כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני
November 16th, 2019
מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.
המטרה העיקרית של כתב יד זה היא להציג הליך הדמיה של מיקרוסקופיה TIRF מבוססת שבב פוטונית שפותחה לאחרונה ומיקרוסקופיה לוקליזציה של מולקולה אחת, כגון dSTORM. המרכיב העיקרי כאן הוא השבב הפוטוני כי הם עשויים מסדרה של waveguide אופטי. האור בתוך הגל האופטי מונחה על סמך השתקפות פנימית מוחלטת.
חלק מהאור קיים על פני השטח בצורה של הגלים האוונסנטים. הגלים האוונסנטים האלה, הם נרקבים באופן אקספוננציאלי מפני השטח, עם עומק חדירה של כמה מאות ננומטרים. זה הופך אותם מתאימים לתאורת TIRF.
תאורת TIRF באמצעות הגל האופטי זמינה על פני שטח גדול במיוחד, המוגדר על ידי הגיאומטריה של waveguide, ולכן מתאים באופן אידיאלי להדמיית תפוקה גבוהה. ההבדל העיקרי בין הגדרת TIRF ו- dSTORM מסורתית בהשוואה לגישה שלנו הוא שאנו משתמשים בשבב פוטוני כדי להאיר את המדגם, במקום לשלוח אור דרך עדשה אובייקטיבית הדמיה. הגישה שלנו מפענחת את התאורה ואת חלק האור הקולקציה, פותחת אפשרויות הדמיה חדשות.
מניחים את השבב בצלחת פטרי זכוכית באמצעות פינצטה וופל, ומכסים לחלוטין עם פתרון 1% Hellmanex. מניחים את צלחת פטרי על לוחית חמה ב 70 מעלות במשך 10 דקות. בעוד עדיין על המשטח החם, לשפשף את פני השטח עם ספוגית רקמת חדר נקי.
מוציאים את השבב מצלחת פטרי. יש לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של מים מיונים. לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של isopropanol, דואג כי הממס אינו מתייבש על פני השטח כדי למנוע כתמי אידוי.
יש לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של מים מיונים. לפוצץ את השבב יבש עם אקדח חנקן. הכינו PDMS מאוחר יותר של 150 מיקרומטר על ידי סיבובו בצלחת פטרי.
השתמש אזמל לחתוך מסגרת כ 1.5 על 1.5 ס"מ משכבת PDMS. הרם את המסגרת מצלחת פטרי עם פינצטה. הפקידו אותו שטוח על שבב נקי ומלוטש.
הדגימה מוכנה כעת לזרועי תאים. לאחר זריעת התא, הסר את השבב מהמדיה. השתמש בצינור כדי להסיר נוזל עודף מחוץ לתא PDMS.
הסר את הנוזל הנוכחי מתוך תא PDMS עם צינור תוך הוספת כ 60 microliters לנקות PBS באותו זמן. החלף את PBS עם 60 microliters לנקות PBS, ולתת לו דגירה במשך דקה אחת. חזור על השלב הקודם, ומאפשר לו לדגר במשך חמש דקות הפעם.
הסר את PBS, ולהחליף אותו עם 60 microliters של פתרון הצבע. השאירו את הדגימה כדי דגירה במשך כ 15 דקות, מגן אותו מפני אור. לשטוף את המדגם עם PBS באמצעות ההליך שתואר קודם לכן.
הסר את ה- PBS והחלף אותו ב- 40 מיקרוליטרים של מאגר ההדמיה בו-זמנית. מניחים כיסוי על גבי, מניעת בועות אוויר להיווצר מתחת. לחץ בעדינות על הכיסוי כנגד תא ההדמיה כדי להסיר כל מדיה עודפת.
השתמש בצינור כדי להסיר מדיה עודפת מחוץ לכיסוי. נקו את האזור שמחוץ לכיסוי בעזרת ספוגית לחה במים כדי להימנע מקריסטלים שנוצרו על ידי שאריות מדיה מיובשות. גירסה זו של ההתקנה מורכבת משלושה רכיבים עיקריים.
