ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ליישם מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטי מגודר בזמן, או FLIM, בזרימת עבודה אוטומטית מרובת בארות באמצעות תוכנת קוד פתוח ומכשור בסיסי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו על קריאות מבוססות FLIM בסדרה של תאים קבועים או חיים. וזה שימושי במיוחד לקריאת עיבוד אותות תאים או אינטראקציות חלבון.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם ש-FLIM מספק קריאות כמותיות חזקות ויכול לספק חלק אוכלוסיית אינטראקציה במדידה אחת. יישום טכניקות ניתוח גלובליות על אלפי תאים על פני מאות שדות ראייה, מאפשר לנו להשתמש בהעברת אנרגיית שרף אומנה, או קריאות FRET. וניצול, למשל, שינויים לאורך החיים עד כ-20 פיקו-שניות.

ידגימו את ההליך עם פרדריק גורליץ סוניל קומאר, עמית המחקר שלנו ואיאן מונרו, מפתח התוכנה שלנו. התחל בהפעלת המיקרו-מנהל ופתח את התוסף openFLIM-HCA. תחת הכרטיסייה בקרת FLIM, בחר קובץ כיול תיבת עיכוב ופתח את קבצי הכיול.

בחר את הכיול file עבור השילוב הספציפי של יחידת מחולל העיכוב ושיעור החזרה על הלייזר. תחת תפריט הקובץ, בחר הגדר תיקיית בסיס ובחר את התיקיה שבה יישמרו הנתונים. לאחר אישור שכל הפרמטרים המתאימים הוגדרו, הגדר ידנית רוחב שער של ארבע ננו-שניות בתיבת הבקרה של המגבר האופטי המגודר עבור כל הניסוי.

כדי לרכוש נתוני תמונה של פונקציית תגובת המכשיר, הנח ידנית בלוק קרן בקלטת קוביית המסנן לפני המטרה כדי למנוע בריחה של אור לייזר כלשהו וזווית את בלוק הקרן כדי למזער כל השתקפות בחזרה למסגרת המיקרוסקופ. תחת לשונית בקרת נתיב האור, הגדר את מסנני העירור, הדיכרואי והפליטה ביחידת הדיסק המסתובב, כך שניתן יהיה לדמות את חלק אור העירור המפוזר מדיסק Nipkow המסתובב מבלי להרוות את המערכת למשך זמן שילוב מצלמה של 200 אלפיות השנייה לפחות. תחת לשונית הבקרה FLIM, השתמש בפונקציית מציאת הנקודה המקסימלית על פני כל התחום של העיכובים המכוסים על ידי תיבת ההשהיה המהירה הניתנת-לתכנות.

לאחר מכן בדוק את מעקב הפלט המוצג. והגדר את זמני העיכוב של המסלול, כך שפרופיל פונקציית תגובת המכשיר המלא, יהיה בטווח הסריקה של תיבת ההשהיה המהירה. התאם את פרמטרי הצפיפות הנייטרלית וזמן החשיפה.

כמו גם הצטברות המסגרת, כך שהמצלמה לא רוויה בשער זמן הבהירות וזמן האינטגרציה האפקטיבי הוא לא פחות מ -200 אלפיות השנייה. תחת תפריט הבקרה של FLIM, בחר תיבת עיכוב מהיר והגדר שלבי עיכוב של 25 פיקו-שניות על פני טווח ההשהיה המלא. לאחר מכן, בחר עיכובים מאכלסים ולחץ על הצמד תמונת FLIM כדי לקבל תמונת פונקציית תגובת מכשיר.

והמתן עד להשלמת הרכישה. תחת תפריט הבקרה של נתיב האור, בחר צפיפות ניטרלית ולחץ על חסום כדי לחסום את הלייזר. פתח את תפריט הבקרה FLIM ובחר תיבת השהיה מהירה כדי להפחית את מספר שלבי ההשהיה על-ידי הגדלת הערך בתיבת ההפרש הקבוע

לאחר מכן לחץ על Snap FLIM image כדי לקבל תמונת מצלמת רקע. כדי לרכוש נתוני תבנית התייחסות, עבור ללשונית הבקרה XYZ והזן את באר H4 בתיבת הדו-שיח Go to well. לאחר מכן, עבור ללשונית הבקרה של נתיב האור ובחר את מסנני העירור, הדיכרואיקון והפליטה המתאימים להדמיית החלבון הפלואורסצנטי M טורקיז באמצעות פונקציית נקודת המקסימום של מציאת הטווח המלא של תיבת ההשהיה המהירה.

לאחר מכן הגדר את הפרמטרים המתאימים להשגת נתוני תבנית הייחוס ותמונת רקע מתאימה כפי שהודגם זה עתה. כדי לרכוש את נתוני ה-FLIM מדגימת צלחת מרובת בארות, עבור לתפריט הרכישה ברצף HCA להגדרה. בחר בכרטיסייה מיקומי XYZ והגדר אילו בארות יש לצלם ואת מספר שדות הראייה שיש לרכוש לכל באר.

