הכנה ואפיון ננו-פוטזומים לצורך מלכודת הידרופיזיאליות של חלבונים ביולוגיים

מחקר זה מתאר לחות קלאסית באמצעות שיטת הסרט דק השומנים לקראת nanoliposome סוימים ואחריו ננו-חלקיק אפיון. 47 kDa-hydrophilic וחלבון כדורי, טארין, הוא כיום בהצלחה כאסטרטגיה כדי לשפר את היציבות, להימנע הרשאה מהירה, ולקדם שחרור מבוקר. ניתן להתאים את השיטה לעטיפת מולקולות הידרופובי.

הכנת nanocapsules liposomal על ידי טכניקת שולט יבוצע צעד אחר צעד במלכוד של טארין 48 קילודלטונים כדורי בחלבון הידרופילי מטוהרים קולוקסיה esculenta יוכח. כל ההליכים לאפיון הננו-קאפ כוללים את מיקרוסקופ האלקטרונים הסריקה וגם פיזור האור הדינמי יבוצעו. הליכי כיסה יכולים להתמודד עם כמה אתגרים מן הבחירה שומנים להישג של אנקפסולציה יעילות גבוהה, שמירה על הפעילות הביולוגית של מולקולות לכודים.

פרוטוקול שיתואר יכול להתגבר על חלק מקשיים אלה. שקלו את רכיבי ליפוזום באמצעות איזון אנליטי. ממיסים את רכיבי השומנים בכלורופורם באמצעות בקבוקון נפחי שמתאים לאידוי סיבובי כדי למנוע אובדן חומר.

מערבבים את התערובת ב 150 סל"ד במשך 15 דקות. הסר את הכלורופורם באמצעות מאייד סיבובי. כווננו את פי הבקבוקים הנפחי למיקום הסטנדרטי ליעילות מיטבית, תוך מגע עם המים מהאמבטיה לחימום.

הגדר את הפרמטרים בהתאם לפרוטוקול המתואר. לאחר כ 25 דקות, להסיר את הבקבוק, ולהשליך את הממס התאדה כראוי. נוצר סרט דק ואטום ונוצר בקלות.

לחות את הסרט השומנים בתתבת אמוניום גופרתי המכיל טרנטין במיליגרם אחד למיליליטר. מערבבים את התערובת במשך 40 דקות ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, sonicate ההשעיה לדקה אחת ב 25 מעלות צלזיוס, טמפרטורת החדר.

כדי להקטין את גודל הצמחייה ולהימנע מצבור, מניחים את קרום הפוליקרבונט בין שתי תמיכות מסנן רטובות מראש ומציבים אותו במחזיק. הכנס מזרק ריק אחד לתוך המכשיר, למלא את השני עם מיליליטר אחד של ההשעיה liposomal, ולהכניס אותו בצד הנגדי. בצע שבלט 12 מחזור דרך קרום נקבובית פוליקרבונט 2 מיקרומטר.

דחוף את הדגימה ממזרק אחד לאחר לאט. בסופו של דבר, ההשעיה ליפוזומלית צריכה להיות ברורה במהלך תהליך הטיול, כתוצאה מהפחתת גודל. כ 2 מיליליטר של המדגם יכול ללכת לאיבוד במהלך שלב זה.

להפריד את ליפוזומים על ידי אולטרהצנטריפוגציה. ראשית, לשקול את הדגימה לתוך צינור טיטניום ולאזן את הצינורות. בדוק את הנפח המינימלי שיש למלא, וב במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול עם אמוניום סולפט.

התאם את צינורות הטיטניום לתוך דלי הנדנדה. פתח את דלת הצנטריפוגה והצב את הרוטור בפנים. סגרו את דלת הצנטריפוגה, לחצו על ואקום והמתינו עד שהוואקום יגיע מ-200 לפחות מ-20 מיקרון.

התאם את הפרמטרים בתצוגה האולטרה-מרכזית. לחץ על אחזור, בדוק את התנאים והתחל את הריצה. לאחר 90 דקות, לשחרר את הוואקום על ידי לחיצה על כפתור ואקום ולפתוח את דלת הצנטריפוגה.

הסר את הרוטור מבפנים. שמור על דגימת אולטרהצנטריפוגה על קרח ולאחר מכן להפריד את supernatant מן גלולה, על ידי הפיכת הצינור במהופך, לתוך צנטריפוגה חד פעמית 59 מיל להפריד את העל טבעי מן גלולה. לאחסן את supernatant המכיל את החלבון unencapsulated בארבע מעלות צלזיוס.

זה ישמש כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה. גלולה מוצגת כמו ג'לי שקוף. להשעות את גלולה וחום HEPES אגירה תמיסת מלח.

נא בדוק את הפרוטוקול לקבלת מידע נוסף. לקבוע את יעילות אנקפסולציה על ידי הפרוטוקול של פיטרסון, על מנת למנוע הפרעות שומנים כימות חלבון. יש לנתח דגימות ב- triplicate.

בצינור microfuge, לדלל את על טבעי lipsomal או BSA במיליגרם אחד למיליליטר עם מים לנפח סופי של מיליליטר אחד. מוסיפים DOC ודגירה במשך 10 דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של 72% TCA ומערבבים היטב.

