ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים כיצד ליישם מיקרוסקופיית דימות של זמן חיים של פלואורסצנציה עם שער זמן, או FLIM, במסגרת זרימת עבודה אוטומטית של פלטות רב-בארים באמצעות תוכנה בקוד פתוח ומיכשור בסיסי. ניתן להחיל מתודולוגיה זו על קריאות מבוססות FLIM בסדרה של תאים מקובעים או תאים חיים. היא שימושית במיוחד לקריאת עיבוד אותות בתאים או אינטראקציות בין חלבונים.

היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם ש-FLIM מספקת קריאות כמותיות חסונות ויכולה לספק את חלק אוכלוסיית האינטראקציה במדידה אחת. יישום טכניקות של ניתוח גלובלי על אלפי תאים במאות שדות ראייה, מאפשר לנו להשתמש בקריאות של העברת אנרגיה בין פורספורים, או FRET. וכן לנצל, למשל, שינויים בזמן חיים עד לכ-20 picoseconds.

את הפרוצדורה ידגימו יחד עם Frederik Gorlitz, ה-Sunil Kumar, עמית המחקר שלנו ו-Ian Munro, מפתח התוכנה שלנו. התחילו בהפעלת ה-micromanager ופתחו את תוסף ה-openFLIM-HCA. תחת לשונית בקרת ה-FLIM, בחרו ב-delay box calibration file ופתחו את קבצי הכיול.

בחרו את קובץ הכיול עבור השילוב הספציפי של יחידת מחולל ההשהיה (delay generator) וקצב החזרת הלייזר הרלוונטי. בתפריט הקבצים, בחרו "הגדר תיקיית בסיס" (set base folder) ובחרו את התיקייה שבה יישמרו הנתונים. לאחר אישור שכל הפרמטרים המתאימים הוגדרו, הגדירו ידנית רוחב שער (gate width) של ארבעה ננו-שניות בתיבת הבקרה של המגבר האופטי בעל השער (gated optical intensifier) עבור הניסוי כולו.

כדי לרכוש נתוני תמונה של פונקציית התגובה של המכשיר, מקמו ידנית חסם קרן (beam block) בקסטת קוביית המסננים לפני העדשה כדי למנוע דליפה של אור לייזר, והטו את חסם הקרן כדי למזער השתקפויות חזרה למסגרת המיקרוסקופ. תחת לשונית בקרת נתיב האור, הגדירו את מסנני העירור, הדיכרואיים והפליטה ביחידת הדיסק המסתובב, כך שניתן יהיה לצלם את חלק אור העירור המפוזר מהדיסק המסתובב של Nipkow מבלי להוביל לרוויה של המערכת למשך זמן אינטגרציה של המצלמה של לפחות 200 milliseconds. תחת לשונית בקרת FLIM, השתמשו בפונקציית Find max point על פני מלוא טווח ההשהיות המכוסה על ידי קופסת ההשהיה המהירה התכנית.

לאחר מכן, בדוק את עקומת הפלט המוצגת. קבע את זמני השהיית המסלול, כך שפרופיל פונקציית התגובה המלאה של המכשיר יהיה בתוך טווח הסריקה של תיבת ההשהיה המהירה. כוונן את פרמטרי הצפיפות הניטרלית ואת זמן החשיפה.

בדומה לצבירת הפריימים, כך שהמצלמה לא תהיה רוויה בזמן שער הבהירות וזמן האינטגרציה האפקטיבי לא יהיה קצר מ-200 milliseconds. תחת תפריט הבקרה של ה-FLIM, בחרו בתיבת ההשהיה המהירה (fast delay box) והגדירו מדרגות השהיה של 25 picoseconds לכל טווח ההשהיה. לאחר מכן, בחרו באפשרות populate delays ולחצו על snap FLIM image כדי לרכוש תמונת פונקציית תגובת מכשיר (instrument response function image).

המתינו עד להשלמת הרכישה. בתפריט בקרת נתיב האור, בחרו ב-neutral density ולחצו על blocked כדי לחסום את הלייזר. פתחו את תפריט הבקרה של ה-FLIM ובחרו ב-fast delay box כדי להפחית את מספר שלבי ההשהיה על ידי הגדלת הערך בתיבת ה-increment.

לאחר מכן, לחצו על snap FLIM image כדי לרכוש תמונת רקע של המצלמה. כדי לרכוש נתוני צבע ייחוס, עברו ללשונית בקרת XYZ והזינו את באר H4 בתיבת הדיאלוג go to well. לאחר מכן, עברו ללשונית בקרת נתיב האור ובחרו את מסנני העירור, הדיכרואיים והפליטה המתאימים לדימוי של החלבון הפלואורסצנטי M turquoise באמצעות פונקציית find max point על פני כל הטווח של תיבת ה-fast delay.

לאחר מכן, הגדירו את הפרמטרים המתאימים לרכישת נתוני צבע הייחוס ותמונת רקע תואמת, כפי שהודגם זה עתה. כדי לרכוש נתוני FLIM מדגימה בלוחית רב-בארים, עברו לתפריט הגדרות הרכישה הרצפית של ה-HCA. בחרו בלשונית מיקומי XYZ והגדירו אילו בארים יש לצלם ואת מספר שדות הראייה שירוכשו לכל באר.