המיקרוסקופ עם מחזיק המסנן, מקור האור הלבן, המצלמה ואקדח אובייקטיבי. שלב הצימוד, שהוא שלב פייזו תלת-צירי, עם לייזר מזוג סיבים ועדשת צימוד. שלב הדגימה, שהוא שלב ידני חד-צירי, עם קצה והטיה, עם מחזיק ואקום.
הן שלב הצימוד והן שלב הדגימה מותקנים על במה ממונעת דו-צירית לתרגום לדוגמה. מניחים את השבב על משאית הוואקום, עם היבט הצימוד לכיוון מטרת הצימוד. ודא השבב הוא כ אורך מוקד אחד מן המטרה צימוד.
תפעיל את משאבת הוואקום. הפעל את הלייזר למילי וואט אחד. התאימו בערך את גובה השבב כך שהקרן תפגע בקצהו.
כבה את הלייזר. הפעל את מקור האור הלבן. בחר עדשת מטרה להגדלה נמוכה, לדוגמה, 10x.
מקד את המיקרוסקופ על גל. תרגם את המיקרוסקופ לאורך הגל כדי לראות אם הוא מיושר היטב עם הנתיב האופטי. הזיזו את המיקרוסקופ לקצה הצימוד.
הפעל את הלייזר במילי וואט אחד או פחות. תרגם את המיקרוסקופ לאורך קצה הצימוד כדי למצוא את אור הלייזר. תמקד את הקרן בקצה השבב.
כוונן את שלב הצימוד לאורך הנתיב האופטי בכיוון המקטין את גודל נקודת קרן הלייזר עד שהוא נעלם. הקרן נמצאת כעת מעל או מתחת לפני השטח של השבב. כוונן את גובה שלב הצימוד עד שמקום הקרן יופיע שוב ויגדל.
חזור על שני השלבים הקודמים עד שהלייזר יוצר נקודה ממוקדת. העבר את הנקודה הממוקדת לגל ההתעניינות. תרגם את המיקרוסקופ במרחק קצר מהקצה כך שמקום הקרן הממוקד לא יהיה גלוי עוד.
כבה את האור הלבן. התאם את החדות. אם הגל מנחה, האור המפוזר לאורך הגל צריך להיות גלוי בבירור.
התאימו את ציר שלב הצימוד כדי למקסם את עוצמת האור המפוזרת. כבה את הלייזר. תדליק את האור הלבן.
התאם את החדות במידת הצורך. נווט אל אזור הדימות. פוקוס עם המטרה הרצויה לדמיין.
כבה את האור הלבן. הכנס את מסנן הפלואורסצנטיות והפוך את כוח הלייזר למילי-וואט אחד. הגדר את זמן החשיפה למצלמה לכ- 100 אלפיות שניה.
התאם את החדות לפי הצורך. ודא שההתדוג עדיין ממוטב. אתר אזור מעניין להדמיה.
הפעל את לולאת שלב הפיזו כדי לממוצע צמתים. לכוד לפחות 300 תמונות. טען את מחסנית התמונות שנלכדה לפיג'י באמצעות מחסנית וירטואלית.
מתפריט התמונה בפיג'י, בחר ערימות ו- Z Project. חשב את תמונת TIRF על-ידי בחירה בסוג הקרנה, בעוצמה ממוצעת. הפעל את הלייזר למילי-וואט אחד והגדר את זמן החשיפה למצלמה ל- 30 אלפיות שניה.
התאם את החדות והמיקוד. הגדל את כוח הלייזר עד מהבהב הוא ציין. הגדל אזור קטן של הדוגמה.
התאם את החדות. לכוד כמה תמונות כדי לראות אם ההבהובים מופרדים היטב. כוונן את זמן החשיפה למצלמה להבהוב אופטימלי.
הפעל את לולאת הבמה של הפיזו. הקלט ערימת תמונות של 30,000 מסגרות לפחות, בהתאם לצפיפות המהבהבה. פתח את פיג'י וטען את מחסנית dSTORM כתמונות וירטואליות.
התאם את החדות במידת הצורך. השתמש בכלי המלבן כדי לבחור את האזור שברצונך לבנות מחדש. פתח את ניתוח Run בתוסף ThunderSTORM בפיג'י.
קבעו את הגדרות המצלמה הבסיסיות ב-ThunderSTORM, המתאימות למכשיר שלכם. פרמטרי ברירת המחדל הנותרים הם בדרך כלל משביעי רצון. תתחיל את השחזור.