צנטריפוגה ב 3, 000 גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להשליך את supernatant על ידי היפוך הצינור כלפי מטה, הנחת אותו על נייר סופג ולתת לו להתייבש. להשעות את גלולה במיליליטר אחד של מים.

מערבבים היטב כדי לוודא שהכדור מומס. לאחר מכן, להעביר את הדגימה למבחנות. מוסיפים מיליליטר אחד של רריג'נט A, מערבבים ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

מוסיפים 5 מיליליטר של רריג'נט B, מערבבים ו דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. לקבוע את הספיגה ב 750 ננומטר ולחשב את יעילות אנקפסולציה. ממוצע הגודל והתפלגות הגודל נקבעים על-ידי פיזור אור דינמי.

מעבירים את הננו-חלקיקים השפתיים לקוראט גודל חד פעמי. התאם את הכובטה לתוך הציוד. הגדר את פרמטרי הציוד.

לקביעת יציבות, יש לאחסן את הליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס ולבדוק את התפלגות הגודל ואת ממוצע הגודל באופן קבוע. אפיון ליפוזום על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מתבצע על פי מורטה ו Ramasamy ב טריליקט. תקן את החלקות כיסוי הזכוכית בתחתית צלחת פטרי עם קלטת.

מעיל את החלקות הכיסוי עם פולי-ל-לינזין. מניחים נייר סינון רטוב בתוך צלחת פטרי כדי לשמור על לחות דגירה במשך שעה אחת. יש לשטוף במים מזוקקים.

מוסיפים טיפה מהדגימה ומאפשרים לה להתייבש במשך שעה, בטמפרטורת החדר. כדי לתקן את הדגימות, לכסות אותם עם glutaraldehyde, מוכן במאגר פוספט. מניחים ניירות סינון רטובים בתוך צלחת פטרי.

חשוב לאטום את צלחת פטרי. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. שוטפים את הכיסוי שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, עם אותו מאגר פוספט.

לייבש את הדגימות כדלקמן על ידי כביסה בתת פתרון ריכוז אתנול הגדלת מ 35% לאתנול מוחלט. כימית לייבש את הדגימות עם hexamethyldisilazane במשך 10 דקות. הקסמתילדיסילאזאן צריך להיות מניפולציה בזהירות בתוך מכסה המנוע אדים.

יש לאפשר לדגימות להתייבש בן לילה בתוך מייבש או בתוך מכסה המנוע של האדים בטמפרטורת החדר. הר את הדגימות המיובשת על ספח, עם סרט דבק מוליך פחמן. סוטר את הדגמים בזהב.

הקלט תמונות SEM עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, SEM, במצב ואקום נמוך ומתח נמוך, 20 קילו-וולט. איור אחד מתאר את הכנת ליפוזום ננו. פוספוליפידים, סמים, יתד, כימים, המרכיבים העיקריים ליפוזום, היו מומסים לראשונה כלורופורם כדי להשיג את הסרט השומנים.

סרט השומנים היה אז rehydrated במאגר מלוחים, המכיל את החלבון הידרופילי, tarin, להיות entrapt, ואת הדגירה צריך להיות preformed בן לילה. לאחר מכן, sonication ו שחול מוחלים כדי ליצור וריים יונימלריים קטנים. שלב האולטרה-צנטריפוגה מפריד בין הכנה ליפוזומלית לבין שומנים חופשיים, וחלבון לא מכווץ.

בעוד העל-טבעי משמש לקביעת יעילות המלכודת. ננו-ליפוזומים המיוצרים באמצעות המתודולוגיה הנ"ל מציגים התפלגות גודל הנעה בין 51 ל-396 ננומטר, וגודל ממוצע של 155 ננומטר. ההכנה היא הומוגנית, שכן מדד הפולידיספרסיות הוא של 168.

יעילות מלכודת גבוהה של 83% הוא הגיע אם ליפוזומים מובלטים דרך קרום בגודל נקבובית 2 מיקרומטר. מאפייני ננו-ליפוזום מורפולוגיים הוערכו על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. ליפוזומים יש סוף סוף מטופלים באופן דומה לתאים חיים, כדי לקבל תמונות באיכות טובה יותר.

הליכי קיבוע וייבוש חשובים כדי להבטיח הדמיה של יבלות שלמות קטנות יותר התומכות ביותר מ-20 קילו-וולט בתנאי ואקום. איורים 2A ו- 2B מציגים יבלות ליפוזומליות עגולות בטווח של 121 ננומטר, שנותחו ב- 20 קילו-וולט. בעוד שנתונים 2C ו- 2D, הצג דגימות שהוכנו כראוי.

דגימות שעברו התעללות מותרות רק לתצפית על וריכים גדולים יותר או פגומים, אשר אינם יכולים לעמוד בתנאי ואקום או מתח. פרוטוקול המתואר, כאן ב, מותר לייצור של וריונים להתרבות המציגים צורה עגולה, משטח קטן, וגודל ממוצע של כ 150 ננומטר. השיטה יכולה לשמש כדי ללכוד מולקולות מורכבות וגדולות, כמו חלבון tetrameric, המציג מתקן הידרופילי.

מלכוד עצמי לקוי גבוה מ-80% וקצב הדליפה נמוך מאוד, נחות מ-1.5% כאשר הננו-קפסול מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס. אנו מקווים כי וידאו זה יעזור לך אנקפסולציה של מולקולות גדולות, כגון טרי.