מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

בפרוטוקול זה אנו מפרטים מודל במבחנה של טאופתיה אנושית. שיטה זו ממלאת צורך בחומרים אשר עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תרופות מחקרים מנגנון המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי פרדיגמת תרבות התא מאפשר הערכה מהירה יותר של רעילות טאו וטיפולי טאו פוטנציאליים בהשוואה למחקרים בבעלי חיים כדי להתחיל בהליך זה להפשיר את ציפוי מטריצת קרום המרתף עבור צלחות תרבות בארבע מעלות צלזיוס.

הפוך aliquots מיליליטר ולאחסן אותם במינוס 20 או מינוס 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש את גורם הגדילה fibroblast הבסיסי PBS סטרילי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. הפוך 10 microliter aliquots ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן קבעו בקבוק חדש של DMEM-F12 שלא נפתח ב-500 מיליליטר עם גלוטמין. הוסף 10 מיליליטר של B27, חמישה מיליליטר של N2, וחמישה מיליליטר של פניצילין-סטרפטומיצין כדי להכין מדיה תאי גזע עצביים. מניחים 50 מיליליטר של התקשורת של המל"ל לתוך צינור חרוט, ולהוסיף 10 microliters של bFGF מוכן.

אחסן את המל"ל הזה בתוספת מדיה bFGF בארבע מעלות צלזיוס. ראשית, להסיר aliquot של ציפוי מטריצת קרום מרתף קפוא עבור צלחות תרבות התא מהמקפיא וזה מאפשר להפשיר בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 385 מיקרוליטרים של ציפוי מטריצת קרום המרתף המופשר לחמישה מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.

אם תאים מופשרים מהמלאי הקפוא של המל"ל, קחו בקבוקון של תאים קפואים מהמקפיא וחממו אותו באמבט מים מחומם ל-37 מעלות צלזיוס על ידי הזזת הבקבוקון קדימה ואחורה במים. לאחר מכן, לרסס את הבקבוקון עם 70% אתנול. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע של תאים, העבר את התאים לכ-10 מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.

צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 1, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים בתקשורת המל"ל. לדלל את התאים בתקשורת המל"ל כדי להשיג את צפיפות הזריעה המתאימה עבור כלי תרבות התאים המשמש.

הוסף מספיק תאים תלויים בתקשורת המל"ל כדי לזרוע את מטריצת קרום המרתף מצופה מנות תרבות. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני עד שהם 75 עד 80% confluent, הקפד לשנות את התקשורת כל יומיים. כדי לשנות נוירונים עם lentivirus, השתמש בספירת טיטר של 340, 000 יחידות מתמשלות לכל תא.

לדלל את היחידות מתמר במדיה תרבות התא לריכוז הדרוש, ולהוסיף אותם לתאים. יומיים לאחר הוספת lentivirus, לשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה טרייה שאינה מכילה bFGF. המשך culturing התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במדיה ללא bFGF.

לשמור על התאים במשך כשמונה שבועות לאחר ההתמרה, הקפד לשנות את המדיה תרבות התא כל יומיים. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לדמיין את התאים באופן שגרתי ולהבטיח את הכדאיות. לאחר ההעתקה, להסיר את מנות התרבות מן החממה הקפד לשמור על המכסה עליהם כדי לשמור על התרבות סטרילית היטב.

השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל להדמיית תאים חיים כדי לדמיין את התאים תחת מטרה של פי 10 עם גירוי של 514 ננומטר ומסנן פליטה של 527 ננומטר. במחקר זה נוירונים מתומרים עם טאו-RDLM-YFP lentivirus מתויגים באופן פלואורסצנטי עם YFP. תרבויות שעברו התמרה של RDLM מוצגות כדי להציג אגרגטים לאחר ההתמרה.

תכלילים אלה כתם חיובי עבור thioflavin. דידול עצבי מאושר על ידי immunolabeling של הסמן הספציפי לנוירונים בטא-tubulin III בתרבויות. חשוב לזכור כי נוגדנים משניים מתויגים באופן פלואורסצנטי צריכים להיות ספקטרום פליטת עירור שאינו חופף לזה של YFP.

למרות אגרגטים טאו פלואורסצנטי צהוב יהיה גלוי בהיעדר כתמים, thioflavin צריך לשמש גם להדמיה על מנת לאשר כי האות פלואורסצנטי הוא טאו מצרפי ולא פסולת הסלולר. לאחר הדור של תאים מדכאים יתר על כן טאו, ניתן לבצע מספר הערכות של בריאות עצבית וצבירת טאו. לדוגמה, מצאנו כי תאים אלה מציגים ניוון אקסונאלי.

בנוסף למחקרים על תרבות התאים, השתמשנו בשיטה זו כדי לבחון את הפתוגניות של טאו שמקורו באקסוזומלית.