העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית
9 בנובמבר 2019
מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.
פעמונים אלקטרוניים מכיוון שמאקרופאגים מתמחים בזיהוי מולקולות ממקור לא עצמי, קשה במיוחד לשנות אותן. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר החלפה יעילה ביותר של מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלסמידים. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא כי שיעורי transfection גבוהים מושגים בהיעדר כל cytotoxicity לזיהוי או אימונוגניות.
הדגמת ההליך תהיה מארק הרב פוסט-דוק מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפשרת כל הרכיבים של ערכת שעתוק RNA. Vortex reagents במשך חמש שניות ולסובב אותם למטה במשך שתי שניות ב 2, 000 פעמים g, ואז לשמור אותם על קרח עד השימוש.
הכן את תגובת שעתוק RNA במבחנה בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיקרוליטר בהתאם לכיווני כתב היד. מערבולת הצינור ולסובב אותו. ואז להדק אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תוך ערבוב ב 400 סל"ד על מערבל תרמי.
לאחר הדגירה, להוסיף שני microliters של DNase אני ישירות לתוך תערובת התגובה. מערבולת ולסובב את הצינור למטה, ולהדרור אותו במיקסר התרמי במשך 15 דקות נוספות. שמרו על אליקוט שני מיקרוליטר של המוצר שטופל בדנ"א לג'ל הבקרה ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לזנב פוליA, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חיץ תגובת פולימראז פולימראז 10X וחמישה מיקרוליטרים של פולימראז פוליA לתגובה שטופלה בדנ"א. מערבולת ולסובב את התערובת. ואז להדרגר אותו במיקסר התרמי במשך 30 דקות.
כאשר התגובה הושלמה, לקחת aliquot שני microliter עבור ג'ל הבקרה ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. הוסף 5-reagents dephosphorylation 5-פריים ישירות למוצר זנב polyA על פי הוראות כתב היד. מערבולת ולסובב במורד הצינור, ולהדרגר אותו במיקסר התרמי במשך 30 דקות נוספות.
בצע את תגובת dephosphorylation עם דגירה של שתי דקות ב 80 מעלות צלזיוס על מנת לחמם לנטרל את הפוספטזה האנטארקטית. לאחר מכן לטהר את mRNA מועתק במבחנה באמצעות ערכת טיהור RNA ייעודית. למדוד את הריכוז והטוהר של mRNA אלוט עם ספקטרופוטומטר microvolume.
הפעל ג'ל אגרוז denaturing עם aliquots שנאספו בעבר כדי לאמת את נוכחותו של מוצר יחיד, אורך תעתיק נכון, וזנב polyA. היכונו לתרגום רוחבי על-ידי הוספת אמצעי האחסון המחושב מראש של מאגר ההמרה mRNA פחות אמצעי האחסון של ריאגנט ה-mRNA וה-mRNA לצינור תגובה. מפשירים את מלאי ה-mRNA ומערבבים אותו בעדינות על ידי היפוך הצינור.
לאחר מכן הוסיפו את הנפח המחושב מראש של mRNA לצינור התגובה. Vortex ולסובב את תערובת התגובה ואת ריאגנט transfection mRNA, ולאחר מכן להוסיף את הנפח המתאים של ריאגנט transfection mRNA לצינור תערובת התגובה. מערבולת הצינור ולסובב אותו.
ואז לה הדגירה אותו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. בינתיים, החלף את מדיום התרבות של המקרופאגים במדיום תרבות חם ורענן. לאחר הדגירה של תערובת transfection הושלמה, מוסיפים את התערובת לפלטות המכילות את המקרופאגים dropwise ובעיגול מבחוץ לאמצע הבאר.
כדי להבטיח חלוקה אחידה של transfection לערבב בעדינות רוק הצלחת בכיוון אנכי ואופקי. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לפחות שש שעות. לאחר הדגירה, לנתח יעילות transfection עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריה זרימה או immunoblot.
החלק החשוב ביותר של הליך זה הוא להבטיח הפצה אחידה של תערובת transfection כך שכל המקרופאגים ליצור קשר עם אותה כמות של mRNA. פרוטוקול זה שימש בהצלחה ליצירת גרסאות NEMO ו- IKK-beta עם קידוד mRNA עבור חילוף של מקרופאגים ראשיים. גודל נכון וזנב polyA של mRNA אומת על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose.