רשימת ההתאמה לוקליזציה המסופקת על-ידי תוכנת השחזור מסוננת כדי להסיר לוקליזציה לא ספציפית. תיקון דריפט נוסף מוחל במידת הצורך. ההבדל העיקרי בין הדמיה מבוססת שבב לבין הדמיה מסורתית הוא המכשור ורכישת הנתונים.
לפיכך, ניתן להעריך את איכות התמונות המשוחזרות באותו אופן כמו תמונה ממיקרוסקופ מסחרי ברזולוציית-על. מאז נעשה שימוש ברוגידים מרובי מצבים, התמונה המתקבלת עשויה, עם זאת, להפגין בעירור לא אנושי אם נאספות מעט מדי תמונות. אפשרות זו מוצגת בלוח א'.
הגדלת כמות דפוסי העירור אמורה לגרום לזרזר inhomogeneous, כפי שמוצג בלוח b. כאן יש לנו תא אנדותל סינוזואידי כבד, עם קרום פלזמה שכותרתו פלואורסצנטי. חלוניות a ו- b הן תמונות מוגבלות בעיוון.
חלונית c מציגה תמונה מוגבלת דיפוזיה של ההצבה בחלונית b. חלונית d מציגה תמונת dSTORM של אותו אזור. תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד יש fenestrations בגודל ננו בקרום הפלזמה שלהם, אשר נראים בבירור בתמונה סופר רזולוציה בפאנל d.
אחד היתרונות העיקריים של הדמיה מבוססת שבב ברזולוציית-על הוא שדה הצפייה הגדול שניתן להשגה. פאנל a מראה 500 מיקרון על ידי 500 מיקרון גדול dSTORM תמונה של תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד עם microtubulin שכותרתו פלואורסצנטי. חלונית b מציגה את ערכת ה- magenta מהחלונית a, עם תמונות עם רזולוציית דיפוזיה מוגבלת ותמונות ברזולוציית-על להשוואה.
לוח c מציג את ההסטה הירוקה מהחלונית a. הרזולוציה של התמונה שנתפסה היא 77 ננומטר. בסרטון זה, ביצענו שדה גדול של תצוגה TIRF ו dSTORM הדמיה של תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד באמצעות שבב פוטוני להארה.
השיטה שלנו פחות מורכבת, קומפקטית וגמישה יותר מהדרך המקובלת לביצוע TIRF באמצעות מטרת מיקרוסקופ של צמצם מספרי קבוע מראש ושדה תצוגה נמוך. מיקרוסקופ לוקליזציה, כגון dSTORM, היא אחת מכמה טכניקות הדמיה ברזולוציית-על שחקרנו באמצעות שבב פוטוני. לדוגמה, אור יכול להיות מוגבל הרבה יותר בחוזקה בתוך חומר גל אופטי אינדקס שבירה גבוהה מאשר זה אפשרי באמצעות עדשה אובייקטיבית הדמיה.
מאפיין זה של תאורת שבבים מצא יישום בהגברת הרזולוציה של שיטת מיקרוסקופיה אופטית מבוססת תנודות אינטנסיביות ומיקרוסקופיה מובנית של תאורה. בנוסף, שבבים פוטוני גם נהנה מזעור, עלות תועלת, התקנה אופטית פשוטה. להיות טכנולוגיה משולבת עושה את זה תואם עם פונקציות אופטיות אחרות על השבב.
בסך הכל, זה מאפשר retrofitting לתוך מיקרוסקופים מוגבלים diffraction קונבנציונאלי, המאפשר רזולוציה סופר על חשבון נמוך.
סקירה
מאמר זה מציג טכניקת מיקרוסקופיה אופטית מבוססת שבבים חדשנית עם רזולוציה-על, המתמקדת במיקרוסקופיית TIRF ומיקרוסקופיית מיקום מולקולות בודדות. הפרוטוקולים להכנת השבב ולצילום מפורטים, תוך הדגשת היתרונות של גישה זו בעלות וביעילות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
- צילום ברזולוציה-על
- טכנולוגיית שבבי פוטוניקה
רקע
- מיקרוסקופיית TIRF מסורתית מסתמכת על תאורת עדשת אובייקטיב.