בחר שדה ראייה מייצג המכיל את הדגימה לצילום, והגדר את מסנן הצפיפות הניטרלית (neutral density filter) האופטימלי בזמן האינטגרציה של המצלמה כדי להגיע ל-75% מהטווח הדינמי של מצלמת הקריאה. תחת לשונית בקרת ה-XYZ, בחר בבקרת החזרת המיקוד (return focus control) בתיבת הדיאלוג של המיקוד האוטומטי, ובצע מיקוד ידני של המיקרוסקופ על התאים או המבנים הרלוונטיים. הגדר את טווח החיפוש של המיקוד האוטומטי ל-2000 micrometers ולחץ על enter.

לאחר מכן לחצו על AF now כדי להתחיל את הליך המיקוד האוטומטי. ערך היסט (offset) יופיע בשדה focus offset auto focus. הזינו ערך היסט זה לחלון AF offset, ולחצו על AF now פעמיים כדי לחזור על הליך המיקוד האוטומטי.

ערכי ההיסט (Offset) צריכים להיות כעת מכוונים לאפס, דבר המעיד על פעולה תקינה של מערכת המיקוד האוטומטי. לאחר מכן, תחת לשונית הבקרה של ה-FLIM, בחרו בפונקציית ה-autogating כדי להבטיח דגימה לוגריתמית של נקודות השהיה. הגדירו את מספר הפריימים לצבירה (accumulate frames) לערך שייתן את זמן רכישת הנתונים הכולל הרצוי.

לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח של רכישת ה-FLIM, לחצו על כפתור התחלת רצף ה-HCA כדי להפעיל את רכישת ה-FLIM עבור פלטת רב-בארים ולרכוש תמונת רקע מהמצלמה כפי שהודגם זה עתה. כאן מוצגת בדיקת FLIM FRET מייצגת המשתמשת במערכת FRET מודלית המבואעת בתאי-co ובפלטת רב-בארים, עם דוגמאות של תמונות זמן חיים של פלואורסצנציה שנרכשו באופן אוטומטי משדות ראייה טיפוסיים הנראים בכל באר. בניסוי זה, בארי השליטה השלילית הציגו את זמני החיים הארוכים ביותר, וזמני החיים של התור הראו את מבני ה-FRET הנמוכים ביותר עם אורכי המקשרים הקצרים ביותר.

באופן כללי, ממוצע זמן המחייה הממוצע על פני כל שדות הראייה בכל באר השתנה בין פלטות הריבוי. מיצע פרופיל דעיכת עוצמת הפלואורסצנציה של התורם על פני כל התאים שדוממו בבאר A1, יחד עם התאמה למודל דעיכה מונו-אקספוננציאלית ולפונקציית התגובה של המכשיר, ממחיש כי מודל ההתאמה תקף. ניתוח נוסף של ממוצע זמן המחייה הפלואורסצנצי לכל עמודה בפלטת הריבוי, שהתקבל מהתאמה מונו-אקספוננציאלית ברמת הפיקסל, מדגים כי זמן המחייה קצר יותר במבני ה-fret עם אורכי מקשר קצרים יותר, ובכך מדמה ניסוי עם יעילויות fret שונות.

בניסוי זה, נתוני ה-FLIM של בדיקת FRET לפעולתם של מעכבים שונים על אוליגומריזציה של חלבונים הותאמו למודל דעיכה אקספוננציאלית יחידה. מפת הלוח של זמן חיי הפלואורסצנציה ממחישה את זמן החיים הממוצע לבאר, ממוצע על פני שמונה שדות ראייה. סט קטן אחד, המדמיע ארבעה שדות ראייה לבאר, בעוד שבדיקת ה-FLIM שלנו יכולה להסתיים בערך תוך שעתיים וחצי, כולל הזמן לדגימת פונקציית התגובה של המכשיר, נתוני דיי הייחוס והרצת הניתוח ב-FLIM fit.

בעת ביצוע בדיקת FLIM, חשוב לזכור לרכוש את פונקציית התגובה של המכשיר (instrument response function) ואת נתוני הסמן (reference die) יחד עם תמונות הרקע שלהם, כדי שיהיה בידיכם את כל המידע הדרוש לניתוח נתוני ה-FLIM. באמצעות התוכנה בקוד פתוח שלנו, FLIM fit, ניתן גם להתאים נתונים אלו למודלי דעיכה מורכבים יותר. לדוגמה, דבר זה מאפשר את קביעת חלק אוכלוסיית ה-fret.

טכנולוגיית ה-FLIM HCA שלנו מסייעת לחוקרים בקהילת גילוי התרופות לבצע מדידות חסונות של fret. בעתיד אנו מקווים שטכנולוגיה זו תאפשר מדידה של קבועי דיסוציאציה בבדיקות מבוססות תאים. אנו מקווים שמאמר וידאו זה וכן המידע ב-Wiki שלנו יעזרו לחוקרים אחרים לבנות מכשור FLIM HCA משלהם ולהחיל אותו על fret ועל בדיקות אחרות.

אין לשכוח כי עבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון בידוד של כל קרני הלייזר, בעת שימוש במכשור זה.