מדיה הרכבה</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים</td><td>מקורות שונים, תלוי ניסוי</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה או פלטפורמה מסתובבת</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע</td> <td>תרבית תאים סטרילימקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>מקורות שונים</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

צבירה חריגה של החלבון טאו מעורב באופן פתולוגי במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD). למרות שדגמי העכבר של טאונופתיה סיפקו משאב בעל ערך לחקירת מנגנוני הנוירורעילים של האוניברסיטה הנצברת, הוא הופך להיות יותר ויותר ברור כי, בשל הבדלים בין מינים נוירופיזיולוגיה, המוח בעכבר אינו מתאים ל מידול המצב האנושי. ההתקדמות בשיטות תרבות התאים הפכו את התרבויות העצבי האנושיות לנגישות לשימוש ניסיוני בתחום החוץ וסייעו בפיתוח הneurotherapeutics. עם זאת, למרות ההסתגלות של תרבויות התאים הנוירואליות האנושית, במודלים של מבחנה של הטאופתיה האנושית עדיין אינם זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה מתאר את המודל התאי של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים מהאנטי-ויראליות הקוד עבור מוטציה בפתוניים התמזגו לכתב חלבון פלורסנט צהוב (YFP). תרבויות התמרה לייצר אגרגטים טאו הכתם באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג סמנים של רעילות נוירולית, כגון אורך האקסון הופחת ונפח ליסוזומגדל. הליך זה עשוי להיות מודל שימושי וחסכוני ללימוד tauopathies אנושיים.

טאו-RDLM-YFP-התמרה הנוירונים הייתה מתוייגת בעזרת YFP, ו RDLM-התמרה תרבויות הציג אגרגטים לאחר התמרה. אלה הכללות מוכתם חיובי עבור thioflavin (איור 1). כפי שאיור 1 ממחיש, פרוטוקול זה מייצר תרבויות נוירואליות המציגות את האגרגטים החיוביים של הטאו. עבור ניסויים ראשוניים, מומלץ כי בידול עצבי הוא אישר על ידי אימונויניום לסמן את העצב הספציפי β-טובולין III בתרבויות. חשוב מכך, פלואור מתויג באמצעות נוגדנים משניים צריך להיות הספקטרום עירור/פליטה כי אינו חופף עם זה של YPF (Cy...