יעילות Transfection אושרה על ידי יצירת mRNA קידוד GFP וביצוע ניתוח ציטומטריה זרימה. שיעור ההדבקה גדל יחד עם כמות mRNA מנופל, והגיע 50 עד 65% עבור PM ו 80 עד 85% עבור BMDM. הן PM והן BMDM, רמת הביטוי של EGFP בתאים מומרים גדלה בזמן ובאופן תלוי מינון.
חשוב לציין, ניתוח של propidium יודיד חיובי או נספח V חיובי מקרופאגים אישרו כי הליך transfection לא לגרום למות תאים ליטיק או apoptotic. יעילות Transfection של mRNAs קידוד גרסאות נמו מתויגות בדגל או IKK-בטא נותחו עם מיקרוסקופיה immunofluorescence. התעריפים היו כ-60% עבור נמו mRNAs ו-55% עבור MRNAs של IKK-beta.
פרוטוקול זה שימש גם ליצירת קידוד mRNA Cre recombinase. Transfection של 400, 000 BMDM עם 400 ננוגרם של Cre recombinase mRNA הביא דלדול כמעט מוחלט של חלבון נמו לאחר 48 שעות, המציין transfection יעיל מאוד. היעדר כמויות ניתנות לגילוי של אינטרלוקין 1 בטא, אינטרלוקין-6 וגורם נמק הגידול מצביעים על כך שהליך ההשתנות אינו מפעיל איתות פרו דלקתי.
השיטה הפשוטה יחסית שלנו מאפשרת סוף סוף לבטא ביעילות חלבונים שעברו מוטציה או מתויגים במקרופאגים ראשוניים. זה יקדם באופן משמעותי את הניתוח של פונקציות מקרופאג ברמה המולקולרית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לטרנספקציה יעילה מאוד של מקרופאגים ראשוניים של עכברים, כולל מקרופאגים פריטוניים (PM) ומקרופאגים המופקים ממחולל גרמיים (BMDM), תוך שימוש ב-mRNA שהותמיר במבחנה (in vitro) מתבניות DNA כגון פלסמידים. השיטה מאפשרת להגיע לשיעורי טרנספקציה גבוהים ללא השראת ציטוטוקסיות או אימונוגניות, ובכך היא מתגברת על האתגרים המערבים קולטני זיהוי תבניות (PRRs) במקרופאגים, אשר בדרך כלל מעכבים הובלה של חומצות גרעיניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- מקרופגים הם תאי מערכת חיסון פגוציטיים המצוידים ב-PRRs לזיהוי מולקולות שאינן עצמיות.
- קולטנים אלו מקשים על ביצוע טרנספקציה למקרופגים, מכיוון שהם מזהים ומגיבים לחומצות גרעיניות זרות ולסוכני טרנספקציה.
- טרנספקציה מובילה לעיתים קרובות להפעלת מקרופגים, לפירוק חומצות גרעיניות או למות תאים.
- דרושות שיטות טרנספקציה יעילות שאינן אימונוגניות לצורך מחקרים מולקולריים במקרופגים ראשוניים.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיאור של פרוטוקול לטרנספקציה יעילה של mRNA במקפגים ראשוניים של עכברים.
- השגת שיעורי טרנספקציה גבוהים ללא השפעות ציטוטוקסיות או אימונוגניות.
- מתן אפשרות לביטוי של חלבונים מוטגנים או מתויגים לצורך מחקרים פונקציונליים במקפגים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שעתוק in vitro של mRNA מתבניות DNA (למשל, פלסמידים), כולל שלבי הוספת זנב polyA ודה-פוספורילציה.
- טיהור והערכת איכות של mRNA באמצעות ספקטרופוטומטריה ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז דנטורטיבי.
- הכנת קומפלקסים של mRNA עם ריאגנט טרנספקציה והוספה זהירה למקרופאגים מתורגבים.
- הערכת יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריה של זרימה ו-immunoblotting.
תוצאות עיקריות
- הושגו שיעורי טרנספקציה של 50–65% עבור PM ו-80–85% עבור BMDM.