- שבבים פוטוניים משתמשים בהדרכת גלים אופטיים להובלת האור.
- גלי אוונסנט מאפשרים צילום ברזולוציה גבוהה ברמת המשטח.
- שיטה זו משפרת את אזור הצילום והתפוקה.
מטרת המחקר
- להדגים הליך צילום חדש באמצעות מיקרוסקופיית TIRF מבוססת שבב פוטוני.
- להשוות שיטות מסורתיות עם הגישה מבוססת השבב.
- לספק פרוטוקולים מפורטים להכנת השבב ולצילום.
שיטות ששימשו
- הכנת שבבי פוטוני באמצעות הדרכת גלים אופטיים.
- פרוטוקולים של זריעת תאים ודגירה להכנת הדגימה.
- מתקן צילום הכולל מיקרוסקופ, לייזר ומצלמה.
- לכידת תמונות ועיבוד באמצעות תוכנת Fiji.
תוצאות עיקריות
- הוכחה מוצלחת של יכולות צילום בתפוקה גבוהה.
- נראות ברורה של אור מפוזר לאורך ההדרכה.
- מיקום יעיל של מולקולות בודדות באמצעות המתקן החדש.
- רזולוציית צילום משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- הגישה מבוססת השבב מציעה יתרונות משמעותיים במיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- הפרדה בין תאורה לאיסוף משפרת את אפשרויות הצילום.
- שיטה זו סוללת את הדרך לפיתוחים עתידיים במיקרוסקופיית רזולוציה-על.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Chip-based nanoscopy decouples excitation and collection pathways, enabling large field-of-view TIRF imaging with low magnification optics. This approach supports high-throughput super-resolution imaging while maintaining resolution comparable to traditional methods, addressing discovery-stage bottlenecks in target validation and phenotypic screening. The technique enhances predictive confidence by providing quantitative, reproducible subcellular imaging data across scalable sample areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular structures like liver sinusoidal endothelial cell fenestrations and plasma membrane organization at 76 nm resolution.
- Operational Value: Decoupled illumination and collection allow use of low magnification lenses, increasing field of view for population-level target engagement analysis.
- Predictive Value: Large-area dSTORM imaging supports statistical robustness in target localization and heterogeneity assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uniform evanescent wave excitation across waveguide-defined areas enables consistent single-molecule localization for assay readouts.
- Operational Value: Compatibility with standard microscopes and on-chip integration supports assay standardization and reuse across discovery campaigns.
- Scalability: Demonstrated 500 µm x 500 µm imaging area enables multiplexed condition testing in a single acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Disease-relevant LSEC imaging validates applicability to endothelial pathophysiology models.
- Mechanistic De-risking: Super-resolution visualization of nano-scale membrane features aids in understanding drug-target spatial relationships.
- Preclinical Alignment: Resolution and throughput support biomarker localization studies in primary or stem-cell-derived systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification workflows, providing super-resolution readouts that inform target confidence and assay reproducibility prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of target localization and clustering in native membrane environments.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, high-density localization data from large sample regions.
- Analytics: Generates filtered localization lists and drift-corrected reconstructions for objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through imaging of disease-relevant cellular ultrastructure in primary cell models.
- Enterprise Reuse: Photonic chip infrastructure can be retained across projects, reducing retooling costs for super-resolution capable imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanoscale resolution of membrane protein organization and dynamics.
- Operational Value: Standardized chip preparation and imaging protocol ensures reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on subcellular target distribution data, reducing late-stage attrition from mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets supported by super-resolution spatial evidence in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Expertise in photonic chip handling, fluorescence microscopy, and single-molecule localization analysis required.
- Instrumentation includes laser source, piezo stage, vacuum holder, and fluorescence filter set compatible with TIRF and dSTORM.
- Cross-team standardization needs include chip cleaning procedures, PDMS chamber fabrication, and Fiji/ThunderSTORM analysis pipelines.
- Adaptation considerations involve optimizing excitation patterns for homogeneous illumination across different waveguide geometries and sample types.
- Practical limitations include potential inhomogeneous excitation with insufficient pattern averaging and minor resolution trade-off versus high-NA objective TIRF.