בחר שדה ראייה מייצג המכיל את הדגימה שיש לצלם והגדר את מסנן הצפיפות הנייטרלית האופטימלי בזמן האינטגרציה של המצלמה כדי להגיע ל-75% מהטווח הדינמי של מצלמת הקריאה. תחת הכרטיסייה בקרת XYZ, בחר החזר את בקרת המיקוד בתיבת הדו-שיח של המיקוד האוטומטי ומקד באופן ידני את המיקרוסקופ בתאים או במבנים המעניינים. הגדר את טווח החיפוש של המיקוד האוטומטי ל-2000 מיקרומטר ולחץ על Enter.

לאחר מכן לחץ על AF כעת כדי להתחיל את הליך המיקוד האוטומטי. ערך היסט יופיע בשדה המיקוד האוטומטי של היסט המיקוד. הזן ערך היסט זה בחלון היסט המיקוד האוטומטי ולחץ על AF כעת פעמיים כדי לחזור על הליך המיקוד האוטומטי.

כעת יש להגדיר ערכי היסט לאפס, מה שמעיד על תפקוד נכון של מערכת המיקוד האוטומטי. לאחר מכן, תחת לשונית הבקרה FLIM, בחר את פונקציית האוטוgating כדי להבטיח דגימה לוגריתמית של נקודות העיכוב. הגדר מסגרות צבירה לערך שמניב את זמן רכישת הנתונים הכולל הרצוי.

לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח רכישת FLIM, לחץ על כפתור התחל רצף HCA כדי להפעיל את רכישת צלחת הבאר המרובה של FLIM ולרכוש תמונת מצלמת רקע כפי שהודגם זה עתה. כאן מוצגת בדיקת FLIM מייצגת המשתמשת במערכת המודל המתבטאת בתאי קו-תאים ובצלחת מרובת בארות, עם דוגמאות לתמונות אורך החיים הקרינה הנרכשות אוטומטית של שדות ראייה טיפוסיים הנראים בכל באר. בניסוי זה בארות הבקרה השליליות הציגו את תוחלת החיים הארוכה ביותר, ותקופות החיים של התורמים הציגו את מבני השריגים הנמוכים ביותר עם אורכי הקישור הקצרים ביותר.

בסך הכל, אורך החיים הממוצע על פני כל שדות הראייה בכל באר השתנה על פני לוחות הבארות המרובים. ממוצע פרופיל הדעיכה של עוצמת הקרינה של התורם על פני כל התאים המצולמים בבאר A1 יחד עם ההתאמה למודל דעיכה מעריכי מונו ופונקציית תגובת המכשיר, ממחיש כי מודל ההתאמה תקף. ניתוח נוסף של אורך החיים הקרינה הממוצע עבור כל עמודה של לוח הבארות הרב, המתקבל מהתאמה מעריכית מונו חכמה בפיקסלים, מדגים את ירידת אורך החיים במבני השריגים עם אורכי קישור קצרים יותר, המדמה ניסוי עם יעילות שריגים שונה.

בניסוי זה, נתוני ה-FLIM של בדיקת שריג של פעולתם של מעכבים שונים על אוליגומריזציה של חלבונים הותאמו למודל דעיכה מעריכי יחיד. מפת אורך החיים הקרינה ממחישה את אורך החיים הממוצע לבאר בממוצע על פני שמונה שדות ראייה. סט אחד קטן, המדמה ארבעה שדה ראייה לכל באר, בעוד שניתן להשלים את בדיקת ה-FLIM שלנו תוך כשעתיים וחצי, כולל הזמן לרכישת פונקציית תגובת המכשיר, נתוני הייחוס והפעלת הניתוח בהתאמה ל-FLIM.

בעת ביצוע בדיקת FLIM חשוב לזכור לרכוש את פונקציית תגובת המכשיר ולהתייחס לנתוני תבנית יחד עם תמונות הרקע שלהם כך שיהיה לך את כל המידע הדרוש לניתוח נתוני FLIM. באמצעות תוכנת הקוד הפתוח שלנו, FLIM fit, ניתן גם להתאים את הנתונים הללו למודלים מורכבים יותר של דעיכה. לדוגמה, מתן אפשרות לקביעת חלק אוכלוסיית הפריט.

טכנולוגיית FLIM HCA שלנו מסייעת לחוקרים בקהילת גילוי התרופות לבצע מדידות חזקות של פריטים. בעתיד אנו מקווים שטכנולוגיה זו תאפשר למדוד קבועי דיסוציאציה במבחנים מבוססי תאים. אנו מקווים שמאמר וידאו זה, כמו גם המידע בוויקי שלנו, יעזור לחוקרים אחרים לבנות מכשור FLIM HCA משלהם וליישם אותו על שריגים ועל מבחנים אחרים.

אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון סגירת כל קרני הלייזר בעת שימוש במכשור כזה.