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

בפרוטוקול זה אנו מפרטים מודל במבחנה של טאופתיה אנושית. שיטה זו ממלאת צורך בחומרים אשר עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תרופות מחקרים מנגנון המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי פרדיגמת תרבות התא מאפשר הערכה מהירה יותר של רעילות טאו וטיפולי טאו פוטנציאליים בהשוואה למחקרים בבעלי חיים כדי להתחיל בהליך זה להפשיר את ציפוי מטריצת קרום המרתף עבור צלחות תרבות בארבע מעלות צלזיוס.הפוך aliquots מיליליטר ולאחסן אותם במינוס 20 או מינוס 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש את גורם הגדילה fibroblast הבסיסי PBS סטרילי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. הפוך 10 microliter aliquots ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן קבעו בקבוק חדש של DMEM-F12 שלא נפתח ב-500 מיליליטר עם גלוטמין. הוסף 10 מיליליטר של B27, חמישה מיליליטר של N2, וחמישה מיליליטר של פניצילין-סטרפטומיצין כדי להכין מדיה תאי גזע עצביים. מניחים 50 מיליליטר של התקשורת של המל"ל לתוך צינור חרוט, ולהוסיף 10 microliters של bFGF מוכן.אחסן את המל"ל הזה בתוספת מדיה bFGF בארבע מעלות צלזיוס. ראשית, להסיר aliquot של ציפוי מטריצת קרום מרתף קפוא עבור צלחות תרבות התא מהמקפיא וזה מאפשר להפשיר בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 385 מיקרוליטרים של ציפוי מטריצת קרום המרתף המופשר לחמישה מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.אם תאים מופשרים מהמלאי הקפוא של המל"ל, קחו בקבוקון של תאים קפואים מהמקפיא וחממו אותו באמבט מים מחומם ל-37 מעלות צלזיוס על ידי הזזת הבקבוקון קדימה ואחורה במים. לאחר מכן, לרסס את הבקבוקון עם 70% אתנול. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע של תאים, העבר את התאים לכ-10 מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 1, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים בתקשורת המל"ל. לדלל את התאים בתקשורת המל"ל כדי להשיג את צפיפות הזריעה המתאימה עבור כלי תרבות התאים המשמש.הוסף מספיק תאים תלויים בתקשורת המל"ל כדי לזרוע את מטריצת קרום המרתף מצופה מנות תרבות. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני עד שהם 75 עד 80% confluent, הקפד לשנות את התקשורת כל יומיים. כדי לשנות נוירונים עם lentivirus, השתמש בספירת טיטר של 340, 000 יחידות מתמשלות לכל תא.לדלל את היחידות מתמר במדיה תרבות התא לריכוז הדרוש, ולהוסיף אותם לתאים. יומיים לאחר הוספת lentivirus, לשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה טרייה שאינה מכילה bFGF. המשך culturing התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במדיה ללא bFGF.לשמור על התאים במשך כשמונה שבועות לאחר ההתמרה, הקפד לשנות את המדיה תרבות התא כל יומיים. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לדמיין את התאים באופן שגרתי ולהבטיח את הכדאיות. לאחר ההעתקה, להסיר את מנות התרבות מן החממה הקפד לשמור על המכסה עליהם כדי לשמור על התרבות סטרילית היטב.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל להדמיית תאים חיים כדי לדמיין את התאים תחת מטרה של פי 10 עם גירוי של 514 ננומטר ומסנן פליטה של 527 ננומטר. במחקר זה נוירונים מתומרים עם טאו-RDLM-YFP lentivirus מתויגים באופן פלואורסצנטי עם YFP. תרבויות שעברו התמרה של RDLM מוצגות כדי להציג אגרגטים לאחר ההתמרה.תכלילים אלה כתם חיובי עבור thioflavin. דידול עצבי מאושר על ידי immunolabeling של הסמן הספציפי לנוירונים בטא-tubulin III בתרבויות. חשוב לזכור כי נוגדנים משניים מתויגים באופן פלואורסצנטי צריכים להיות ספקטרום פליטת עירור שאינו חופף לזה של YFP.למרות אגרגטים טאו פלואורסצנטי צהוב יהיה גלוי בהיעדר כתמים, thioflavin צריך לשמש גם להדמיה על מנת לאשר כי האות פלואורסצנטי הוא טאו מצרפי ולא פסולת הסלולר. לאחר הדור של תאים מדכאים יתר על כן טאו, ניתן לבצע מספר הערכות של בריאות עצבית וצבירת טאו. לדוגמה, מצאנו כי תאים אלה מציגים ניוון אקסונאלי.בנוסף למחקרים על תרבות התאים, השתמשנו בשיטה זו כדי לבחון את הפתוגניות של טאו שמקורו באקסוזומלית.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מציג בדיקה מבוססת תאים המכמתת את ספיגת טאו על ידי מיקרוגליה מורין באמצעות אגרגטים טאו רגישים ל-pH המסומנים בפלואורסצנטיים, המנותחים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות לצורך הערכה כמותית.

בדיקה מבוססת תאים להערכת ספיגת חלבון טאו על ידי מיקרוגליה

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתמיין לנוירונים על ידי העברתם עם לנטי-וירוסים מהונדסים הנושאים גן גורם שעתוק נוירוגני תחת שליטה של אלמנט מגיב טטרציקלין, ולאחר מכן טיפול בנגזרת טטרציקלין ומדיום התבגרות.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

סרטון זה מדגים את תהליך התמרת תאי עצב אנושיים עם נגיף לנטי המקודד חלבון טאו אנושי מוטנטי המתויג בחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לחקור צבירת חלבונים. הוא מתאר את השלבים מכניסה ויראלית לביטוי טאו מוטנטי, ומגיע לשיאו בהיווצרות אגרגטים ציטופלזמיים גלויים בתאי העצב.

התמרה מתווכת לנטיוויראלית של נוירונים אנושיים לניתוח צבירת חלבון טאו

חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ההתקדמות של מחלת אלצהיימר.

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

וזמינותו צבירת טאו תיאר כתב יד זה מחקה את התכונות הצפויה של ויוו misfolding טאו צבירה.

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

כאן נתאר וזמינותו מבוססת תא להעריך באופן כמותי את ספיגת טאו מאת מיקרוגלייה עם המטרה של יצירת כלי לניסויים קליניים כדי לאפיין טוב יותר את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-טאו.

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

חקור מודל תרבית נוירונים אנושיים לחקר טאופתיות באמצעות הנדסה לנטיווירלית של טאו מוטנטי. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של רעילות הטאו וסינון תרופות פוטנציאליות.

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

גלה סרטונים נוספים