- ביטוי של EGFP בתאים שעברו טרנספקציה היה תלוי בזמן ובמינון.
- לא נצפתה עדות למות תאים ליטי או אפו anyone-ptotic (בבדיקות propidium iodide ו-Annexin V).
- לא זוהתה השראה של ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β, IL-6, TNF), מה שמעיד על היעדר אימונוגניות.
- הודגם ביטוי יעיל של NEMO עם תג FLAG, IKK-beta ו-Cre recombinase.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר טרנספקציית mRNA יעילה, לא רעילה ולא אימונוגנית במקרופאגים ראשוניים.
- הוא מסייע למחקרים מולקולריים על ידי מתן אפשרות לביטוי של חלבונים אקסוגניים, מוטטים או מתויגים.
- השיטה מקדמת את ניתוח תפקודי המקרופאג ברמה המולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מניפולציה גנטית יעילה של מקרופאגים ראשוניים מהווה צוואר בקבוק ממושך במחקר ופיתוח בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה של התא, בשל עמידותם המולדת להחדרה של חומצות גרעיניות. פרוטוקול זה מאפשר טרנספקציה של mRNA ביעילות גבוהה ובאופן שאינו אימונוגני במקרופאגים ראשוניים של עכברים, ובכך תומך באופן ישיר במחקרים מכניסטיים ובתיקוף מטרות במודלים חיסוניים רלוונטיים למחלה. גישה זו משפרת את רמת הוודאות החזויה בממשק שבין שלבי הגילוי למחקרים פרה-קליניים, ומאפשרת חקירה תפקודית רחבה של ביולוגיית המקרופאגים לצורך קבלת החלטות לגבי תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ביטוי פונקציונלי של חלבונים מוטפים או מסומנים במקרופאגים ראשוניים לצורך חקירת מסלולים ביולוגיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה ישירה של רכיבי השהייה באותות של תאי מערכת החיסון.
- מקל על תיקוף מטרות במערכות מקרופאגים רלוונטיות פיזיולוגית, ללא הפרעה של ציטוטוקסיות או הפעלה חיסונית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות מאקרופגים ראשוניות עוברות תיקוף לסריקה המשכית של תפקוד גנים או מודולציה של מסלולים.
- מספק שיעורי טרנספקציה כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולמחקרים השוואתיים.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות ביטוי גנים בתאי מערכת חיסון ראשוניים, ובכך תומך בפיתוח בדיקות ניתנות להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים חיסוניים הרלוונטיים למחלה על ידי אפשור מניפולציה גנטית במקרופאגים ראשוניים.
- תומך בהמשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית.
- מפחית את הסיכון לממצאים ארטיפקטואליים הנובעים מקווי תאים שאינם פיזיולוגיים או מארטיפקטים של הפעלה חיסונית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומאפשר בדיקת היפותזות והפחתת סיכונים מכניסטיים בתאי חיסון ראשוניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך במניפולציה מונחית-השערה של מסלולי איתות במקרופאגים ותפקוד גנים.
- סריקה: מספק פלטי טרנספקציה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות לבדיקה ואנליטיקה השוואתית.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של יעילות הטרנספקציה וביטוי חלבונים באמצעות ציטומטריה זרימה, מיקרוסקופיה ו-immunoblotting.
- מחקר תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה באמצעות שימוש במקרופאגים ראשוניים, ובכך תומך בתיקוף של סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול סטנדרטי ורב-שימושי למניפולציה גנטית במודלים של תאי מערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מספק טרנספקציה סטנדרטית, הניתנת לשחזור וניתנת להרחבה במקרופאגים ראשוניים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אפשור תיקוף יעדים חסון במערכות רלוונטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות טיפוליות למודולציה של מערכת החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA, בתרביות תאים ראשוניות ובטכניקות טרנספקציה.
- נדרשת גישה לערכות שעתוק RNA, למערכות טיהור ולמכשירים אנליטיים (למשל, flow cytometry, מיקרוסקופיה).
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי תאי חיסון ראשוניים אחרים או עבור מינים אחרים.
- יש לאמת באופן אמפירי את היעילות ואת העדר האימוגניות עבור כל מבנה (construct) או מקור תאים חדש.
